Abstract
Der weit verbreitete Einsatz von Next Generation Sequencing hat neue Wege für die Krebsforschung und Diagnostik eröffnet. NGS werden riesige Mengen neuer Daten über Krebs, und vor allem Krebsgenetik zu bringen. Aktuellen Wissensstand und zukünftige Entdeckungen machen es notwendig, eine große Anzahl von Genen, die in einem genetischen Prädisposition für Krebs beteiligt sein könnten studieren. In diesem Zusammenhang haben wir eine Nextera Design bis 11 vollständige Gene in der DNA-Reparatur beteiligt sind Schäden zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um sicher zu studieren 11 Gene (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 und TP53) von Promotor zu 3'-UTR bei 24 Patienten gleichzeitig. Dieses Protokoll, basierend auf Transposase Technologie und gDNA Bereicherung, gibt einen großen Vorteil in Bezug auf die Zeit für die genetische Diagnostik durch Multiplexing zu probieren. Dieses Protokoll kann sicher mit Blut gDNA verwendet werden.
Introduction
Im Jahr 2010 fast 1,5 Millionen Menschen (im wesentlichen Frauen) entwickelt weltweit Brustkrebs. Es wird geschätzt, dass 5 bis 10% dieser Fälle waren erblich. Vor fast 20 Jahren, BRCA1 und BRCA2 identifiziert wurden, wie in erblichen Brust-und Eierstockkrebs 1 beteiligt. Seit vor etwa 15 Jahren haben BRCA1-und BRCA2-codierenden Regionen wurden sequenziert, um die genetische Prädisposition für Brust-und Eierstockkrebs zu bestimmen. Veränderungen im BRCA1 und BRCA2 sind in 10 bis 20% der ausgewählten Familien 2 nahelegt, daß die Analyse dieser Bereiche ist nicht ausreichend für eine effektive Screening nachgewiesen. Vor kurzem hat die Analyse von nicht-kodierenden Sequenzen (Promotor, Introns, 3-'UTR) von BRCA1-und BRCA2-Mutationen hervorgehoben, dass neue / Variationen könnten zu einem höheren Risiko von Brustkrebs 3-6 verknüpft werden.
BRCA1 und BRCA2-Proteine der homologen Rekombination Reparatur beteiligt (HHR), die von zahlreichen Partner 7 abgeschlossen ist. Während Veränderungen in BRCA1-oder BRCA2 induzieren Defekte in der DNA-Reparatur können die anderen Partner auch Einfluss auf das Risiko von Brustkrebs. Diese Hypothese erscheint seit BRIP1 8 bis validiert wurden und PALB2 9 haben eine nachgewiesene Wirkung auf Gebärmutterhals-und Brustkrebs sind. Zusätzlich können zwei weitere "mittlerem Risiko" Brustkrebs Anfälligkeit Gene, ATM und CHEK2, auch routinemäßig 10 untersucht werden.
Im Anschluss an diesen Studien, haben wir beschlossen, ein Protokoll bis 11 Gene (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 und TP53) bei 24 Patienten analysiert gleichzeitig über eine sehr einfache und relativ entwickeln schnell Protokoll, das auf Transposase Technologie, mit Anreicherung und Sequenzierung auf einem mittleren Durchsatz Gerät. Dankdieser Technik sequenziert wir vollständige Gene aus dem Start des Promotors bis zum Ende der 3'-UTR, außer RAP80, für die eine Intron-Region von 2.500 bp wurde nicht behandelt (CHR 5: 176,381,588-176,390,180). Dies entspricht insgesamt etwa 1.000.300 bp studierte bei 2.734 Sonden. Normalerweise sind BRCA1 und BRCA2 exonische Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung, die 1,5 Monate weniger als 20 Patienten muss analysiert. Bei dem vorliegenden Protokoll (Abbildung 1), in der gleichen Zeit 11 komplette Gene für mehr als 75 Patienten analysiert werden konnte.
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Protocol
1. Bewertung der gDNA (genomische DNA) Ertrag
- Quantifizieren frisch extrahierten gDNA vor der Herstellung der Bibliothek. Verwenden Sie die fluorometrischer Ertragsgutachten Methode, um intakte gDNA quantifizieren (vermeiden Sie mit einem Spektralphotometer für gDNA Ertragsgutachten). Messung der (260/280 nm) Verhältnis und sicherzustellen, dass sie zwischen 1,8 und 2 HINWEIS: 50 ng gDNA werden für das Experiment erforderlich ist.
2. gDNA Enrichment: Tag 1, Morgen
- Vor dem Start
- Von der DNA-Anreicherung Satz (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung), Tau-DNA-Puffer (TD) und DNA-Enzym (Tde1) Lösungen auf Eis. Mindestens 30 min vor der Anwendung zu bringen Reinigung magnetischen Kügelchen und stoppen Ziel (ST) Puffer auf Raumtemperatur (RT). Fügen Sie 20 ul gDNA Probe bei 2-2,5 ng / ul direkt in eine 96-Well-Platte, 1 und pro Probe. WICHTIG: Verwenden Sie eine positive Kontrolle, um das Protokoll (Probe mit bekannter Sequenz-Variation) zu validieren.
