Abstract
El uso generalizado de la Next Generation Sequencing ha abierto nuevas vías para la investigación y el diagnóstico de cáncer. NGS traerá enormes cantidades de nuevos datos sobre el cáncer, y especialmente la genética del cáncer. Los conocimientos actuales y futuros descubrimientos harán necesario estudiar un gran número de genes que podrían estar implicados en la predisposición genética al cáncer. En este sentido, hemos desarrollado un diseño Nextera para estudiar 11 genes completos implicadas en la reparación el daño del ADN. Este protocolo fue desarrollado para estudiar con seguridad 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, y TP53) del promotor de 3'-UTR en 24 pacientes simultáneamente. Este protocolo, basado en la tecnología de transposasa y enriquecimiento gDNA, da una gran ventaja en términos de tiempo para el diagnóstico genético gracias a la muestra de multiplexación. Este protocolo se puede utilizar de manera segura con gDNA sangre.
Introduction
En 2010, cerca de 1,5 millones de personas (fundamentalmente mujeres) desarrollaron cáncer de mama en todo el mundo. Se estima que del 5 al 10% de estos casos eran hereditarios. Hace casi 20 años, BRCA1 y BRCA2 fueron identificados como implicados en la mama hereditario y el cáncer de ovario 1. Desde hace unos 15 años, las regiones de codificación de BRCA1 y BRCA2 han sido secuenciados para determinar la predisposición genética al cáncer de mama y ovario. Las alteraciones en los genes BRCA1 y BRCA2 se detectan en el 10 a 20% de las familias seleccionadas 2 sugieren que el análisis de estas regiones no es suficiente para la detección eficaz. Recientemente, el análisis de las secuencias no codificantes (promotor, intrones, 3-'UTR) de BRCA1 y BRCA2 destacó que las nuevas mutaciones / variantes podrían estar relacionados con un mayor riesgo de cáncer de mama 3-6.
Proteínas BRCA1 y BRCA2 están implicados en la reparación de recombinación homóloga (HHR), que se completa con numerosos socios 7. Mientras que las alteraciones en los genes BRCA1 o BRCA2 inducen defectos en la reparación del ADN, los otros socios también pueden afectar el riesgo de cáncer de seno. Esta hipótesis parece haber sido validada desde BRIP1 8 y 9 PALB2 tener un impacto demostrado sobre el cáncer de cuello de útero y de mama, respectivamente. Además, otros dos genes de susceptibilidad al cáncer de mama "riesgo moderado", ATM y CHEK2, también pueden ser estudiados de forma rutinaria 10.
A raíz de estos estudios, decidimos desarrollar un protocolo para analizar 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 y TP53) en 24 pacientes simultáneamente usando un muy fácil y relativamente protocolo rápido basado en la tecnología de la transposasa, con el enriquecimiento y la secuenciación en un dispositivo de rendimiento medio. Graciasa esta técnica, hemos secuenciado genes completos desde el inicio del promotor hasta el final de 3'-UTR, a excepción de RAP80, para los que no estaba cubierto de una región intrónica de 2500 pb (chr5: 176,381,588-176,390,180). Esto representa un total de aproximadamente 1.000.300 pb estudiado con 2.734 sondas. Por lo general, BRCA1 y BRCA2 exonic secuencias se analizan por secuenciación de Sanger, que necesita 1,5 meses por menos de 20 pacientes. Con el presente protocolo (Figura 1), en el mismo tiempo, se pudieron analizar 11 genes completas para más de 75 pacientes.
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Protocol
1. Evaluación de ADNg (ADN genómico) Rendimiento
- Cuantificar recién extraída gDNA antes de la preparación de la biblioteca. Utilice el método de evaluación del rendimiento fluorométrico cuantificar gDNA intacta (evitar el uso de un espectrofotómetro para la evaluación de rendimiento gDNA). Mida el (260/280 nm) Relación y asegúrese de que está entre 1.8 y 2 NOTA: 50 ng de gDNA se requieren para el experimento.
