Abstract
次世代シーケンシングの普及は、癌研究および診断のための新たな道を切り拓いてきた。 NGSは巨大な癌に対する新たなデータの量、特にがんの遺伝学をもたらすでしょう。現在の知識と未来の発見は、それが必要な癌の遺伝的素因に関与することができる遺伝子の膨大な数を研究するようになります。この点では、DNA損傷の修復に関与する11の完全な遺伝子を研究するためにエラ·デザインを開発した。このプロトコルは、安全に、同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAD80、およびTP53）プロモーターからの3'-UTRに研究するために開発されました。トランスポザーゼ技術とgDNAの濃縮に基づくこのプロトコルは、多重化をサンプリングする遺伝子診断のおかげで時間の面で大きな利点を提供します。このプロトコルは、安全に、血液のgDNAと共に使用することができる。
Introduction
2010年にはほぼ150万人（基本的に女性は）世界的に乳癌を開発しました。なお、これらの症例の5〜10％が遺伝性であったと推定される。ほぼ20年前、BRCA1およびBRCA2は 、遺伝性乳癌および卵巣癌1に関わると同定された。約15年前から、BRCA1およびBRCA2コード領域は、乳癌および卵巣癌の遺伝的素因を決定するために配列決定されている。 BRCA1およびBRCA2の変化は、これらの領域の分析は、効果的なスクリーニングのために十分ではないことを示唆して選択された家族2 10〜20％で検出される。最近では、BRCA1およびBRCA2の非コード配列（プロモーター、イントロン、3 - 'UTR）の分析は、新たな変異/バリエーションが乳癌3-6のリスクが高いにリンクすることができることを強調した。
BRCA1およびBRCA2タンパク質は、相同組換え修復に関与している（多数のパートナー企業7によって完成さHHR）。 BRCA1またはBRCA2の変化は、DNA修復における欠陥を誘発するが、他のパートナーはまた、乳癌のリスクに影響を及ぼし得る。この仮説はBRIP1 8以来確認されているように見えるとPALB2 9は、それぞれ、子宮頸および乳癌に対する実績のある影響を与えます。さらに、2つの他の「中程度リスク」乳癌感受性遺伝子、ATMおよびCHEK2は 、また、日常的に10研究することができる。
これらの研究に続いて、私たちは非常に簡単で、比較的を用いて同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAP80、およびTP53）を分析するためのプロトコルを開発することを決定中スループットデバイス上の濃縮およびシーケンシングとトランスポザーゼ技術に基づく高速プロトコル。感謝この技術は、2,500塩基対のイントロン領域をカバーされなかったRAP80、（：176,381,588-176,390,180 Chr5）を除いて、3'-UTRの端に対するプロモーターの開始から完全な遺伝子を配列決定した。これは2,734プローブを用いて研究し、約1000300塩基対の合計を表します。通常、BRCA1およびBRCA2エキソン配列は、20未満の患者について1.5カ月を必要とするサンガー配列決定によって分析される。現在のプロトコル（ 図1）を使用すると、同じ時間で、75以上の患者のための11の完全な遺伝子を解析することができた。
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Protocol
1 gDNAの評価（ゲノムDNA）収率
- ライブラリー作製の前に新鮮に抽出されたgDNAを定量化する。 （gDNAの収率を評価するための分光光度計を使用しないでください）は、無傷のgDNAを定量化するために、蛍光歩留まり評価方法を使用します。 （260/280 nm）の比を測定し、それが1.8の間と2注であることを確認：gDNAの50 ngの実験のために必要とされる。
2 gDNAのエンリッチメント：1日目、朝
- 始める前に
- DNA濃縮キット（材料/機器の表を参照）を、解凍のDNAバッファ（TD）と氷上でのDNA酵素（TDE1）ソリューションから。少なくとも30分間、使用前に精製磁気ビーズをもたらし、標的（ST）を停止し、室温（RT）にバッファリングする。よくサンプルあたり1、2〜2.5 ngの直接96ウェルプレートに/ウェルでのgDNAサンプルの20μl添加する。重要：プロトコル（既知の配列変異を有するサンプル）を検証するためにポジティブコントロールを使用します。
- Tagmentation
- MIX徹底的にすべての試薬5回反転させて、簡単にスピンダウン。 RTで、TDE1バッファの各ウェルのgDNA 50ngの（20μl）を含む、その後、5μlにTDバッファー25μlを加える。優しく上下に10倍のボリューム全体をピペットで、50μlにピペットを設定します。
