Methylnitrosourea (MNU) -inducerede nethindedegeneration og Regeneration i zebrafisk: Histologisk og funktionelle egenskaber
Summary
Heri vi demonstrere kvantificering af retinal de- og regenerering og dens indvirkning på visuel funktion ved anvendelse af N-methyl-N -nitrosourea i den voksne zebrafisk. Tab af synsstyrke og nedsat fotoreceptor numre blev efterfulgt af proliferation i den indre nukleare lag. Komplet morfologiske og funktionelle regenerering forekom 30 dage efter den indledende behandling.
Abstract
Retinale degenerative sygdomme, fx retinitis pigmentosa, med deraf følgende fotoreceptor skader tegner sig for størstedelen af synstab i den industrielle verden. Dyremodeller af central betydning for at studere sådanne sygdomme. I denne forbindelse fotoreceptoren-specifikke toksin N-methyl-N -nitrosourea (MNU) er blevet meget udbredt i gnavere til farmakologisk fremkalde nethindedegeneration. Tidligere har vi etableret en MNU-induceret nethindedegeneration model i zebrafisk, en anden populær model-system i visuel forskning.
En fascinerende forskel til pattedyr er den vedvarende neurogenese i den voksne zebrafisk nethinden og dens regenerering efter skader. For at kvantificere denne observation har vi ansat visuelle skarphed målinger i den voksne zebrafisk. Derved blev den optokinetic refleks anvendes til at følge funktionelle ændringer i ikke-bedøvede fisk. Dette blev suppleret med histologi samt immunhistokemiske staining til apoptose (TUNEL) og proliferation (PCNA) at korrelere udviklingslandene morfologiske ændringer.
Sammenfattende forekommer apoptose af fotoreceptorer tre dage efter MNU behandling, som er efterfulgt af en markant reduktion af celler i det ydre kernelag (ONL). Derefter observeres proliferation af celler i det indre kernelag (INL) og ONL. Heri viser vi, at ikke kun en fuldstændig histologisk, men også en funktionel regenerering sker over et tidsforløb på 30 dage. Nu skal vi illustrere de metoder, til at kvantificere og følge op zebrafisk retinal de- og regeneration ved hjælp af MNU i en video-format.
Introduction
Vision er den mest afgørende mening for mennesket og dets leverfunktion har en stor samfundsøkonomisk virkning. I den udviklede verden, retinale degenerative sygdomme er den hyppigste årsag til synstab og blindhed blandt ældre voksne 1. Årsagen til de fleste degenerative retinale sygdomme er kun delvist forstået og terapeutiske løsninger til at genvinde tabte vision er meget begrænsede. Retinitis pigmentosa er et typisk eksempel på en retina degenerativ sygdom med primær fotoreceptor tab 2-3. N-methyl-N -nitrosourea (MNU) inducerer retinal degeneration og er derfor almindeligt brugt i gnavere at modellere sygdomme med primær fotoreceptor celledød 4. Det er et alkyleringsmiddel og fører til benigne og maligne tumorer, som normalt vises flere måneder efter eksponering 5-7. Desuden bevirker specifikke fotoreceptor celledød inden for en kort sigt observationsperiode. Derved tabet af retinal lag struktre og betydelig retinal udtynding blev observeret i en koncentrationsafhængig måde. Retina gliaceller blev aktiveret, men ingen ændringer i det retinale pigment epitel (RPE) findes. Endoplasmatiske reticulum (ER) stressrelateret apoptose synes at være den vigtigste vej for MNU aktion i nethinden 8.
Vi har for nylig indført MNU som en kemisk model til at inducere fotoreceptordegenerering i zebrafisk 9. Blandt andre grunde har zebrafisk (Danio rerio) blevet vigtigt i visuel forskning grund af lighederne i dens visuelle system til andre hvirveldyr 10. Den ydre nethinde indeholder fotoreceptorer, som kan inddeles i fire forskellige kegle typer med peak følsomhedsberegninger i det ultraviolette, kort, mellemlang og lang bølgelængde af det synlige spektre og en stang fotoreceptor type. I den indre nukleare lag (INL) er cellelegemerne bipolære, vandret og amacrine interneuroner fundet, som welll som celle soma af Muller gliaceller. I det ydre netformige lag (OPL) dannes synaptiske kontakter mellem fotoreceptorer og den indre nethinde, mens cellelag nærmest linsen er ganglion cellelag (GC), hvilke komponenter danner lange axoner omfatter synsnerven og optisk tarmkanalen . Synaptiske kontakter mellem ganglieceller og cellerne i det indre kernelag er dannet i det indre netformige lag (IPL) 11. RPE ligger udenfor neurosensoriske nethinde og omgiver fotoreceptor ydre segmenter med lange apikale microvilli 12. Endvidere zebrafisk er meget regenerative og i stand til at regrow læderede hjerne, nethinde, rygmarv, hjerte og andre væv 13. Når beskadigelse af nethinden opstår, celler i INL, der formodes at være Müller celler aktiveres og har potentialet til at differentiere til forskellige retinale celletyper. Desuden er de også generere stang stamceller, der er placeret i ONL. Et andet såurce der forsyner nethinden af voksne zebrafisk med nye celler er ciliaere randzone. Denne kilde er nødvendig for at opnå en konstant tæthed af stangen fotoreceptorer i de stadigt voksende zebrafisk øje 14.
Den MNU model kan anvendes som en simpel og reproducerbar degenerering / regenerering fremgangsmåde for retinavæv. På grund af visse ligheder mellem biologiske processer i zebrafisk og i mennesker dette kunne åbne dørene for at identificere de involverede celledødsveje og at screene potentielle neurobeskyttende lægemidler. Baseret på en tidligere undersøgelse fra vores gruppe, vi nu illustrere metoderne for denne MNU-induceret zebrafisk model af retinal de- og deraf følgende regenerering, herunder funktionelle ændringer med ifølge laboratorium videoer 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere har vores gruppe overført MNU model fotoreceptordegenerering fra gnavere i zebrafisk systemet 9. De efterfølgende hændelser blev beskrevet og fulgt i op til 30 dage. I denne periode opstod fuldstændig retina morfologiske degeneration og regeneration efter den indledende behandling. Først histologi afslører en reduceret stang celletal fra dag 3 på med et minimum på dag 8. Tilsvarende TUNEL farvning identificerer apoptose af stangen fotoreceptorer 3 dage efter MNU behandling. Regenerering begy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
- Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
- Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
- Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
- Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
- Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
- Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
- Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
