Summary
ここで私たちは、網膜変性および再生及び成人のゼブラフィッシュにおけるN -メチル- N個の -nitrosoureaを使用して視覚機能への影響の定量化を実証する。視力の喪失や減少感光番号が内顆粒層での増殖が行われました。完全な形態学的および機能的な再生は、30日、最初の治療後に発生した。
Abstract
産業界における失明の大部分を光受容体の損傷アカウントを生じたとの網膜変性疾患、 例えば網膜色素変性症、。動物モデルは、そのような疾患を研究するために極めて重要重要である。この点において、感光体特異的毒素N -メチル- Nの -nitrosourea（MNU）が広く薬理学的に網膜変性を誘導するために、齧歯類において使用されてきた。以前は、私たちはゼブラフィッシュにおけるMNU誘発性網膜変性モデル、視覚的な研究の別の人気モデルシステムを構築しています。
哺乳動物への魅力的な違いは、大人のゼブラフィッシュの網膜の損傷後の再生に永続的な神経発生である。この観察を定量化するために、私たちは、大人のゼブラフィッシュで視力測定を採用している。これにより、視運動反射は、非麻酔下の魚における機能変化を追跡するために使用された。これは、組織学ならびに免疫組織化学的stainiを補充した開発形態変化を相関させるためにアポトーシス（TUNEL）および増殖（PCNA）のためにngの。
要約すると、光受容体のアポトーシスが三日外顆粒層（ONL）における細胞の顕著な減少が続いているMNU処理、後に発生します。その後、内顆粒層（INL）及びONLにおける細胞の増殖が観察される。ここで、私たちは完全な組織学的だけでなく、機能的な再生だけでなく、30日の時間経過にわたって生じることを明らかにした。今、私たちは、ビデオ形式でMNUを使用して、ゼブラフィッシュの網膜変性および再生を定量化し、フォローアップする方法を示している。
Introduction
ビジョンは、人間のための最も本質的な意味であり、その障害は、高社会経済的影響力を持っています。先進国では、網膜変性疾患は、高齢者1の間で失明や失明の主な原因である。ほとんどの退行性網膜疾患の原因は部分的にしか理解されており、治療のソリューションは、失われた視力を回復することは非常に限られています。網膜色素変性症は、一次光受容体の損失2-3で網膜変性疾患の代表例である。N -メチル- Nの -nitrosourea（MNU）は網膜変性を誘導するので、広く一次光受容体細胞死4で疾患をモデル化するために、齧歯類において使用される。これは、アルキル化剤であり、通常、露光5-7後数ヶ月現れる良性および悪性腫瘍をもたらす。また、短期間の観察期間内の特定の光受容体細胞死を引き起こす。これにより、網膜層の損失structu再度、重要な網膜の菲薄化は、濃度依存的に観察された。網膜グリア細胞が活性化されたが、網膜色素上皮（RPE）には変化は見られなかった。小胞体（ER）ストレス関連アポトーシス、網膜8にMNU作用の主要経路であると思われる。
私たちは最近、ゼブラフィッシュ9の光受容体の変性を誘導するために、化学モデルとしてMNUを導入しています。他の理由の中で、ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） は、他の脊椎動物10のそれに、その視覚系の類似性の視覚の研究に重要になってきた。外側の網膜は、紫外線、短、中にピーク感度、および可視スペクトルの長波長と1桿体タイプで四つの異なるコーンタイプに分類することができ、光受容体が含まれています。内顆粒層（INL）は、バイポーラ、水平、およびアマクリン介在ニューロンの細胞体はWELとして、発見されたミュラーグリア細胞の細胞体としてlである。外網状層（OPL）は光受容体と網膜内層の間のシナプス接合レンズに最も近い細胞層に対し、視神経および視神経管を備えた長い軸索を形成する成分神経節細胞層（GC）であり、形成されている。神経節細胞、および内顆粒層における細胞間のシナプス結合は内網状層（IPL）11が形成されている。 RPEは神経感覚網膜の外側にあると長い頂端微絨毛12で光受容体外側セグメントを取り囲んでいる。さらに、ゼブラフィッシュは、高度に再生し、傷害、脳、網膜、脊髄、心臓、および他の組織13を再成長させることができる。網膜損傷が発生すると、ミュラー細胞であると考えられているINL中の細胞は、活性化され、各種の網膜細胞型に分化する可能性を有している。さらに、それらはまた、ONLに位置しているロッド前駆体を生成する。もうそう新しい細胞と大人のゼブラフィッシュの網膜を供給するス間は、毛様体辺縁帯です。このソースは連続的に成長しているゼブラフィッシュの眼14に桿体光受容体の一定の密度を達成するために必要とされる。