2. gDNA Enriquecimiento: Día 1, Mañana
- Antes de arrancar
- Desde el equipo de enriquecimiento de ADN (véase la Tabla de Materiales / Equipos), deshielo tampón ADN (TD) y soluciones de enzima ADN (tde1) en el hielo. Por lo menos 30 minutos antes de su uso, llevar cuentas magnéticas de purificación y detener objetivo (ST) de tampón a la temperatura ambiente (TA). Añadir 20 l de muestra gDNA en 2-2,5 ng / l directamente en una placa de 96 pocillos, 1 bien por muestra. IMPORTANTE: Utilice un control positivo para validar el protocolo (muestra con conocida variación de la secuencia).
- Tagmentation
- Mix todos los reactivos bien, invirtiendo 5x, y centrifugar brevemente. A RT, se añaden 25 l de tampón TD a cada pocillo que contenía 50 ng (20 l) de ADNg, y luego 5 l de tampón de tde1. Establecer pipeta para 50 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces.
- Cubrir la placa con una película adhesiva y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C. Luego, coloque la placa en un termociclador (cubierta calentada a 100 ° C) y ejecutar el siguiente programa: 55 ° C durante 5 min y 10 ° C durante un tiempo ilimitado.
- Durante esta incubación, preparar la muestra de hoja con el software Experimento Manager para definir los índices que se utilizarán.
- Tagmentation Purificación
NOTA: Este paso es fundamental. Tenga mucho cuidado.- Compruebe la ausencia de precipitado en perlas magnéticas de purificación y tampón ST. Si precipitados están presentes, calentar soluciones en las manos. Tampón de resuspensión Deshielo (RSB) en hielo.
- A temperatura ambiente, la solución ST vórtice y añadir15 l a cada pocillo de muestra que contiene. Establecer pipeta a 65 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 5 min a TA. Cubrir la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Añadir 52 l de perlas magnéticas de purificación previamente mezcladas en cada pocillo. Establecer pipeta a 117 l, suavemente pipetear todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 10 min a TA. Cubrir la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Retire la película adhesiva. Coloque la placa de 96 pocillos en un soporte magnético durante 2 minutos a RT. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro.
- Preparar una solución fresca de etanol 80% (para 24 muestras, añadir 2 ml de agua destilada a 8 ml de etanol). Retire y deseche el sobrenadante con cuidado de no molestar a los granos.
- Mientras se mantiene la placa en el soporte magnético, añadir 200 l de etanol 80% recién preparada a cada pocillo sin perturbar las perlas y se incuba la placa durante al menos 30 sega temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y repetir este lavado por segunda vez. Asegúrese de que el etanol se ha eliminado. Dejar secar a temperatura ambiente durante 10 min o hasta la completa evaporación de etanol.
- Retirar la placa de la base magnética y añadir 22,5 l de tampón RSB. Establezca la pipeta a 22,5 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético y se incuba durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Transferir suavemente 20 l del sobrenadante en una nueva placa de 96 pocillos.
NOTA: Opcionalmente, determinar el tamaño de las muestras tagmented mediante el uso de un analizador de fragmento. En lugar de los pasos mencionados anteriormente, el uso de alta resolución electroforesis en gel de acrilamida. Los fragmentos deben ser entre 150 pb y 1000 pb.
- 1 st Amplificación por PCR
- Descongele la mezcla maestra de PCR que contiene la polimerasa (LP-PMM), Índice 1 imprimación, y el Índice de 2 soluciones de imprimación sobre hielo. Coincidir con la combinación oíndices f con la hoja de muestra Experiment Manager. Para multiplexación, preparar diferentes i7 de índice 1 (i7, N7xx) para cada muestra.
- En cada pocillo, añadir 20 l de LP-PMM, 5 l de índice 1, y 5 l de índice 2 Ajuste la pipeta de 50 l, con cuidado la pipeta todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Cubrir la placa con una película adhesiva Microseal. Centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 1 (Tabla 1).
NOTA: el procedimiento puede detenerse en este punto y las reacciones almacenó durante la noche en el termociclador o durante 2 días entre 2 y 8 ° C.
3. gDNA Enriquecimiento: Día 1, Tarde
- Antes de arrancar
- Oligos Descongelar (OSC), la captura de amortiguamiento objetivo 1 (NCT1), y soluciones RSB en el hielo. Por lo menos 30 minutos antes de su uso, llevar cuentas magnéticas de purificación a RT.