- Tagmentation
- Mix alle Reagenzien gründlich durch Umdrehen 5x, und kurz abzentrifugieren. Bei RT, fügen Sie 25 ul TD Puffer in jede Vertiefung mit 50 ng (20 ul) von gDNA und dann 5 ul Tde1 Puffer. Stellen Pipette 50 ul, sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x.
- Die Platte mit einer Klebefolie und Zentrifugation für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C. Dann wird die Platte in einem Thermocycler (Deckel bei 100 ° C erhitzt) und führen Sie das folgende Programm: 55 ° C für 5 min und 10 ° C für unbegrenzte Zeit.
- Während dieser Inkubation bereiten die Probenblatt mit Experiment-Manager-Software, um die Indizes, die verwendet werden zu definieren.
- Tagmentation Reinigung
Hinweis: Dieser Schritt ist kritisch. Sehr vorsichtig sein.- Prüfen Sie, ob der Abwesenheit von Niederschlag in der Reinigung magnetischen Kügelchen und ST-Puffer. Wenn Niederschläge vorhanden sind, erwärmen Lösungen in den Händen. Tauwetter Resuspensionspuffer (RSB) auf Eis.
- Bei RT, ST Vortex-Lösung und fügen15 ul in jede Vertiefung enthaltenden Probe. Stellen Pipette bis 65 ul, sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Inkubation für 5 min bei RT. Und die Platte abgedeckt Zentrifuge für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Fügen Sie 52 ul von zuvor gemischten Reinigung magnetischen Kügelchen in jedem gut. Stellen Pipette auf 117 ul, sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Inkubieren für 10 min bei RT. Und die Platte abgedeckt Zentrifuge für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Entfernen Sie die Klebefolie. Legen Sie die 96-Well-Platte auf einem Magnetständer für 2 min bei RT. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint.
- Eine frische 80% Ethanol-Lösung (für 24 Proben, 2 ml destilliertem Wasser auf 8 ml Ethanol). Entfernen Sie den Überstand kümmert sich nicht um die Perlen zu stören.
- Während die Platte auf dem Magnetständer, 200 ul frisch zubereitet 80% Ethanol in jede Vertiefung, ohne die Perlen zu stören und Inkubation der Platte für mindestens 30 secbei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und wiederholen Sie diese Wasch ein zweites Mal. Stellen Sie sicher, das Ethanol wurde entfernt. Trocknen lassen bei Raumtemperatur für 10 Minuten oder bis eine vollständige Verdampfung von Ethanol.
- Die Platte aus dem Magnetständer und fügen 22,5 ul RSB-Puffer. Stellen Sie die Pipette auf 22,5 ul vorsichtig pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Legen Sie die 96-Well-Platte auf dem Magnetständer und Inkubation für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Übertragen Sie leicht 20 ul der Überstand in ein neues 96-Well-Platte.
HINWEIS: Optional, bestimmen die Größe der tagmented Proben unter Verwendung eines Fragments Analysator. Anstelle der oben genannten Schritte, verwenden hochauflösende Acrylamid-Gelelektrophorese. Fragmente sollte zwischen 150 bp und 1000 bp.
- 1. PCR-Amplifikation
- Tau-PCR Master Mix-Polymerase (LP-PMM), Index 1 Primer und Primer Index 2 Lösungen auf Eis enthält. Passen Sie die Kombination of-Indizes mit dem Experiment-Manager Probenblatt. Zum Multiplexen, bereiten verschiedene i7 vom Index 1 (i7, N7xx) für jede Probe.
- In jede Vertiefung, fügen Sie 20 ul LP-PMM, 5 ul Index 1 und 5 ul Index 2. Stellen Sie die Pipette auf 50 ul vorsichtig pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Die Platte mit einer Klebefolie MICRO. Zentrifugation für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Die Platte wird in einem Thermocycler (Deckel bei 100 ° C erhitzt) und Run-Programm 1 (Tabelle 1).
HINWEIS: Das Verfahren kann an diesem Punkt gestoppt werden, und die Reaktionen über Nacht in den Thermocycler oder 2 Tage lang zwischen 2 und 8 ° C gelagert.
3. gDNA Enrichment: Tag 1, Nachmittag
- Vor dem Start
- Tau-Oligos (CSO), Capture-Zielpuffer 1 (NCT1) und RSB-Lösungen auf Eis. Mindestens 30 min vor der Anwendung zu bringen Reinigung magnetischen Kügelchen auf RT.
- PCR Purification
- Zentrifugieren der Platte von Schritt 2.4, 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Bei RT, fügen Sie 45 ul von gemischten Reinigung magnetischen Kügelchen in jedem gut. Stellen Sie die Pipette bis 95 ul vorsichtig pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Inkubieren für 10 min bei RT. Legen Sie die 96-Well-Platte auf einem Magnetständer für 2 Minuten bei RT.
- Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Eine frische 80% Ethanol-Lösung (für 24 Proben, 2 ml destilliertem Wasser auf 8 ml Ethanol). Überstand verwerfen dabei nicht um das Pellet zu stören.
- Während die Platte auf dem Magnetständer, 200 ul frisch zubereitet 80% Ethanol in jede Vertiefung, ohne die Perlen zu stören und Inkubation der Platte für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und wiederholen Sie diese Wasch ein zweites Mal. Stellen Sie sicher, das Ethanol wurde entfernt. Trocknen lassen bei Raumtemperatur für 15 min.
- Die Platte aus dem Magnetständer und fügen Sie 40 ul RSB-Puffer. Stellen Sie die Rohrtte zu 40 ul, sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x.
- Legen Sie die 96-Well-Platte auf dem Magnetständer und Inkubation für 2 min. Der Überstand sollte völlig klar erscheinen. Übertragen Sie leicht 38 ul der Überstand in ein neues 96-Well-Platte.
- Bestimmung der Ausbeute von jeder Probe durch eine fluorimetrische Methode. Dieser erste Teil des Protokolls wird validiert, wenn die bewerteten Ausbeuten liegen zwischen 30 und 50 ng / ul.
- 1. Die Hybridisierung
- Becken bis zu 12 Proben pro Pool in dieser Phase durch Mischen von 500 ng jeder Probe in einem neuen 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Volumen von jedem Pool ist 40 ul nicht überschreiten.
HINWEIS: Falls erforderlich, verringern Sie die Lautstärke der Schwimmbäder durch die Verwendung eines Vakuum-Konzentrator Gerät bei RT (Vorsicht: die Konzentration der DNA kann durch Erhitzen nicht geändert werden, auch bei 30 ° C als Heizung verursacht DNA-Abbau). Stellen Sie die endgültige Lautstärke auf 40 ul durch Zugabe von RSB Lösung. - Gründlich mischen dieNCT1 Lösung. Für jede Vertiefung 40 ul der gepoolten DNA-Proben werden 50 ul NCT1, und 10 ul CSO. Stellen Sie die Pipette auf 100 ul vorsichtig pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Die Platte wird in einem Thermocycler (Deckel bei 100 ° C erhitzt) und Run-Programm 2 (Tabelle 1).
- Becken bis zu 12 Proben pro Pool in dieser Phase durch Mischen von 500 ng jeder Probe in einem neuen 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Volumen von jedem Pool ist 40 ul nicht überschreiten.
4. gDNA Enrichment: Tag 2, Morgen
- Vor dem Start
- Von der DNA-Anreicherung Satz (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung) Tauwetter 2 N NaOH (HP3), Ziel Elutionspuffer 1 (ET1), Ziel Elutionspuffer 1 ET2, Streptavidin magnetischen Kügelchen (SMB), Waschlösung 1 (WS1), Wasch Lösung 2 (WS2), Waschlösung 3 (WS3), CSO, und NCT1 Lösungen bei RT.
- 1. Hybridisierung Wash
- Entfernen der 96-Well-Platte aus dem Thermocycler und Zentrifuge 1 min bei 280 × g bei 20 ° C. Entfernen Sie die Klebeabdeckung sehr wird eine solly.
- Übertragen Sie die 100 ul Reaktionsgemisch von der Platte auf eine neue MIDI 96-Well-Platte und 250 ul gut verwirbelt SMB-Lösung. Stellen Sie die Pipette auf 350 ul vorsichtig pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Verschließen Sie die Platte und Inkubation bei RT für 30 min.
- Zentrifuge für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C, entfernen Sie die Klebeverschluss und legen Sie die Platte auf dem Magnetständer für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Überstand verwerfen und entfernen Sie die Platte aus dem Magnetständer.
- Fügen Sie 200 ul gut gemischt WS1 Lösung in die Vertiefung, die Perlen. Stellen Sie die Pipette zu 200 ul und sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 15x Vermeidung der Bildung von Blasen / Schaum.
- Legen Sie die Platte auf dem Magnetständer für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Überstand verwerfen und entfernen Sie die Platte aus dem Magnetständer.
- Fügen Sie 200 ul gut gemischt WS2 Lösung in die Vertiefungen Containing Perlen. Stellen Sie die Pipette zu 200 ul und sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 15x Vermeidung Bildung von Blasen / Schaum.
- Legen Sie die Platte auf dem Magnetständer für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Überstand verwerfen und entfernen Sie die Platte aus dem Magnetständer.
- Fügen Sie 200 ul gut gemischt WS2 Lösung in Vertiefungen, die Perlen. Stellen Sie die Pipette zu 200 ul und sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 15x.
- Übertragen das gesamte Volumen in eine neue Platte mit 96 Vertiefungen. Verschließen Sie die Platte und legen Sie die Platte in einem Thermocycler (Deckel bei 100 ° C erhitzt). Starten Sie den Thermocycler bei 42 ° C für 30 min.