MNUモデルは、網膜組織のための単純かつ再現性の変性/再生のアプローチとして使用することができる。によるゼブラフィッシュにおける生物学的プロセスの特定の類似性およびヒトにおいてこれは、関連細胞死経路を識別するためにドアを開ける可能性があり、潜在的な神経保護薬をスクリーニングする。私たちのグループからの以前の研究に基づいて、私たちは今、実験室のビデオ9に従って機能的な変更を含む、網膜変性およびその結果としての再生のこのMNU誘発のゼブラフィッシュモデルの方法を示している。
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Protocol
全ての実験は、ビジョンと眼科の研究のための協会（ARVO）の眼科と視覚研究における動物の使用に関する声明に従って。
1。動物
- 26.5℃の温度と10分の14時間の明/暗サイクル15と水中での標準的な条件下で6〜12ヶ月の間熟成さAB（オレゴン州）株の野生型ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） を維持する。
- カントン獣医庁の承認後に動物実験のため、関係機関の動物保護ガイドラインに従ってください。
2 MNUトリートメント
- N -メチル- N個の -nitrosourea（MNU）の150 mg / Lの乾燥物質を含む水を準備します。注意！ MNUは有毒である。胎児にがん、遺伝性の遺伝子損傷または危害の原因となります。
- 室温で60分間、MNUを含む水中でのゼブラフィッシュをインキュベートする。
- で迅速にゼブラフィッシュをすすぐ新鮮な水とMNUずに新しい水槽に魚を入れた。限りの実験のために、必要に応じて標準的な条件下で魚を維持してください。
3視力測定
- 、視運動システムを起動し、メニューから「テスト」を選択し、を「シンプルな階段」、「視力（周波数）」と「ランダム/セパレート「16オプションを設定します。
- 視運動システム上で1メートル、約500 mlの水で満たされた輸液ボトルを取り付けます。
- 検査室で1ゼブラフィッシュを置き、注入ボトルに接続します。視運動系での検査室を配置します。
- 測定を開始し、コンピュータの画面上でリアルタイムに眼球運動を観察します。否定応答は、（「いいえ」）の駅で観察されたものと同様のランダムな目の動きを表しているのに対し、それによって、肯定的な応答は（「はい」）、正しい方向に連続したサッカードとして定義されている進の格子。ゼブラフィッシュ出品物の目が3つ以上の後続の視運動性応答（OKR）の場合、を押して「はい」。そうでない場合、キーを押し「いいえ」。
- メニューの「結果」の下に、視運動性刺激の空間周波数の閾値を決定することによって、ソフトウェアによって計算された視力を抽出する。
4。組織学
- エチル3 - アミノ安息香酸メタンスルホネート（200〜300 mg / Lの）の過剰投与によりゼブラフィッシュを安楽死させると目を脱核。
- 12時間、4℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で全体の目を固定した後、段階的なアルコール系でサンプルを脱水する。
- パラフィンにサンプルを埋め込む、視神経乳頭（ONH）を介して5μmの切片を切断し、ガラススライド上にマウントします。
- 4分間hemalumとdeparaffizedパラフィン切片を染色し、0.2％の塩酸ACIが続く蒸留水にスライドを2回浸しdおよび0.8％アンモニア。少なくとも10分（H＆E）水道水でhemalum染色の現像後3分間エオシン切片を染色する。
- メディアをマウントするには、脱水のスライドを埋め込むし、光学顕微鏡下でスライドを観察します。
5。免疫組織化学
- ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）
- 15分間室温で20μg/ mlのプロテイナーゼKで脱パラフィン切片をインキュベート。トリスでセクションを3回洗浄を5分間ずつ生理食塩水（TBS）をバッファリング。
- 60分間37℃の加湿チャンバ内で50μlのTUNEL反応混合物（10％標識溶液および90％の酵素溶液）を用いて切片をインキュベートする。 5分ごとにTBSで3回洗浄する。