- La purificación de PCR
- Centrifugar la placa de la etapa 2.4, durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- En RT, añadir 45 l de perlas magnéticas de purificación mixta en cada pocillo. Establezca la pipeta a 95 l, suavemente pipetear todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 10 min a TA. Coloque la placa de 96 pocillos en un soporte magnético durante 2 minutos a RT.
- Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Preparar una solución fresca de etanol 80% (para 24 muestras, añadir 2 ml de agua destilada a 8 ml de etanol). Desechar el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.
- Mientras se mantiene la placa en el soporte magnético, añadir 200 l de etanol 80% recién preparada a cada pocillo sin perturbar las perlas y se incuba la placa durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y repetir este lavado por segunda vez. Asegúrese de que el etanol se ha eliminado. Dejar secar a temperatura ambiente durante 15 min.
- Retirar la placa de la base magnética y añadir 40 l de tampón RSB. Ajuste el tubotte de 40 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces.
- Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético y se incuba durante 2 min. El sobrenadante debería aparecer completamente claro. Transferir suavemente 38 l del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos.
- Determinar el rendimiento de cada muestra por un método fluorimétrico. Esta primera parte del protocolo se validará si los rendimientos evaluados son entre 30 y 50 ng / l.
- 1 st Hibridación
- La piscina en hasta 12 muestras por grupo en esta etapa mediante la mezcla de 500 ng de cada muestra en una nueva placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el volumen final de cada grupo no exceda de 40 l.
NOTA: Si es necesario, disminuir el volumen de piscinas mediante el uso de un dispositivo concentrador de vacío a temperatura ambiente (Precaución: la concentración de ADN no puede ser modificado por calentamiento, incluso a 30 ° C como calentamiento provoca la degradación del ADN). Ajustar el volumen final a 40 l mediante la adición de solución de RSB. - Mezclar bien laSolución NCT1. Para cada pocillo que contenía 40 l de muestras de ADN agrupados, añadir 50 l de NCT1, y 10 l de las OSC. Establezca la pipeta para 100 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 2 (Tabla 1).
- La piscina en hasta 12 muestras por grupo en esta etapa mediante la mezcla de 500 ng de cada muestra en una nueva placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el volumen final de cada grupo no exceda de 40 l.
4. gDNA Enriquecimiento: Día 2, por la mañana
- Antes de arrancar
- Desde el equipo de enriquecimiento de ADN (véase la Tabla de Materiales / Equipos) deshielo 2 N NaOH (HP3), objetivo tampón de elución 1 (ET1), meta tampón de elución 1 ET2, perlas magnéticas de estreptavidina (SMB), solución de lavado 1 (WS1), lavado solución 2 (WS2), solución de lavado 3 (WS3), soluciones de las OSC, y NCT1 a TA.
- 1 st Hibridación Wash
- Retire la placa de 96 pocillos del termociclador y centrifugar 1 min a 280 xg a 20 ° C. Quite la cubierta adhesiva muy carefully.
- Transferir la mezcla de reacción de 100 l de la placa a una nueva placa de 96 pocillos MIDI y añadir 250 l de solución de SMB bien agitada vorticialmente. Establezca la pipeta para 350 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Sellar la placa e incubar a TA durante 30 min.
- Centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C, retire el sello adhesivo y coloque la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Descartar el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
- Añadir 200 l de solución de WS1 bien mezclada en las perlas, así que contienen. Establecer la pipeta para 200 l y suavemente pipetear el volumen entero arriba y abajo 15x evitando la formación de burbujas / espuma.
- Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Descartar el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
- Añadir 200 l de solución de WS2 bien mezclada en pozos contaperlas inación. Establezca la pipeta para 200 l pipeta y suavemente todo el volumen arriba y abajo 15x evitando la formación de burbujas / espuma.
- Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Descartar el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
- Añadir 200 l de solución WS2 bien mezclado en los pozos que contienen los granos. Establezca la pipeta para 200 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 15x.