- Imediately legen Sie die Platte auf dem Magnetständer für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Das Siegel zu entfernen und entsorgen Sie unverzüglich alle den Überstand. Dann entfernen Sie die Platte aus dem Magnetständer.
- Fügen Sie 200 ul WS2 in Vertiefungen, die Perlen. Stellen Sie die Pipette bis 200ul pipettieren und vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 15x Vermeidung Bildung von Blasen / Schaum. Verschließen Sie die Platte und legen Sie die Platte in einem Thermocycler (Deckel bei 100 ° C erhitzt). Starten Sie den Thermocycler bei 42 ° C für 30 min.
- Sofort wird die Platte auf dem Magnetständer für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Das Siegel zu entfernen und entsorgen Sie unverzüglich alle den Überstand. Dann entfernen Sie die Platte aus dem Magnetständer.
- Fügen Sie 200 ul gut gemischt WS3 Lösung in Vertiefungen, die Perlen. Stellen Sie die Pipette zu 200 ul und sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 15x.
- Legen Sie die Platte auf dem Magnetständer für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Entsorgen Sie alle den Überstand und entfernen Sie die Platte aus dem Magnetständer.
- Wiederholen Sie die WS3 waschen ein zweites Mal.
- Nach dem Entfernen Stand, versiegeln die Platte und kurz zentrifugieren, um Restüberstand nach unten ziehen. Legen Sie die Platte aufdie Magnetständer für 2 min. Entsorgen Sie die Restüberstand.
- In einer 0,2-ml-Röhrchen, mischen 28,5 ul ET1 und 1,5 ul HP3-Lösungen. Diese Mischung ist für 1 Becken, Pools, wenn mehr hergestellt werden, vermehren sich diese Volumen durch die Anzahl der Schwimmbäder vorbereitet.
- Die Platte aus dem Magnetständer. Fügen 23 ul der oben hergestellten Mischung. Stellen Sie die Pipette bis 23 ul pipettieren und sanft das gesamte Volumen auf und ab 15x. Verschließen Sie die Platte und lassen Sie für 5 min bei RT. Zentrifugation für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Legen Sie die Platte auf dem Magnetständer für 2 min. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Entfernen Sie die Klebefolie und Transfer 21 ul Stand in ein neues 96-Well-Platte.
- Fügen Sie 4 ul ET2 Lösung in jede Vertiefung. Stellen Sie die Pipette auf 25 ul pipettieren und sanft das gesamte Volumen auf und ab 10x und Abdichtung der Platte.
HINWEIS: Das Verfahren kann an diesem Punkt gestoppt werden, und die Reaktionen für bis zu 7 Tage bei -15 ° C gelagert,. Wenn die Platte eingefroren ist, vollständig vor dem Start der 2. Hybridisierung auftauen.
- 2. Hybridisierung
- Zentrifugieren der Platte für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C. Entfernen Sie die Klebefolie und 50 ul NCT1 10 ul CSO, und 15 ul PCR-Wasser zu den 25 ul-Bibliothek. Stellen Sie die Pipette auf 100 ul und sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x.
- Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Die Platte wird in einem Thermocycler (Deckel bei 100 ° C erhitzt) und Run-Programm 2 (Tabelle 1).
5. gDNA Enrichment: Tag 2, Nachmittag
- Vor dem Start
- Tauwetter ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 und HP3-Lösungen bei RT für die Hybridisierung zu waschen. Von der DNA-Anreicherung Kit auftauen PCR Master Mix enthält Polymerase (TC-PMM), PCR-Primer-Cocktail (PPC), und RSB-Lösungen auf Eis für die PCR-Amplifikation.
- 2. Hybridisierung Wash
- Folgen Sie genau das gleiche Protokoll wie für 4,2 - 1. Hybridisierung waschen.
- PCR-Amplifikation
- In einer neuen 96-Well-Platte, mischen Sie 20 ul Elution von Schritt 5.2, 25 ul TC-PMM und 5 ul PPC. Stellen Sie die Pipette auf 50 ul pipettieren und sanft das gesamte Volumen auf und ab 10x. Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C.
- Die Platte wird in einem Thermocycler (Deckel bei 100 ° C erhitzt) und Run-Programm 3 (Tabelle 1).
6. gDNA Enrichment: Tag 3
- Vor dem Start
- Tauwetter RSB-Lösung auf Eis. Mindestens 30 min vor der Anwendung zu bringen Reinigung magnetischen Kügelchen auf RT.
- PCR Purification
- Zentrifugieren Sie die Platte aus Schritt 5.3 für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C, und entfernen Sie die Klebeabdeckung.
- Bei RT, fügen Sie 90 ul previously gemischt Reinigung magnetischen Kügelchen in jedem gut. Stellen Sie die Pipette bis 140 ul, sanft pipettieren das gesamte Volumen auf und ab 10x. Inkubieren für 15 min bei RT. Legen Sie die 96-Well-Platte auf einem Magnetständer für 5 min bei RT. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint.