- DAPIを含む封入剤でスライドをマウントし、蛍光顕微鏡下でスライドを観察します。
- 増殖細胞核抗原（PCNA）染色
- 3分間の抗原回復緩衝液（トリス-EDTA + 0.05％ツイーン20、pHが9.0）中で脱パラフィン化切片を沸騰し、各5分間TBSで3回洗浄。 100μlを1時間室温で溶液（TBS + 10％ヤギ正常血清+ 1％ウシ血清アルブミン、pH7.6の）ブロッキング遮断する。
- 4℃で一晩、加湿チャンバー内で200倍希釈1中の抗PCNA一次抗体で染色する。 5分間ずつ、TBS + Tween 20で3回洗浄する。
- 1時間室温で500倍希釈1で適切な二次抗体で検出を終了します。
- DAPIを含む封入剤でスライドをマウントし、蛍光顕微鏡下でスライドを観察します。
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Representative Results
視力：
実験の設定[空間周波数：0.042サークル/度（c / d）前記コントラスト：100％;ドリフト速度：20度/秒（D / src）の;バックライト輝度：152 CD / m 2]と本研究の成人ゼブラフィッシュのOKR評価を可能にした。よく手順を容認それぞれゼブラフィッシュ、10分 - VA測定の平均時間は約5であった。 MNUの暴露前視力は0.577±0.014サイクル/度（C / D）であった。 図1に、150 mg / LのMNUの適用後に視力経過を示す。 1日目から開始して、測定は、視力の著しい減少を明らかにした8日目から始めて3日目での最小値に到達し、視力の増加は30日MNU曝露後の視力の完全な回復を示す、発生します。統計分析のためにボンフェローニの多重比較検定に続く一方向ANOVAを適用した。これにより、視力betweの違いなく、日15および30のための、治療後のベースライン及び測定専用1日目、3、5ために有意であり、そして8た（p <0.001、それぞれ）。
網膜変性の組織学的評価：
H＆E染色は、時点当たりゼブラフィッシュの片眼（n = 3）のベースラインならびに3、8、15、及び処置後30日目（ 図2）に形態学的変化を定量した。 Tappeiner らによって記載されるように組織学を行った。9。これにより、ONLのINLおよび空洞形成の破壊を含む網膜変性は、3日目から開始観察された神経節細胞層（GC）内のセルの数、内顆粒層（INL）及びロッドの数（RN）とコーン（CN）光受容体が目の区間の両側に手動で250μmのONHの中心から決定した（数え領域の大きさは、100μmの長さの網膜切片を指します）。変性は30追跡したこれにより8日目で見つかったロッドONL損失の最大で処理した後、桿体（RN）の数は日15、元の数の30に、3日目に82パーセントに8日目に71％、77％減の日。さらに、細胞クラスターの蓄積は主にINLに、発見された。
アポトーシスの定量：
TUNEL染色は、（ その場での細胞死検出キットでは 、ロシュ·アプライド·サイエンス、Rotkreuzの、スイス）製造業者に従って行った。 MNU処理後の観察網膜変性はアポトーシスによって引き起こされた。これは、感覚網膜内の異なる細胞層に陽性TUNEL染色によって明らかになった。定量化のために、TUNEL陽性細胞の数は、網膜の周辺部から始まる、450ミクロンの長さの2つの網膜の領域毎に手動で決定した。これにより、TUNEL陽性細胞の大部分がしかし3日目にONLで見られた、死にかけている細胞は、その時点でINLで見られた （ 図3）。いいえ関連するTUNEL陽性細胞は、治療の前に検出されなかった。
細胞増殖の定量化。
細胞死の後に増殖を評価するために、網膜をTappeiner らによって記載されるように細胞核抗原（PCNA）を増殖するために染色した。9。上記のように定量化のために、PCNA陽性細胞の数は手動で決定した。細胞死は、PCNA陽性細胞（ 図4）として見られる誘導性増殖が続いた。これにより、増殖細胞の最大値はさらに5日目に、INLで測定した、ONL（主に棒）の細胞は研究（第30日）の終わりまでPCNAに陽性染色を示した。毛様体辺縁帯でも数少ないPCNA陽性細胞は前と治療後のすべての時点で検出可能であった。