- 20℃で280×gで1分間接着フィルムや遠心分離機でプレートをカバー。その後、サーモプレートを配置（カバーが100℃で加熱）し、次のプログラムを実行します。無制限の時間のために5分間、10℃、55℃を。
- このインキュベーションの間、使用される索引を定義するために、実験·マネージャー·ソフトウェアを使用してサンプルシートを作製。
- Tagmentation精製
注：この手順は非常に重要です。十分注意してください。- 精製磁気ビーズおよびSTバッファ内の沈殿物がないことを確認してください。析出物が存在する場合には、手の中に解決策を温める。氷上で解凍再懸濁緩衝液（RSB）。
- RTで、渦のSTソリューションを追加各ウェルを含む試料に15μlの。優しく上下に10倍のボリューム全体をピペットで、65μlにピペットを設定します。 RTで5分間インキュベートする。 20℃で280×gで1分間プレート遠心分離をカバー。
- 各ウェルに、以前に混在精製磁性ビーズ52を添加する。優しく、117μlにピペットを設定し、上下10倍のボリューム全体をピペット。 RTで10分間インキュベートする。 20℃で280×gで1分間プレート遠心分離をカバー。
- 接着フィルムを取り外します。室温で2分間、磁気スタンド上で96ウェルプレートを置きます。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。
- （24サンプルについて、8ミリリットルのエタノールを蒸留水2mlを加える）新鮮な80％エタノール溶液を調製する。ビーズを乱さないように注意しながら上清を除去し、廃棄する。
- 磁気スタンドにプレートを維持しながら、ビーズを乱すことなく、各ウェルに新たに調製した80％エタノールを200μlを追加し、少なくとも30秒間静置し室温で加えた。上澄みを捨て、この洗浄をもう一度繰り返します。エタノールが除去されていることを確認してください。 10分間またはエタノールが完全に蒸発するまで室温で乾燥してみましょう。
- 磁気スタンドからプレートを取り外し、RSBバッファーの22.5μlを加える。優しく上下に10倍のボリューム全体をピペットで、22.5μlにピペットを設定します。磁気スタンド上で96ウェルプレートを置き、2分間インキュベートする。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。静かに新しい96穴プレートに20μlの上清を移す。
注：必要に応じて、フラグメント分析を使用することによりtagmentedサンプルのサイズを決定する。代わりに、上述した手順で、高解像度アクリルアミドゲル電気泳動を使用する。断片は150 bpおよび千塩基対の間であるべきである。
- 1回目のPCR増幅
- 氷上でポリメラーゼ（LP-PMM）、インデックス1プライマー、およびインデックス2プライマー溶液を含む解凍PCRマスターミックス。組み合わせoを一致させ実験マネージャのサンプルシートとfのインデックス。多重化のために、各サンプルのインデックス1（i7の、N7xx）とは異なるi7プロセッサーを用意。
- 各ウェルには、静かに上下に10倍のボリューム全体をピペットで、インデックス1、インデックス2の5μlと5μlを50μlにピペットを設定し、LP-PMM20μlのを追加します。接着剤マイクロシールフィルムでプレートをカバー。 20℃で280×gで1分間遠心します。
- サーモ、プレート（カバー100℃で加熱）し、実行プログラム1（ 表1）を配置します。
注：手順はこの時点で停止することができ、反応はサーモサイクラーで、または2〜8℃の間で2日間一晩保存した。
3 gDNAのエンリッチメント：1日目、午後
- 始める前に
- 解凍オリゴ（CSO）、キャプチャ対象のバッファ1（NCT1）、そして氷上でRSBソリューション。使用前に少なくとも30分間、RTに精製磁気ビーズをもたらす。
- PCR精製
- 20℃で280×gで1分間遠心操作ステップ2.4からプレート。
- RTで、各ウェルに混合、精製磁気ビーズの45μlを加える。 95μlにピペットを設定して、静かに上下に10倍のボリューム全体をピペット。 RTで10分間インキュベートする。室温で2分間、磁気スタンド上で96ウェルプレートを置きます。
- 上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。 （24サンプルについて、8ミリリットルのエタノールを蒸留水2mlを加える）新鮮な80％エタノール溶液を調製する。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を捨てる。