- Eine frische 80% Ethanol-Lösung (für 2 Proben, 200 ul destilliertem Wasser auf 800 ul Ethanol). Überstand verwerfen dabei nicht um das Pellet zu stören.
- Während die Platte auf dem Magnetständer, 200 ul frisch zubereitet 80% Ethanol in jede Vertiefung, ohne die Perlen zu stören und Inkubation der Platte für 30 Sekunden bei RT. Überstand verwerfen und wiederholen Sie diese Wasch noch einmal. Stellen Sie sicher, das Ethanol wurde entfernt. Trocknen lassen bei RT für 15 min oder bis zur vollständigen Verdampfung von Ethanol, während die Platte auf dem Magnetständer.
- Die Platte aus dem Magnetständer und fügen Sie 30 ul RSB-Puffer. Stellen Sie die Pipette auf 30 ul, und sanft pipettieren ter gesamte Volumen auf und ab 10x. Inkubiere die Platte für 2 Minuten bei RT.
- Legen Sie die 96-Well-Platte auf dem Magnetständer und Inkubation für 5 min oder bis der Überstand vollständig klar erscheint. Übertragen Sie leicht 28 ul der Überstand in ein neues 96-Well-Platte (Plattentyp: TCY).
HINWEIS: Das Verfahren kann in diesem Stadium angehalten werden, und die Reaktion bei -15 ° C für bis zu 7 Tage gelagert.
- Bibliothek Validierung und Quantifizierung
- Bestimmen die Qualität der Bibliothek mit Hilfe eines Fragment-Analysator. Hochauflösung Acrylamid-Gelelektrophorese kann verwendet werden, um die oben erwähnten Schritte zu ersetzen, wird aber nicht empfohlen. Fragmente sollte zwischen 150 bp und 1000 bp.
HINWEIS: Empfohlen: Quantifizierung der Bibliothek von qPCR, die beste Anzahl der Cluster während der Sequenzierung zu erhalten. - Als Referenz verwenden eine validierte Bibliothek (2 Nm). Wenn die erste Bibliothek ist in Vorbereitung, verwenden Sie die Phagen-DNA PhiX (10 nM) für die Kalibrierung des Sequenc bereitgestellting-Gerät.
- Bereiten serielle Verdünnungen der positiven Kontrolle auf 7 Punkte bei 20 zu erhalten, 16, 8, 6, 4, 2 und 1 Uhr in EBT (EB Elutionspuffer + 0,1% Tween 20). Verdünnen Sie die Bibliothek von Interesse bei 1/1000 und 1/2000. Jeder Punkt muss in dreifacher Ausfertigung analysiert werden.
- Bereiten Sie die folgenden Mix (multiplizieren Volumina durch die Anzahl der verwendeten Vertiefungen): 1 gut, fügen Sie 10 ul SYBR Green enthält qPCR Master Mix (2x), 0,2 ul Vorwärts-Primer (10 uM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 ul Reverse-Primer (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA) und 7,6 ul PCR-Wasser.
- Nach dem Mischen abzusetzen in einer 96-Well-Platte, 18 ul-Mix in jedes Well und 2 ul der positiven Kontrolle und Bibliotheks Verdünnungen. Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge für 1 min bei 280 × g bei 20 ° C. Dann wird die Platte in einer quantitativen PCR-Thermocycler und Laufprogramm 4 (Tabelle 1).
- Analysieren Sie die Ergebnisse als herkömmliche absolute Quantifizierung, um die Ausbeute der einzelnen l erhaltenibrary. Der Vorteil der qPCR ist, dass es quantitativ nur DNA, die mit der Durchflusszelle interagieren.
HINWEIS: Verwenden Sie nicht fluorimetrischen Quantifizierung von DNA durch die Anwesenheit von DNA-Molekülen in mimetischer eines der Reagenzien. Diese Quantifizierungsmethode würde die Bibliothek Ausbeute überschätzen und somit unterschätzen die Clustering-Score.
- Bestimmen die Qualität der Bibliothek mit Hilfe eines Fragment-Analysator. Hochauflösung Acrylamid-Gelelektrophorese kann verwendet werden, um die oben erwähnten Schritte zu ersetzen, wird aber nicht empfohlen. Fragmente sollte zwischen 150 bp und 1000 bp.
- Sequenzierung Launching
- Verdünnen jede Bibliothek bei 4 nM in einem Gesamtvolumen von 30 ul Elutionspuffer (EB) und bündeln alle Bibliotheken und gut mischen.
- Eine frische 0,2 N NaOH-Lösung in EB-Puffer und mischen 10 ul dieser NaOH-Lösung mit 10 ul von gepoolten Bibliotheken. Gut mischen und Inkubation genau 5 min bei RT.
- Nach der 5 min, sofort hinzufügen 980 ul Hybridisierungspuffer (von Sequenzierung Patrone) und gut mischen. Dann mischen 400 ul dieses Gemisches mit 600 ul Hybridisierungs-Puffer. Gut mischen und übertragen 600 ul in einen 300-Zyklus Patrone (2 x 150) für eine Injektion von 8Uhr. Launch-Sequenzierung.