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図1：150 mg / LのMNUを適用した後の成人のゼブラフィッシュにおける視力の視力測定。 3日目の後処理で最小と視力の有意な減少が30日目まで（平均±SDであり、n = 3）、5日目に開始し、完全な回復が続いた。
図2：組織学 MNU処置後のベースライン（A）及び図3（B）、図8（C）、図15（D）、および30（E）日目のゼブラフィッシュ網膜の組織学的切片をH＆E染色の例。 CN、コーン核; RN、ロッド核; INL、内顆粒層; GC、神経節細胞層。矢印は、INL内細胞クラスターをマーク。スケールバーは50μmで等しくなります。
図3：MNU処理後3日目のゼブラフィッシュ網膜におけるTUNEL陽性細胞のTUNEL陽性細胞（赤色）。細胞は主にONLに位置していただけでなく、INLで発見された。パネルBは、MNU処理後の画像を示し、一方、パネルAは 、コントロールを示す。スケールバーは50μmでを示している。
図4：対照試料と比較しMNU処理後5日目のゼブラフィッシュ網膜におけるPCNA陽性細胞のPCNA陽性細胞（赤色）。パネルBは、MNU処理後の画像を示し、一方、パネルAは 、コントロールを示す。スケールバーは、100μmを示している。
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Discussion
以前は、私たちのグループは、ゼブラフィッシュのシステム9にげっ歯類から光受容体変性のMNUモデルを転送した。その後のイベントは、説明し、30日まで追跡した。この期間では、完全な網膜の形態学的変性と再生は、初期治療後に発生した。まず、組織学はそれに対応して8日目に最低で一日3から減少ロッド細胞数を明らかにし、TUNEL染色は、3日MNU処理後の桿体のアポトーシスを識別します。再生は、増殖細胞はこれがありませんが、増殖の増加INLとは対照的であり、5日目で最大の観察期間の終わりまで観察することができ、ONLで5日目で最大で、3日目にINLで開始毛様体辺縁帯は、いくつかのPCNA陽性細胞は、未処理の網膜で発見された網膜の唯一の場所である15日後に観察された。これは、常に網膜神経新生througで領域を示しているハウト寿命14。ゼブラフィッシュにおける薬理学的に損傷した光受容体の再生に関与する細胞型の識別は、この原稿の焦点ではありませんでした。ただし、以前の文献にプロセスがミュラー細胞9,17,18であることが示唆されているINL内再生細胞に起因する。
本研究では、私たちもMNU誘発性ゼブラフィッシュモデルにおける機能の変化を評価した。成魚において視覚機能を定量化するために、OKRの評価が確実に小動物19の視力（VA）を測定するために、いくつかの技術のいずれかを採用されている。これにより、生得的行動に基づいOKRは、動物20の前に時間のかかるトレーニングを必要としません。 OKRを繰り返し、独立して、動物の協力の誘発することができ、大きな目を簡単に観察することができるようにまた、OKRの評価は、ドゥリン視力を追跡する理想的な方法です。ゼブラフィッシュにおけるグラムの変性と再生。本研究におけるOKRの測定は、これがでアポトーシスの最大値を示すMNU適用後の組織学的脱回生変化に応じて1日30日に視覚機能の完全な回復が続き、3日目まで減少し視力を明らかにした3日目。
MNUを調製する高速で直接ゼブラフィッシュの水槽に溶解することができるように、モデルの利点は、その単純である。 MNUによるゼブラフィッシュの処理は、1時間で行われる。まとめて処理することができる魚の数は、水槽の大きさによって制限される。全体的に、これは、個別の魚の操作を必要とせずに、ゼブラフィッシュの偉大な数の網膜変性の単純な誘導を可能にする。したがって、このモデルは、硝子体内または手術誘発性技術21-23を使用し、網膜変性の他のモデルよりも低侵襲性であり、それはより良好な再現性を示し得る。
一般に、このゼブラフィッシュMNUモデルは、光受容体特異的な変性を誘導するだけでなく、形態学的にも機能的に次の再生を視覚化する多目的なツールである。そこで、モデルが良く、一般的な感覚網膜の変性と再生処理を理解するのに役立ちますし、哺乳動物系との結果を比較するための可能性を開くものと確信しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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