- Transferir todo el volumen en una nueva placa de 96 pocillos. Sellar la placa y colocar la placa en un termociclador (cubierta calienta a 100 ° C). Inicie el termociclador a 42 ° C durante 30 min.
- Colocar imediately la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Retire el sello y deseche inmediatamente todas las sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético.
- Añadir 200 l de WS2 en los pozos que contienen los granos. Establezca la pipeta para 200l pipeta y suavemente todo el volumen arriba y abajo 15x evitando la formación de burbujas / espuma. Sellar la placa y colocar la placa en un termociclador (cubierta calienta a 100 ° C). Inicie el termociclador a 42 ° C durante 30 min.
- Inmediatamente colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Retire el sello y deseche inmediatamente todas las sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético.
- Añadir 200 l de solución de WS3 bien mezclada en los pocillos que contenían perlas. Establezca la pipeta para 200 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 15x.
- Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Deseche todo el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
- Repita el WS3 lavar por segunda vez.
- Después de retirar el sobrenadante, sellar la placa y centrifugar brevemente para derribar sobrenadante residual. Colocar la placa enel soporte magnético durante 2 min. Descartar el sobrenadante residual.
- En un tubo de 0,2 ml, mezclar 28,5 l de ET1 y 1,5 l de soluciones HP3. Esta mezcla es de 1 piscina, si se preparan más piscinas, multiplicar estos volúmenes por el número de piscinas preparadas.
- Retire la placa del soporte magnético. Añadir 23 l de la mezcla preparada anteriormente. Establezca la pipeta a 23 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 15x. Sellar la placa y dejar durante 5 min a TA. Centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Retirar la película adhesiva y la transferencia de 21 l de sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos.
- Añadir 4 l de solución de ET2 a cada pocillo. Establezca la pipeta a 25 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 10x y sellar la placa.
NOTA: el procedimiento puede detenerse en este punto y las reacciones almacenar durante un máximo de 7 días a -15 ° C. Si la placa está congelado, descongelar completamente antes de iniciar la hibridación 2 nd.
- 2 º La hibridación
- Se centrifuga la placa durante 1 min a 280 xg a 20 ° C. Retire la película adhesiva y añadir 50 l de NCT1, 10 l de las OSC, y 15 l de agua de grado PCR a los 25 l de biblioteca. Establezca la pipeta para 100 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces.
- Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 2 (Tabla 1).
5. gDNA Enriquecimiento: Día 2, por la tarde
- Antes de arrancar
- Descongele ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 y soluciones HP3 a TA para lavado de hibridación. Desde el kit de enriquecimiento de ADN, PCR descongelar mezcla maestra que contiene la polimerasa (TC-PMM), cóctel de PCR de cebador (PPC), y soluciones RSB en hielo durante la amplificación por PCR.
- 2 º La hibridación de lavado
- Siga exactamente el mismo protocolo que el 4,2 - 1 er lavado de hibridación.
- Amplificación por PCR
- En una nueva placa de 96 pocillos, mezclar 20 l de elución de la etapa 5.2, 25 l de TC-PMM y 5 l de PPC. Establezca la pipeta a 50 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 3 (Tabla 1).
6. gDNA Enriquecimiento: Día 3
- Antes de arrancar
- RSB solución de descongelación en hielo. Por lo menos 30 minutos antes de su uso, llevar cuentas magnéticas de purificación a RT.
- La purificación de PCR
- Se centrifuga la placa del paso 5.3 por 1 min a 280 xg a 20 ° C, y retire la cubierta adhesiva.
- A temperatura ambiente, añadir 90 l de pestaba viendo anteriormente mezclado perlas magnéticas de purificación en cada pocillo. Establezca la pipeta a 140 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 15 min a TA. Coloque la placa de 96 pocillos en un soporte magnético durante 5 min a RT. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro.
- Preparar una solución fresca de etanol 80% (para 2 muestras, añadir 200 l de agua destilada a 800 l de etanol). Desechar el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.
- Mientras se mantiene la placa en el soporte magnético, añadir 200 l de etanol 80% recién preparada a cada pocillo sin perturbar las perlas y se incuba la placa durante 30 segundos a TA. Descartar el sobrenadante y repetir este lavado una vez más. Asegúrese de que el etanol se ha eliminado. Dejar secar a temperatura ambiente durante 15 min o hasta la completa evaporación de etanol mientras que la placa está en el soporte magnético.