- 磁気スタンド上でプレートを維持しながら、ビーズを乱すことなく、各ウェルに、新たに調製した80％エタノール200μlを添加し、室温で30秒間静置します。上澄みを捨て、この洗浄をもう一度繰り返します。エタノールが除去されていることを確認してください。 15分間室温で乾燥させる。
- 磁気スタンドからプレートを取り外し、RSBバッファー40μlのを追加します。パイプを設定します40μlのにTTEは、優しく上下に10倍のボリューム全体をピペット。
- 磁気スタンド上で96ウェルプレートを置き、2分間インキュベートする。上清を完全に明確に表示されます。静かに新しい96ウェルプレートに上清の38μLを移す。
- 蛍光法により各サンプルの収量を決定します。査定利回りが30および50ng /μlの間にある場合に、プロトコルのこの最初の部分は検証されます。
- 第 1回ハイブリダイゼーション
- 新しい96ウェルプレートに各サンプルの500 ngのを混合することにより、この段階でプールあたり12サンプルまでのプール。各プールの最終容量は40μlのを超えていないことを確認してください。
注：必要に応じて、RT（：加熱DNAの分解を引き起こすようにDNAの濃度があっても、30℃で、加熱することにより変更することができない注意）、真空濃縮器デバイスを使用してプールの容積を減少させる。 RSB溶液を添加することによって40μlの最終的な音量を調整します。 - 完全に混合するNCT1ソリューション。プールされたDNAサンプルの入った各ウェルを40μlのために、NCT150μlの、とCSOの10μlを加える。 100μlにピペットを設定して、静かに上下に10倍のボリューム全体をピペット。 20℃で280×gで1分間プレート遠心分離を密封。
- サーモ、プレート（カバー100℃で加熱）し、実行プログラム2（ 表1）を配置します。
- 新しい96ウェルプレートに各サンプルの500 ngのを混合することにより、この段階でプールあたり12サンプルまでのプール。各プールの最終容量は40μlのを超えていないことを確認してください。
4。gDNAのエンリッチメント：2日目、朝
- 始める前に
- DNA濃縮キット（材料/機器の表を参照）を解凍2NのNaOH（HP3）から、溶出バッファー1 ET2、ストレプトアビジン磁気ビーズ（SMB）、洗浄溶液1（WS1）を標的、溶出バッファー1（ET1）を標的、ウォッシュRTで溶液2（WS2）、洗浄溶液3（WS3）、CSO、およびNCT1ソリューションを提供しています。
- 第 1回ハイブリダイゼーションウォッシュ
- 20℃で280×gでサーモ遠心1分〜96ウェルプレートを取り外します。非常にcarefu接着剤カバーを取り外しLLY。
- 新しいMIDI 96ウェルプレートにプレートから100μlの反応ミックスを移し、十分にボルテックスのSMBソリューションを250μlを追加。優しく上下に10倍のボリューム全体をピペットで、350μlにピペットを設定します。プレートをシールし、室温で30分間インキュベートする。
- 20℃で280×gで1分間遠心操作し、接着剤、シールを削除し、2分間の磁気スタンドにプレートを置く。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。上澄みを捨て、磁気スタンドからプレートを取り外します。
- よく含むビーズによく混合WS1溶液200μlを追加します。 200μlにピペットを設定して、ゆっくりと気泡/泡の形成を回避し、上下15倍ボリューム全体をピペット。
- 2分間の磁気スタンドにプレートを置きます。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。上澄みを捨て、磁気スタンドからプレートを取り外します。
- ウェルコンタによく混合WS2溶液200μlを追加します。iningビーズ。 200μlにピペットを設定して、ゆっくりと気泡/泡の形成を回避し、上下15倍ボリューム全体をピペット。
- 2分間の磁気スタンドにプレートを置きます。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。上澄みを捨て、磁気スタンドからプレートを取り外します。
- ビーズを含有するウェルによく混合WS2溶液200μlを追加します。 200μlにピペットを設定して、ゆっくりと上下に15倍ボリューム全体をピペット。
- 新しい96ウェルプレートにボリューム全体を転送します。プレートを密封し、サーモ（カバーは100℃で加熱）でプレートを配置。 30分間、42℃でサーモを起動します。