7. Datenanalyse
- Sobald das Gerät die Daten verarbeitet, übertragen Sie die .bam und VCF-Dateien auf einen neuen Computer.
HINWEIS: Transposase Fragmentierung beinhaltet Fußspuren. Folglich ist die Software schneidet diese Daten automatisch. - Sammeln genetischen Variationen mit dem Gerät Analyse erhalten.
- Analysieren Sie exportierten Dateien (.bam, VCF) mit einer anderen Software (Alamut), indem Sie die Anweisungen des Herstellers. Dann vergleichen Sie die genetischen Variationen mit beiden Analysen erhalten. Nur Variationen erkannt werden als zweimal vorhanden.
Tabelle 1. PCR-Bedingungen
| Programm | Temperatur | Zeit | Anz. Wiederholungen | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 Sekunden | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 Sekunden | |||||
| 72 ° C | 30 Sekunden | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | unbegrenzt | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 min | 16-18 hr | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 Sekunden | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 Sekunden | |||||
| 72 ° C | 30 Sekunden | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | unbegrenzt | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 95 ° C | 15 Sekunden | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
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Representative Results
Probe QC Ergebnisse
Die Fähigkeit dieses Verfahrens, um Sequenzen von Zielgenen zu bestimmen, ist von der Qualität der gDNA (2A) und der Qualität des tagmentation Schritt basiert. Wenn die tagmentation nicht ausreicht (2B oben), wird die Sequenzierung nicht zufriedenstellend. Wie oben erwähnt, nach der tagmentation Reinigung der gDNA sollte in Fragmente von 150 bp bis 1000 bp mit der Mehrzahl der Fragmente etwa 300 bp (2B, unteres Feld) tagmented werden.
Am Ende der Bibliotheksherstellung wird die Qualität von Bibliotheken unter Verwendung eines Bioanalyzer geprüft. Das erhaltene Profil ist ungefähr die gleiche wie nach tagmentation aber mit einer höheren Anzahl von Fragmenten (2C) sein. Wenn Bibliothek-Qualität ist nicht identisch mit Figur 1C sollten Sequenzierung nicht durchgeführt werden.
Sobald die Sequenzierung gestartet ist,Die Sequenzierung Vorrichtung ist die Clustering-Ergebnis nach 9 Zyklen zur Verfügung und sollte zwischen 800.000 und 1.100.000 Cluster / mm ² (Abbildung 3A) sein. Wenn diese Zahl kleiner ist, wird die Sequenzierung nicht zufriedenstellend sein, insbesondere in der Tiefe des Lese. Wenn er höher ist, werden die Bilder unscharf werden (3B) und nicht analysiert werden, da es unmöglich zu unterscheiden Cluster ausgeführt werden.
Am Ende der Flucht, ist es wichtig, den Qualitätsfaktor zu überprüfen. Indem Sie dem Protokoll oben beschrieben, wird die Qualität der Gäste des Laufes entsprechen Abbildung 4. Die Qualität der Sequenzierung wird von einem Q-Score (Q-30) vertreten. Um den Versuch abzusichern, mindestens etwa 75% der Sequenzen (Cluster) zu einer Q-Punktzahl größer oder gleich 30 haben.
Sequenzierungsergebnisse
Dieses Experiment wurde entwickelt, um Verfassungs genetische Anomalien zu untersuchen. In diesem Fall ist die genetische Anomalie present bei 50% des Genoms. Aus diesem Grund ist die Sequenzierung Tiefe nicht sehr wichtig. Hier, vorbereitet und sequenziert gleichzeitig 2 Bibliotheken von 12 Patienten für 11 komplette Gene, die wir. Um hohe Folge Tiefe zu erhalten, muss die Anzahl der gemultiplexten Patienten verringert werden. Wie gDNA Anreicherung auf Gefangennahme durch Sonden basiert, ist die Anreicherung nicht homogen (Abbildung 5). Mit unserem Protokoll erzielten wir über 6 GB liest und induziert eine mittlere Reichweite von 150 liest für jede Basis, mit einem Minimum von 20 und einem Maximum von 330 liest. Diese Lesetiefen sind in Übereinstimmung mit der Verwendung von NGS in der klinischen Praxis 11. Trotz der Heterogenität der Lesetiefe, wahrscheinlich aufgrund der gDNA Anreicherung durch Erfassung, und nicht den Haupt Umlagerung von Genen ist es wichtig zu beachten, dass der Q-Score war immer höher als 30 (Figur 5), wodurch die Validierung der Sequenzierung.