- Retirar la placa de la base magnética y añadir 30 l de tampón RSB. Establezca la pipeta para 30 l, y suavemente la pipeta ttodo él de volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar la placa durante 2 min a TA.
- Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético y se incuba durante 5 min o hasta que el sobrenadante aparece completamente claro. Transferir suavemente 28 l del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos (tipo de placa: TCY).
NOTA: El procedimiento puede interrumpirse en esta fase y las reacciones se almacena a -15 ° C durante un máximo de 7 días.
- Biblioteca de Validación y Cuantificación
- Determinar la calidad de la biblioteca mediante el uso de un analizador de fragmento. Alta resolución de electroforesis en gel de acrilamida puede ser usado para reemplazar los pasos mencionados anteriormente, pero no se recomienda. Los fragmentos deben ser entre 150 pb y 1000 pb.
NOTA: Recomendado: Cuantificar la biblioteca por qPCR para obtener el mejor número de racimos durante la secuenciación. - Como referencia, utilizar una biblioteca validado (2 nM). Si se prepara la primera biblioteca, utilizar el fago PhiX ADN (10 nM) proporcionado para la calibración del sequencing dispositivo.
- Preparar diluciones seriadas del control positivo de obtener 7 puntos a 20, 16, 8, 6, 4, 2, y 13:00 en EBT (EB elución buffer de + 0,1% Tween 20). Diluir la biblioteca de interés en 1/1000 y 1/2000. Cada punto debe ser analizado por triplicado.
- Preparar la siguiente mezcla (volúmenes se multiplican por el número de pozos se utiliza): para 1 pocillo, añadir 10 l de SYBR Green contienen mezcla maestra qPCR (2x), 0,2 l de cebador directo (10 micras, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 l de cebador inverso (10 M, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), y 7,6 l de agua de grado PCR.
- Después de mezclar, deponer en una placa de 96 pocillos, 18 l de mezcla en cada pocillo y 2 l de diluciones de control y de biblioteca positivos. Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C. Luego, coloque la placa en un termociclador de PCR cuantitativa programa y ejecutar 4 (Tabla 1).
- Analizar los resultados como la cuantificación absoluta convencional para obtener el rendimiento de cada library. La ventaja de qPCR es que sólo se cuantifica de ADN que van a interactuar con la célula de flujo.
NOTA: No utilice la cuantificación fluorimétrica de ADN debido a la presencia de moléculas miméticas de ADN en uno de los reactivos. Este método de cuantificación sería sobreestimar el rendimiento de la biblioteca y, en consecuencia subestimar la puntuación agrupación.
- Determinar la calidad de la biblioteca mediante el uso de un analizador de fragmento. Alta resolución de electroforesis en gel de acrilamida puede ser usado para reemplazar los pasos mencionados anteriormente, pero no se recomienda. Los fragmentos deben ser entre 150 pb y 1000 pb.
- Lanzamiento de Secuenciación
- Diluir cada biblioteca a 4 nM en un volumen final de 30 l de tampón de elución (EB), y poner en común todas las bibliotecas y mezclar bien.
- Prepare una nueva solución 0,2 N de NaOH en tampón EB y mezclar 10 l de esta solución de NaOH con 10 l de bibliotecas agrupadas. Mezclar bien e incubar exactamente 5 minutos a temperatura ambiente.
- Después de la 5 min, añadir inmediatamente 980 l de tampón de hibridación (de cartucho de secuenciación) y mezclar bien. Entonces, la mezcla 400 l de esta mezcla con 600 l de tampón de hibridación. Mezclar bien y transferir 600 l en un cartucho 300 de ciclo (2 x 150) para una inyección de 8pM. Secuenciación lanzamiento.
Análisis 7. Datos
- Una vez que el dispositivo ha procesado los datos, transferir el .bam y archivos .vcf a un equipo nuevo.
NOTA: la fragmentación transposasa incorpora huellas. En consecuencia, el software recorta automáticamente estos datos. - Recoge las variaciones genéticas obtenidas con el análisis del dispositivo.