- Imediately 2分間磁気スタンドにプレートを置く。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。シールを取り外して、直ちにすべての上清を捨てる。その後、磁気スタンドからプレートを取り外します。
- ビーズを含有するウェルにWS2を200μlを追加。 200にピペットを設定する優しくμL及び気泡/泡の形成を回避し、上下15倍ボリューム全体をピペット。プレートを密封し、サーモ（カバーは100℃で加熱）でプレートを配置。 30分間、42℃でサーモを起動します。
- すぐに2分間の磁気スタンドにプレートを置く。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。シールを取り外して、直ちにすべての上清を捨てる。その後、磁気スタンドからプレートを取り外します。
- ビーズを含有するウェルによく混合WS3溶液200μlを追加します。 200μlにピペットを設定して、ゆっくりと上下に15倍ボリューム全体をピペット。
- 2分間の磁気スタンドにプレートを置きます。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。すべての上清を破棄し、磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 二回目を洗うWS3を繰り返します。
- 上清を除去した後、残留上清をプルダウンプレートと簡単に遠心分離器を密封する。上のプレートを置き2分間の磁気スタンド。残留上澄みを捨てる。
- 0.2ミリリットルチューブでは、ET1の28.5μlのとHP3ソリューションの1.5μLを混ぜる。このミックスは、よりプールが用意されている場合には、1プール用で、準備プールの数によってこれらのボリュームを掛けます。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。上記プレミックスの23を添加する。 23μlにピペットを設定して、ゆっくりと上下に15倍ボリューム全体をピペット。プレートを密封し、室温で5分間放置する。 20℃で280×gで1分間遠心します。
- 2分間の磁気スタンドにプレートを置きます。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。接着フィルムを取り外し、新しい96ウェルプレートに上清の21μLを移す。
- 各ウェルにET2液4を添加する。 25μlにピペットを設定して、ゆっくりと上下に10倍のボリューム全体をピペット、プレートをシール。
注：手順はこの時点で停止することができ、反応は-15℃で最長7日間保存。プレートが凍結されている場合は、完全に2 番目のハイブリダイゼーションを開始する前に解凍。
- 2 回目のハイブリダイゼーション
- 20℃で280×gで1分間プレートを遠心。接着フィルムを取り外し、ライブラリの25μlにNCT150μlの、CSOを10μl、およびPCRグレードの水15μlのを追加します。 100μlにピペットを設定して、ゆっくりと上下に10倍のボリューム全体をピペット。
- 20℃で280×gで1分間プレート遠心分離を密封。
- サーモ、プレート（カバー100℃で加熱）し、実行プログラム2（ 表1）を配置します。
5。gDNAのエンリッチメント：2日目、午後
- 始める前に
- 雪解けET1、ET2、SMB、WS1、WS2、WS3とハイブリダイゼーション洗浄のためのRTでHP3ソリューションを提供しています。 DNA濃縮キットから、PCR増幅のための氷上でのPCRマスターミックスを含むポリメラーゼ（TC-PMM）、PCRプライマーカクテル（PPC）、およびRSBソリューションを解凍。
- 第2 回ハイブリダイゼーションウォッシュ
- 1 番目のハイブリダイゼーション洗浄- 4.2の場合とまったく同じプロトコルに従ってください。
- PCR増幅
- 新しい96ウェルプレートでは、ステップ5.2からの溶出液20μl、TC-PMM25μlの、とPPCの5μLを混ぜる。 50μlにピペットを設定して、ゆっくりと上下に10倍のボリューム全体をピペット。 20℃で280×gで1分間プレート遠心分離を密封。
- サーモ、プレート（カバー100℃で加熱）し、実行プログラム3（ 表1）を配置します。
6。gDNAのエンリッチメント：3日目
- 始める前に
- 氷上で解凍RSBソリューション。使用前に少なくとも30分間、RTに精製磁気ビーズをもたらす。
- PCR精製
- 20℃で280×gで1分間ステップ5.3からプレートを遠心し、接着剤のカバーを取り外します。