Dennoch ist es wichtig, die Technik durch Vergleichen des Ergebnisses zu überprüfens mit denjenigen, mit Sanger-Sequenzierung erhalten wird. In den 17 Patienten, die sowohl Sanger-Sequenzierung sequenziert (kodierenden Sequenzen der Gene BRCA1 und BRCA2) und Transposase basierte Technologie, entdeckten wir die gleichen 330 genetische Variationen (SNP und Mutationen). Als Beispiel wurde eine Punktmutation in der BRCA1-Gen (Figur 6 links) und eine Deletion von 4 Basen in der BRCA2-Gen (Figur 6 rechts) sowohl von Sanger und Transposase-basierte Methoden nachgewiesen. Wie BRCA1 ist auf der Rückseite Strang von Chromosom 13 ist es wichtig zu beachten, dass es notwendig ist, zu ergänzen (aber nicht umgekehrt) die Sequenz erhalten wurde, während für BRCA2 (auf der Vorwärtsstrang), hat die erhaltene Sequenz nicht ergänzt werden müssen . Wie in 5 gezeigt, gibt NGS-Technologie eine geschätzte Häufigkeit der genetischen Variation, während das Sanger-Verfahren nicht. Darüber hinaus, vor allem für Indel Variationen, ist die Interpretation einfacher mit NGS-Technologie. Wie in Abbildung 6 dargestellt rechts, erscheinen Indel Variation Sequenzen als Rührei Elektropherogramm, die vorwärts und rückwärts muss Sequenzierung, um die Sequenz eingefügt oder gelöscht entziffern. Mit NGS-Analyse, wird die Sequenz eingefügt oder gelöscht direkt bestimmt, wodurch das Risiko von Fehlinterpretationen zu reduzieren. Schließlich erlaubt Transposase basierte Technologie uns, eine größere Anzahl von Zielgenen analysiert, und wir fanden viele neue genetische Variation Sequenzen, die nicht durch die Sanger-Sequenzierung überzogen wurden. Diese Ergebnisse werden an anderer Stelle veröffentlicht werden.
Abbildung 1. Schematische Workflow des Verfahrens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Qualitätskontrollen vor und nach der Bibliothek Vorbereitung. A. Spectrophotometric Profil von gDNA, die sicher für tagmentation verwendet werden kann. Die DNA-Ausbeute muss höher sein als 5 ng / ul, 260/280 und 260/230 Verhältnisse müssen überlegen 1,8 und 2, jeweils. B. Fragment Analyseprofile der tagmented gDNA. Oberen Platte stellt unzureichend tagmented gDNA. Untere Feld zeigt einen perfekt tagmented Probe. C. Fragment Analysator Profil der Bibliothek bereit kurz vor Start-Sequenzierung. Fragmentgröße ist die gleiche wie tagmented gDNA (B, unteres Bild), aber mit einem verstärkten Menge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Prüfung Cluster-Generation. A. Screenshot der Sequenzierung Gerät während der Fahrt. Cluster Dichte sollte zwischen 800 und 1.000 K / mm ². B. Verschiedene Bilder entsprechen niedriger Dichte (oberes Bild), mit hoher Dichte (unten) und eine perfekte Dichte (Mitte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
Abbildung 4. Überprüfen der Q-Score. Am Ende der Flucht, sollten validiert Sequenzierung mindestens 75% der erzeugten Cluster mit einem Q-Score überlegen 30 haben.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Vertretung Abdeckungsdaten und die entsprechenden Q-Score. Die Lesetiefe ist heterogen entlang der überdachten Gen. Dennoch ist die Q-Score von fallenden Regionen immer überlegen Q-30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6 mit Sanger-Sequenzierung und mit Transposase-basierte Technologie erhalten repräsentativen Ergebnisse. Alle genetischen Varianten mit Sanger-Sequenzierung beobachtet wurden dmit der Transposase-basierte Technologie etected. In Punkt-Mutationen sind leicht zu interpretieren sind indel Veränderungen manchmal sehr schwer mit der Sanger-Methode zu studieren. Mit Transposase-basierte Technologie mit einem mittleren Durchsatz Gerät verknüpft sind indel Änderungen einfach zu entdecken. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass es notwendig ist, ergänzen (aber nicht umgekehrt) Sequenzen erhalten, wenn das Ziel-Gen ist auf dem Minus-Strang (hier das BRCA1-Gen) befindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der weit verbreitete Einsatz von NGS-Geräten und Technologien hat neue Möglichkeiten bei der Untersuchung von Krebs und genetische Erkrankungen vorgesehen. Neben der Sequenzierung ganzer Genome oder RNA-Sequenzierung, die Analyse einer großen Menge von ausgewählten gDNA-Sequenzen in zahlreiche Patienten bietet gleichzeitig große Perspektiven in Diagnose. Hier ein bestimmtes Design (auf Anfrage) mit Nextera Technologie, um 11 vollständige Gene bei 24 Patienten gleichzeitig mit einem mittleren Durchsatz-Sequenzierung Gerät (Tabelle der Materialien / Ausrüstung) studieren entwickelt. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Generierung von Daten, die eine schnelle Reaktion auf Bedenken der Patienten mit einem niedrigen Risiko von Fehlern ermöglicht. Wie in 6 dargestellt ist, wurden alle genetischen Variationen mit Sanger-Sequenzierung detektiert auch mit der Transposase-basierten Herstellungssatz erfasst. Dieses Verfahren ist zuverlässig und leicht zu interpretieren, insbesondere für komplexe Indel Veränderungen, die direkt analysiert werden. Dennoch ist es wichtig,zu beachten, dass für die Gene in der Minus-Strang befindet, ist es nötig, die (ohne Umkehr) Nukleotiden. Die vorliegende Arbeit wurde mit einem Entwurf für die Analyse von 11 vollständigen Genen durchgeführt, aber das Protokoll ist dasselbe, was auch immer das Design gewählt. Transposase-basierte Technologie kann auch für Bibliotheks Vorbereitung von Langstrecken-PCR-Produkte 12 verwendet werden. In der Tat, der Algorithmus (vom Hersteller entwickelt) für die Gestaltung verwendet (Hersteller-Website-Tool finden Sie Tabelle der Materialien / Ausrüstung) ist speziell für dieses Protokoll gewidmet. Neben der Transposase-basierte Technologie, zwei andere Mechanismen der DNA-Fragmentierung, bevor Bibliothek Vorbereitung sind auch verfügbar: mechanische Fragmentierung und enzymatische Fragmentierung. Mechanische Fragmentierung der DNA reproduzierbar ist, muss aber eine Ultraschallgerät und die Bibliothek Herstellung ist teuer und zeitaufwendig. Enzymatische DNA-Fragmentierung induziert oft Probleme für die DNA-Erfassung durch Restriktionsenzym-Stellen, wasin einem Mangel an Zielsequenzabdeckung. Trotzdem jede Strategie für die DNA-Fragmentierung hat Vorteile und Nachteile, aber scheint ganz ähnliche Ergebnisse zumindest für die lange Strecke PCR-Produkt Fragmentierung 13 geben. Die Verwendung einer neuen Enzymcocktail schienen die gleichen Ergebnisse wie mit einer mechanischen Fragmentierung der DNA 14 erhalten wird. Transposase-basierte Technologie braucht hochwertige DNA (gilt nicht für aus FFPE Gewebe extrahiert DNA). Darüber hinaus ist die Aktivität der Transposase muss Fragmente von mehr als 300 bp, was darauf hindeutet, dass Fragmente von Interesse sind länger als diese Länge sein. Diese Besonderheit erklärt die Notwendigkeit für hochwertige, un-fragmentierten DNA.
Bisher haben genetische Variationen BRCA1 und BRCA2 bei familiären Brust-und Eierstockkrebs untersucht. Allerdings ist die Beteiligung der BRCA-Gene, vor allem BRCA2, ist jetzt in anderen Krebsarten vermutet, vor allem in der Bauchspeicheldrüse 15, Prostata16 und 17 Krebsarten Hoden. Die genetische Veränderung von PALB2, einem Partner der BRCA-Gene, ist auch mit Bauchspeicheldrüsenkrebs 18 zugeordnet. Darüber hinaus ist vor kurzem gezeigt, daß Patienten, BRCA-Mutationen beherbergen, und in geringerem Ausmaß PALB2 Mutationen zeigten eine bessere Reaktion der Bauchspeicheldrüsenkrebs zu PARP-Inhibitoren 19. Wie BRCA1, BRCA2, und PALB2 sind mit einem familiären Risiko für Krebs, und möglicherweise mit der Anfälligkeit für bestimmte Behandlungen verbunden ist, erscheint es wichtig, die Gene BRCA1 und BRCA2 Partner-Screening für familiäre Krebsrisiko und Krebsvorsorge Ansprechen auf die Behandlung zu erforschen.
Aus diesen Daten scheint die Analyse von DNA-Bruchreparatur-Genen nicht nur zum Screening von Empfindlichkeit, sondern auch für eine putative Indikator der Behandlungsantwort wichtig. Darüber hinaus ist die mit diesem Protokoll vorgeschlagen komplette Gen-Analyse konnte cover alle Veränderungen, die von Geburt an vorhanden ist (und in Krebszellen) sein könnte, wie Mutationen im Promotor, Spleißstellen oder regulatorische Spleißstellen in Introns entfernt. Bisher wurden Veränderungen in der nicht-kodierenden Sequenzen der Gene nicht gründlich untersucht worden, aber die Entwicklung von genomweite Assoziationsstudien können wichtige Funktionen dieser Sequenzen hervorzuheben.
Im Ergebnis ist die in diesem Papier entwickelten Transposase-basierte Design eine interessante Möglichkeit, genetische Anomalien in der DNA-Reparatur beteiligt Schaden Krebsanfälligkeit Gene zu erforschen. Die Möglichkeit, 11 vollständige Gene für 24 Patienten gleichzeitig zu sequenzieren ist, verglichen mit dem Sanger-Sequenzierungsverfahren, die eine ziemlich schwierige Technik zum Screening ist ein wichtiger Vorteil.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
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