- Analizar archivos exportados (.bam, .vcf) con otro software (Alamut) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, comparar las variaciones genéticas obtenidas con ambos análisis. Sólo dos veces variaciones detectadas se consideran presentes.
Tabla 1. condiciones de PCR
| Programa | Temperatura | Tiempo | Num. de repeticiones | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 seg | 1 |
| 98 ° C | 10 seg | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 seg | |||||
| 72 ° C | 30 seg | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | ilimitada | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 min | 16-18 h | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 seg | 1 | |||
| 98 ° C | 10 seg | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 seg | |||||
| 72 ° C | 30 seg | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | ilimitada | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 95 ° C | 15 seg | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
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Representative Results
Resultados del control de calidad de la muestra
La capacidad de este método para determinar secuencias de genes diana se basa en la calidad de la ADNg (Figura 2A) y la calidad de la etapa de tagmentation. Si el tagmentation no es suficiente (Figura 2B, panel superior), la secuenciación no será satisfactoria. Como se mencionó anteriormente, después de la purificación tagmentation, el gDNA debe tagmented en fragmentos de 150 pb a 1000 pb con la mayoría de los fragmentos de alrededor de 300 pb (Figura 2B, panel inferior).
Al final de la preparación de la biblioteca, la calidad de la biblioteca se comprueba utilizando un Bioanalyser. El perfil obtenido debe ser aproximadamente la misma que después de tagmentation pero con un mayor número de fragmentos (Figura 2C). Si la calidad de la biblioteca no es idéntica a la Figura 1C, no se debe realizar la secuenciación.
Una vez que la secuencia se inicia enel dispositivo de secuenciación, la puntuación de la agrupación está disponible después de 9 ciclos y debe estar entre 800.000 y 1.100.000 racimos / mm ² (Figura 3A). Si este número es menor, la secuenciación no será satisfactoria, especialmente en profundidad de lectura. Si es mayor, las imágenes se ven borrosas (Figura 3B), y ningún análisis se hará debido a la imposibilidad de diferenciar grupos.
Al final de la carrera, es importante comprobar el nivel de calidad. Al seguir el protocolo detallado anteriormente, la puntuación de calidad de la carrera corresponderá a la Figura 4. La calidad de la secuenciación se representa por una puntuación Q (Q-30). Para validar el experimento, por lo menos alrededor del 75% de las secuencias (clústeres) debe tener un Q-score superior o igual a 30.
Resultados de secuenciación
Este experimento se diseñó para estudiar las anomalías genéticas constitucionales. En este caso, la anomalía genética es present al 50% en el genoma. Debido a esto, la profundidad de secuenciación no es muy importante. En esto, hemos preparado y secuenciado de forma simultánea 2 bibliotecas de 12 pacientes durante 11 genes completos. Para obtener una alta profundidad de secuenciación, el número de pacientes multiplexados tiene que ser disminuida. Como enriquecimiento gDNA se basa en la captura por las sondas, el enriquecimiento no es homogénea (Figura 5). Con nuestro protocolo, que generó cerca de 6 Gb de lecturas, inducir una cobertura media de 150 lecturas por cada base, con un mínimo de 20 y un máximo de 330 lecturas. Estas profundidades de lectura son de conformidad con el uso de NGS en la práctica clínica 11. A pesar de la heterogeneidad de las profundidades de lectura, debido probablemente al enriquecimiento gDNA por captura, y no el más importante de reordenamiento de los genes, es importante señalar que la Q-marcador era siempre superior a 30 (Figura 5), validando así la secuenciación.