- RTで、pは90μlを加えるreviously各ウェルに精製磁気ビーズを混合した。優しく上下に10倍のボリューム全体をピペットで、140μlにピペットを設定します。 RTで15分間インキュベートする。室温で5分間磁気スタンド上で96ウェルプレートを置きます。上清を完全にクリア表示されていることを確認してください。
- （2サンプルのために、800μlのエタノール蒸留水200μlを加える）、新鮮な80％エタノール溶液を調製する。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を捨てる。
- 磁気スタンドにプレートを維持しながら、ビーズを乱すことなく、各ウェルに新たに調製した80％エタノールを200μl添加し、室温で30秒間静置します。上澄みを捨て、この洗浄をもう一度繰り返します。エタノールが除去されていることを確認してください。プレートは磁気スタンド上にある間に15分間以上のエタノールを完全に蒸発するまで室温で乾燥させてください。
- 磁気スタンドからプレートを取り外し、RSB緩衝液30μlを加える。トンピペットを静かに30μlにピペットを設定し、彼ボリューム全体の上下に10倍。室温で2分間静置します。
- 磁気スタンド上で96ウェルプレートを置き、5分間または上清が完全に透明になるまでインキュベートする。静かに新たな96ウェルプレート（：TCYプレートタイプ）への上清28μLを移す。
注：手順は、この段階で停止することができ、反応は7日間まで-15℃で保存した。
- ライブラリ検証と定量化
- フラグメントアナライザーを使用して、ライブラリの質を決定します。高分解能アクリルアミドゲル電気泳動は、上記のステップを置き換えるために使用されるかもしれないが、推奨されない。断片は150 bpおよび千塩基対の間であるべきである。
注：推奨：シーケンス処理中にクラスターの最高数を取得するためにqPCRによりライブラリを定量化。 - 参考として、検証済みライブラリ（2 nM）を使用しています。最初のライブラリが用意されている場合、sequencの較正のために提供PHIXファージDNA（10 nM）を使用しデバイスをる。
- 、20で7点を得るために、陽性対照の連続希釈液を調製し16、8、6、4、2、およびEBTで1pMの（EB溶出バッファー+ 0.1％ツイーン20）。 1/1000〜1/2000での関心のあるライブラリを希釈する。各点は三重に分析しなければならない。
- 、ウェル1のためのqPCRマスターミックス（2倍）を含むSYBRグリーン10μlの、フォワードプライマー0.2μlの（10μM、AATGATACGGCGACCACCGAGAT）、リバースプライマー0.2μLを追加します（使用する井戸の数を乗算したボリューム）は、次のミックスを調製（10μM、CAAGCAGAAGACGGCATACGA）、および7.650μlのPCRグレード水。
- 混合した後、各ウェルに陽性対照とライブラリの希釈液を2μlに、96ウェルプレートにミックス18μLを解任。 20℃で280×gで1分間プレート遠心分離を密封。その後、定量PCRサーモサイと実行プログラム4（ 表1）にプレートを配置。
- 各Lの収量を得るために、従来の絶対的定量として結果を分析しますibrary。定量PCRの利点は、それが唯一のフローセルと相互作用するDNAを定量化することである。
メモ：試薬の1つでのDNA模倣分子の存在に、DNAの蛍光定量化を使用しないでください。この定量法は、ライブラリの収量を過大評価し、その結果、クラスタリングスコアを過小評価だろう。
- フラグメントアナライザーを使用して、ライブラリの質を決定します。高分解能アクリルアミドゲル電気泳動は、上記のステップを置き換えるために使用されるかもしれないが、推奨されない。断片は150 bpおよび千塩基対の間であるべきである。
- シーケンシング発射
- 溶出緩衝液（EB）の30μlの最終容量で4 nmの各ライブラリを希釈して、すべてのライブラリをプールし、よく混ぜる。
- EB緩衝液中で新鮮な0.2NのNaOH溶液を準備し、プールされたライブラリを10μlのこの水酸化ナトリウム溶液10μlを混ぜて。よく混合し、室温で正確に5分間インキュベートする。
- 5分後、すぐに（シーケンシングカートリッジから）ハイブリダイゼーションバッファー980μLを加え、よく混ぜる。次に、ハイブリダイゼーション緩衝液600μlのこの混合物の400μLを混ぜる。よく混合し8の注入のために300サイクルカートリッジ（2×150）に600μlのを転送pMで。シーケンシングを起動します。
7。データ解析
- デバイスがデータを処理した後は、新しいコンピュータに.bamとの.vcfファイルを転送する。
注：トランスポザーゼの断片化が足跡を内蔵しています。その結果、ソフトウェアは自動的にこれらのデータをトリムします。 - デバイス解析で得られた遺伝的変異を収集します。