Sin embargo, es importante para validar la tecnología comparando el resultados obtenidos con los obtenidos con la secuenciación de Sanger. En los 17 pacientes secuenciados por tanto secuenciación Sanger y la tecnología basada transposasa (secuencias de los genes BRCA1 y BRCA2 de codificación), que hemos detectado las mismas 330 variaciones genéticas (SNP y mutaciones). Como ejemplo, una mutación puntual en el gen BRCA1 (Figura 6 izquierda) y una deleción de 4 bases en el gen BRCA2 (Figura 6 derecha) se detectaron tanto por Sanger y métodos basados en la transposasa. Como BRCA1 está en la cadena inversa del cromosoma 13, es importante tener en cuenta que es necesario para complementar (pero no invertir) la secuencia obtenida, mientras que para BRCA2 (en el capítulo adelante), la secuencia obtenida no necesita ser complementado . Como se indica en la Figura 5, la tecnología NGS da una frecuencia estimada de la variación genética, mientras que el método de Sanger no lo hace. Por otra parte, especialmente para variaciones indel, la interpretación es más fácil con NGTecnología S. Como se muestra en la Figura 6 derecha, las secuencias de variación indel aparecen como un electroferograma revueltos que necesita la secuenciación directa e inversa para descifrar la secuencia insertada o eliminada. Con el análisis de NGS, la secuencia insertada o eliminada se determina directamente, reduciendo así el riesgo de interpretación errónea. Por último, la tecnología basada transposasa nos permitió analizar un mayor número de genes diana, y encontramos muchas nuevas secuencias de variación genética que no estaban cubiertos por la secuenciación de Sanger. Estos resultados serán publicados en otros lugares.
Figura 1 Esquema del flujo de trabajo del procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. controles de calidad antes y después de la preparación de la biblioteca. A. perfil espectrofotométrico de ADNg que se puede utilizar de forma segura durante tagmentation. El rendimiento de ADN debe ser superior a 5 ng / l, 260/280 y 260/230 proporciones debe ser superior a 1,8 y 2, respectivamente. Perfiles analizador B. Fragmento de tagmented gDNA. Panel superior representa insuficientemente tagmented gDNA. El panel inferior muestra una muestra perfectamente tagmented. Perfil analizador C. Fragmento de la biblioteca preparada justo antes de lanzamiento de secuenciación. Tamaño del fragmento es el mismo que gDNA tagmented (B, panel inferior), pero con una cantidad amplificada. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura generación clúster 3. Comprobación. A. Captura de pantalla del dispositivo de secuenciación durante la carrera. Densidad Cluster debe estar entre 800 y 1.000 K / mm ². B. Diferentes imágenes corresponden a baja densidad (panel superior), de alta densidad (panel inferior) y la densidad perfecta (panel central). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra .
Figura 4 Comprobación de la Q-score. Al final de la carrera, la secuenciación validado debe tener por lo menos el 75% de los clusters generados con un Q-score superior a 30.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 Representación de los datos de cobertura y su correspondiente Q-score. La profundidad de lectura es heterogénea a lo largo del gen cubierto. Sin embargo, el Q-score de regiones cubiertas es siempre superior a la Q-30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. resultados representativos obtenidos con la secuenciación Sanger y con tecnología basada en la transposasa. Todas las variaciones genéticas observadas con la secuenciación Sanger se detected con la tecnología basada en transposasa. Mientras que las mutaciones puntuales son fáciles de interpretar, alteraciones indel son a veces muy difíciles de estudiar con el método de Sanger. Con la tecnología basada en transposasa asociado con un dispositivo de rendimiento medio, alteraciones indel son fáciles de descubrir. Sin embargo, es importante tener en cuenta que es necesario para complementar (pero no invertir) secuencias obtenidas cuando el gen diana se encuentra en el capítulo menos (aquí el gen BRCA1). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso generalizado de dispositivos y tecnologías NGS ha proporcionado nuevas oportunidades en el estudio del cáncer y los trastornos genéticos. Además de la secuenciación del genoma entero o secuenciación de ARN, el análisis de una gran cantidad de secuencias de gDNA seleccionados en numerosos pacientes simultáneamente ofrece grandes perspectivas en el diagnóstico. Aquí, hemos desarrollado un diseño específico (disponible bajo demanda) utilizando la tecnología Nextera para estudiar 11 genes completos en 24 pacientes simultáneamente con un dispositivo de secuenciación de rendimiento medio (Tabla de Materiales / Equipos). Este protocolo permite la generación rápida de datos que permite una respuesta rápida a las preocupaciones de los pacientes con un bajo riesgo de error. Como se ilustra en la Figura 6, todas las variaciones genéticas detectadas con la secuenciación de Sanger también se detectaron mediante el kit de preparación a base de transposasa. Este método es fiable y fácil de interpretar, especialmente para indel complejas alteraciones que se analizan directamente. Sin embargo, es importanteseñalar que para genes localizados en el capítulo menos, es necesario para complementar (sin invertir) nucleótidos. El presente trabajo se llevó a cabo con un diseño para el análisis de 11 genes completos, pero el protocolo es el mismo cualquiera que sea el diseño elegido. Tecnología basada en transposasa también se puede utilizar para la preparación de la biblioteca de largo alcance 12 productos de la PCR. De hecho, el algoritmo (desarrollado por el fabricante) utilizada para el diseño (herramienta web del fabricante, consulte la Tabla de Materiales / Equipos) se dedica específicamente para este protocolo. Además de la tecnología a base de transposasa, otros dos mecanismos de fragmentación del ADN antes de la preparación de la biblioteca también están disponibles: la fragmentación mecánica y fragmentación enzimática. La fragmentación del ADN mecánica es reproducible, pero necesita un ultrasonicador, y la preparación de la biblioteca es más caro y consume más tiempo. La fragmentación del ADN enzimática menudo induce problemas para la captura de ADN debido a la ubicación de los sitios de enzimas de restricción, dando como resultadoen una falta de cobertura de secuencia diana. Sin embargo, cada estrategia para la fragmentación del ADN tiene ventajas y desventajas, pero parece dar resultados bastante similares, al menos para la gama larga fragmentación producto de la PCR 13. El uso de un nuevo cóctel de enzimas parecía proporcionar los mismos resultados que los obtenidos con la fragmentación del ADN mecánica 14. La tecnología basada en transposasa necesita ADN de alta calidad (no aplicable para el ADN extraído de tejidos FFPE). Por otra parte, la actividad de la transposasa necesita fragmentos de más de 300 pb, lo que sugiere que los fragmentos de interés deben ser más largos que esta longitud. Esta especificidad explica la necesidad de una alta calidad, el ADN no-fragmentada.
Hasta ahora, las variaciones genéticas de BRCA1 y BRCA2 se han estudiado en mama familiar y cáncer de ovario. Sin embargo, la participación de los genes BRCA, y especialmente BRCA2, ahora se sospecha en otros tipos de cáncer, particularmente en páncreas 15, de próstata16, y los cánceres de testículo 17. La alteración genética de PALB2, un socio de los genes BRCA, también se asocia con el cáncer de páncreas 18. Por otra parte, recientemente apareció que los pacientes con mutaciones BRCA, y en menor medida las mutaciones PALB2, mostraron una mejor respuesta de su cáncer de páncreas a los inhibidores de PARP 19. Como BRCA1, BRCA2, y PALB2 se asocian con un riesgo familiar de cáncer, y posiblemente asociadas con la susceptibilidad a tratamientos específicos, parece importante explorar los BRCA1 y BRCA2 socios en la detección de riesgo de cáncer familiar y en la detección de la respuesta al tratamiento del cáncer.
A partir de estos datos, el análisis de genes relacionados con la reparación de rotura de ADN parece ser importante no sólo para la detección de la susceptibilidad sino también para un indicador putativa de la respuesta al tratamiento. Por otra parte, el análisis de genes completa propuesta con este protocolo podría cover todas las alteraciones que podrían ser congénitamente presente (y presente en las células cancerosas), tales como mutaciones en el promotor, sitios de corte y empalme o de los sitios de corte y empalme reguladoras localizadas en intrones. Hasta la fecha, las alteraciones en las secuencias de genes no codificante no se han estudiado en profundidad, pero el desarrollo de los estudios de asociación del genoma podrían poner de relieve las funciones importantes de estas secuencias.
En conclusión, el diseño basado en transposasa desarrollado en este trabajo es una manera interesante de explorar las anormalidades genéticas en los genes de susceptibilidad al cáncer que participan en la reparación del daño en el ADN. La posibilidad de secuenciar 11 genes completos para 24 pacientes a la vez es una ventaja importante en comparación con el método de secuenciación de Sanger, que es una técnica bastante difícil para el cribado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
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