- メーカーの指示に従って、別のソフトウェア（Alamut）でエクスポートしたファイル（.bam、の.vcf）を分析します。その後、両方の分析で得られた遺伝的変異を比較します。二回検出された唯一の変更は、本と考えられている。
表1のPCR条件
| プログラム | 温度 | 時間 | テンキー。リピート | |||
| 1 | 72℃ | 3分 | 1 | 98°C | 30秒 | 1 |
| 98°C | 10秒 | 10 | ||||
| 60°C | 30秒 | |||||
| 72℃ | 30秒 | |||||
| 72℃ | 5分 | 1 | ||||
| 10°C | 無制限の | |||||
| 2 | 95°C | 10分 | 1 | |||
| 93℃ | 1分 | 1 | ||||
| 91°C | 1分 | 1 | ||||
| 89℃ | 1分 | 1 | ||||
| 87℃ | 1分 | 1 | ||||
| 85°C | 1分 | 1 | ||||
| 83°C | 1分 | 1 | ||||
| 81℃ 1分 | 1 | |||||
| 79℃ | 1分 | 1 | ||||
| 77℃ | 1分 | 1 | ||||
| 75°C | 1分 | 1 | ||||
| 71℃ | 1分 | 1 | ||||
| 69°C | 1分 | 1 | ||||
| 67℃ | 1分 | 1 | ||||
| 65°C | 1分 | 1 | ||||
| 63℃ | 1分 | 1 | ||||
| 61°C | 1分 | 1 | ||||
| 59℃ | 1分 | 1 | ||||
| 58℃ | 1分 | 16〜18時間 | ||||
| 3 | 98°C | 30秒 | 1 | |||
| 98°C | 10秒 | 10 | ||||
| 60°C | 30秒 | |||||
| 72℃ | 30秒 | |||||
| 72℃ | 5分 | 1 | ||||
| 10°C | 無制限の | |||||
| 4 | 95°C | 10分 | 1 | |||
| 95°C | 15秒 | 40 | ||||
| 60°C | 1分 | |||||
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Representative Results
サンプルQC結果
標的遺伝子の配列を決定するためのこの方法の能力は、gDNAの品質（ 図2A）とtagmentation工程の品質に基づいている。 tagmentationが（ 図2B、上部パネル）が十分でない場合には、シークエンシングは満足できなくなります。上述したように、tagmentation精製後に、gDNAを、300塩基対の周りの断片の大部分（ 図2B、下のパネル）で1000 bpの150 bpのからのフラグメントにtagmentedする必要があります。
ライブラリー調製の最後に、ライブラリ品質がバイオアナライザーを用いてチェックされる。得られたプロファイルはtagmentation後でフラグメントの高い数字（ 図2C）とほぼ同じであるべきである。図書館品質は図1Cと同一でない場合、配列決定を実行するべきではありません。
配列決定は、上で起動されるとシーケンス装置は、クラスタリングスコアが9サイクル後利用可能で、800,000 1,100,000クラスター/MM²（ 図3A）の間であるべきである。この数値が低い場合は、配列決定は、特に読み取りの深さで、満足のいくものではありません。それが高い場合、画像は（ 図3B）ぼやけされ、全く分析がクラスタを区別することにより不可能に行われません。
実験の終了時に、それが品質スコアを確認することが重要です。上記に詳述したプロトコルに従うことによって、実行の品質スコアは、 図4に対応させていただきます。シーケンシングの品質は、Q-スコア（Q-30）で表される。実験を検証するには、配列（クラスター）の少なくとも約75％がQ-スコア優れた、または30に等しい必要があります。
配列決定の結果
この実験は、憲法上の遺伝子異常を研究するために設計されました。この場合、遺伝的異常は、広報されゲノム中の50％ESENT。このため、配列決定の深さはあまり重要ではない。ここで、私たちは準備し、11の完全な遺伝子のための12人の患者を同時に2のライブラリーを配列決定した。高い配列決定深度を得るために、多重化された患者の数を減少しなければならない。 gDNAの濃縮は、プローブによって捕獲に基づいているため、濃縮が（ 図5）均質ではない。私たちのプロトコルでは、私たちは約6 Gbは150の平均被覆率を誘導する、読み込む20の最小値と330の読み取りは最大で、各塩基の読み取りが発生した。これらのリード深度は、臨床実践11におけるNGSの用途に応じている。リード·キャプチャによるgDNAの濃縮におそらく深さ、ではなく、遺伝子の主要な再構成の異質性にもかかわらず、それは、Qスコアは、このようにシーケンシングを検証し、常に30（ 図5）よりも優れていたことに注意することが重要です。
それにもかかわらず、結果を比較することにより、技術を検証することが重要であるサンガー配列決定を用いて得られたもので得られたS。サンガー配列決定（BRCA1およびBRCA2のシーケンスをコードする）およびトランスポザーゼベースの技術の両方によって配列17例では、同じ330遺伝的変異（SNP突然変異）を検出した。例として、BRCA1遺伝子に点突然変異（左図6）およびBRCA2遺伝子内の4塩基（右図6）の削除は、サンガーおよびトランスポザーゼベースの方法の両方で検出された。 BRCA1は、染色体13の逆鎖上にあるように、それは（フォワード鎖上）BRCA2のために、得られた配列を補完する必要がないのに対して、配列が得られる補体（しかし反転しない）ことが必要であることに留意することが重要である。 図5に示されるようにサンガー法にはないのに対し、NGS技術は、遺伝的変異の推定周波数を与える。また、特にインデル変動を、解釈がNGと容易であるSテクノロジー。 図6に示すように、右、インデル変動配列はフォワードが必要と挿入または削除シーケンスを解読するシーケンシングを逆スクランブル電気泳動図として表示されます。 NGS分析により、挿入または削除された配列は、直接的にこのように誤った解釈の危険性を低減する、決定される。最後に、トランスポザーゼベースの技術は、標的遺伝子をより多く分析することができた、と私たちはサンガー配列決定によってカバーされていなかった多くの新しい遺伝子変異配列が見つかった。これらの結果は、他の場所で公開されます。
図1の手順の概略ワークフロー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ライブラリ作成の前後で、図2の品質を制御します。安全にtagmentationに使用することができgDNAのA.分光光度プロファイル。 DNA収量は260/280と260/230比率はそれぞれ、1.8及び2よりも優れている必要があり、5 ngの/μLよりも高くなければなりません。tagmented gDNAのB.フラグメント分析プロファイル。上のパネルは不十分tagmentedたgDNAを表しています。下のパネルは完全にtagmentedサンプルを示しています。準備されたライブラリのC.フラグメント分析プロファイルをちょうどシーケンシング起動する前に。フラグメントサイズはtagmentedのgDNA（B、下のパネル）と同じであるが、増幅された量となります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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クラスタ生成を確認する。図。運転中のシーケンス装置のA.スクリーンショット。クラスタ密度は800〜1,000 K /MM²の間であるべきである。B.異なる画像は、低密度（上パネル）、高密度（下のパネル）と完璧な密度（中央パネル）に対応しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。
図4は、Q-スコアをチェックします。実行の最後に、検証済み配列決定は、30よりも優れたQ-スコアが生成されるクラスタの少なくとも75％を持っている必要があります。JPG "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5の表現カバレッジデータとそれに対応するQ-スコア。読み取り深度はすべてカバーされた遺伝子に沿って不均一である。それにもかかわらず、対象地域のQスコアは、常にQ-30よりも優れている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サンガー配列決定をし、トランスポザーゼベースの技術を用いて得られた図6代表的な結果。サンガー配列決定を用いて観察すべての遺伝的変異をdだったトランスポザーゼベースの技術でetected。点突然変異は、解釈が容易であるのに対して、インデルの変化は、時にはサンガー法と一緒に勉強するのは非常に困難です。中スループット装置に関連するトランスポザーゼベースの技術では、インデルの変化を発見するのは簡単です。それにもかかわらず、それが（反転ではなく）を補完することが必要であることに注意することが重要である標的遺伝子のマイナス鎖（ここでは、BRCA1遺伝子 ）上に配置されたとき得られた配列。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
NGS機器や技術の普及は、がんや遺伝性疾患の研究に新たな機会を提供してきました。全ゲノムシーケンシングまたはRNA配列決定に加えて、多数の患者では、選択したgDNAシーケンスを多量の分析は、同時に診断に大きな展望を提供しています。ここでは、ミディアムスループットシークエンシングデバイス（材料/機器の表）と同時に24人の患者の11の完全な遺伝子を研究するためにネクストエラ·テクノロジーを使用して（オンデマンドで利用可能な）特定の設計を開発しました。このプロトコルは、エラーのリスクが低い患者の懸念に迅速な対応を可能にするデータの迅速な生成を可能にする。 図6に示すように、サンガー配列決定で検出されたすべての遺伝的変異はまた、トランスポザーゼベースの調製キットを用いて検出した。この方法は、特に直接分析されている複雑なインデルの変化のために、信頼性が高く、解釈が容易である。それにもかかわらず、それは重要であるマイナス鎖に位置する遺伝子のためにそれを注意することは、それが（反転なしで）ヌクレオチドを補完することが必要である。本研究は、11の完全な遺伝子の分析のためのデザインを用いて行ったが、プロトコルがデザインが選ばれた何でも同じですし。トランスポザーゼベースの技術は、ロングレンジPCR産物12からライブラリ調製のために使用することができる。実際、（メーカーによって開発された）アルゴリズムを設計に用いる特にこのプロトコルのために専用されている（メーカーのウェブサイトツール、材料/機器の表を参照）。技術ベースを、トランスポザーゼに加えて、ライブラリの準備の前にDNA断片化の二つの他のメカニズムも用意されています。機械的な断片化および酵素断片化。メカニカルDNA断片化は再現性があるが、超音波処理装置を必要とし、ライブラリの準備は、より安価でより時間がかかります。酵素によるDNA断片化は、多くの場合、結果として、制限酵素部位の位置に起因するDNAの捕捉のために問題を誘発する標的配列カバレッジの欠如。それにもかかわらず、DNAの断片化のための各戦略は、利点と欠点を有するが、少なくともロングレンジPCR産物の断片化13のために、非常に類似の結果を与えるようである。新しい酵素カクテルの使用は、機械的なDNAの断片化14で得られたものと同じ結果をもたらすように見えた。トランスポザーゼベースの技術は、高品質のDNA（FFPE組織から抽出したDNAには適用されません）が必要です。また、トランスポゼースの活性は、関心のある断片は、この長さより長くなければならないことを示唆し、300以上の塩基対の断片を必要とします。この特異性は、高品質、非断片化DNAの必要性を説明しています。
今までは、BRCA1およびBRCA2の遺伝子変異は、家族性乳癌および卵巣癌において研究されている。しかし、BRCA遺伝子の関与、特にBRCA2は 、今、特に膵臓15に、他の癌において、前立腺を疑われる16、および精巣癌17。 PALB2、BRCA遺伝子のパートナーの遺伝子改変はまた、膵臓癌18と関連している。また、最近の患者がBRCA突然変異を保有するように思われ、そしてより少ない程度にPALB2突然変異、PARP阻害剤19への膵臓癌の良好な応答を示した。 BRCA1、BRCA2、およびPALB2が癌の家族性リスクに関連しており、おそらく、特定の治療に対する感受性と関連しているとして、それは家族性癌のリスクのために、がん治療の応答のためのスクリーニングでスクリーニングにおけるBRCA1およびBRCA2のパートナーを模索することが重要表示されます。
これらのデータから、DNA切断修復関連遺伝子の解析は、感受性のスクリーニングのためだけでなく、治療応答の推定上のインジケータのためにも重要であると思われる。また、完全な遺伝子分析は、COVができ、このプロトコルが提案例えばプロモーターにおける突然変異、スプライシング部位またはイントロン内に位置する調節スプライシング部位として先天的に存在する（および癌細胞に存在する）可能性がえー全ての変更、。現在までに、遺伝子の非コード配列の改変は、深さに研究されていないが、ゲノムワイド関連研究の開発は、これらの配列の重要な機能を強調できた。
結論として、本論文で開発されたトランスポザーゼベースのデザインは、DNA損傷修復に関与するがん感受性遺伝子における遺伝的異常を探索する興味深い方法である。 24人の患者のための11の完全な遺伝子配列を決定する可能性を同時にスクリーニングのための非常に困難な技術であるサンガー配列決定法に比べて重要な利点である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
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