Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

doi: 10.3791/51909 Published: October 20, 2014

Summary

Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.

Abstract

Degenerativer Netzhauterkrankungen, beispielsweise Retinitis pigmentosa, mit daraus resultierenden Schäden Konto Photorezeptor für die Mehrheit der Verlust der Sehkraft in der industriellen Welt. Tiermodelle sind von zentraler Bedeutung, um solche Krankheiten zu studieren. In diesem Zusammenhang wird der Photorezeptor-spezifischen N-Methyl-N-Toxin -nitrosourea (MNU) ist weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um pharmakologisch herbeiNetzHautDegeneration. Bisher haben wir eine MNU-induzierte Degeneration der Netzhaut-Modell in der Zebrafisch, ein weiteres beliebtes Modellsystem in der visuellen Forschung etabliert.

Eine faszinierende Unterschied zu den Säugetieren ist die anhaltende Neurogenese im erwachsenen Zebrafisch Netzhaut und ihre Regeneration nach der Beschädigung. Um diese Beobachtung haben wir Sehschärfe Messungen im erwachsenen Zebrafisch eingesetzt quantifizieren. Dabei wurde die optokinetischen Reflex verwendet, um funktionelle Veränderungen in nicht-narkotisierten Fische folgen. Dies wurde mit der Histologie sowie immunhistochemischen staini ergänztng für die Apoptose (TUNEL) und Proliferation (PCNA), die Entwicklungs morphologischen Veränderungen zu korrelieren.

Zusammenfassend, die Apoptose von Photorezeptoren erfolgt drei Tage nach MNU Behandlung, die durch eine deutliche Verringerung der Zellen in der äußeren Körnerschicht (ONL) folgt. Danach wird die Proliferation von Zellen in der inneren Kernschicht (INL) und ONL beobachtet. Hier offenbaren wir, dass nicht nur eine vollständige histologische sondern auch eine funktionelle Regeneration über einen Zeitraum von 30 Tagen auf. Jetzt zu veranschaulichen wir die Methoden zur Quantifizierung und Follow-up Zebrafisch Netzhaut De- und Regeneration mit MNU in einem Video-Format.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vision ist der wichtigste Sinn für den Menschen und seine Wertminderung hat einen hohen sozioökonomischen Auswirkungen. In der entwickelten Welt sind degenerativer Netzhauterkrankungen die häufigste Ursache für Sehverlust und Erblindung bei älteren Erwachsenen 1. Die Ursache der meisten degenerativen Netzhauterkrankungen ist nur teilweise verstanden und therapeutische Lösungen, um verlorene Vision wieder sehr eingeschränkt. Retinitis pigmentosa ist ein typisches Beispiel einer degenerativen Netzhauterkrankungen mit primären Photorezeptorverlust 2-3. N-Methyl-N -nitrosourea (MNU) induziert Degeneration der Netzhaut und ist deshalb weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um Krankheiten mit primären Photorezeptorzelle Tod 4-Modell. Es ist ein Alkylierungsmittel und führt zu gutartigen und bösartigen Tumoren, die in der Regel werden mehrere Monate nach der Belichtung 5-7. Darüber hinaus werden spezifische Photorezeptor Zelltod bewirkt, dass es innerhalb eines kurzen Zeitbeobachtungszeitraum. Dadurch wird der Verlust an retinalen Schicht structure und der wesentlichen Netzhautverdünnung wurden in einer konzentrationsabhängigen Weise beobachtet. Netzhaut-Gliazellen aktiviert wurden, aber keine Änderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE) wurden gefunden. Endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress-Apoptose scheint der Hauptweg von MNU Aktion in der Netzhaut 8 sein.

Wir haben vor kurzem MNU als chemisches Modell Photorezeptordegeneration im Zebrafisch 9 induzieren. Neben anderen Gründen ist der Zebrafisch (Danio rerio) ist wegen der Ähnlichkeiten der visuellen System zu anderen Wirbeltieren 10 in der visuellen Forschung wichtig. Die äußere Netzhaut enthält den Photorezeptoren, die in vier verschiedenen Zapfentypen mit Spitzenempfindlichkeiten in den ultravioletten, kurze, mittlere und lange Wellenlängen des sichtbaren Spektrums und eine Stange Photorezeptor-Typ gruppiert werden können. In der inneren Körnerschicht (INL) werden die Zellkörper der bipolaren, horizontalen und amacrine Inter gefunden, als well als Zellsoma Müller Gliazellen. In der äußeren plexiformen Schicht (OPL) die synaptischen Kontakte zwischen Photorezeptoren und der inneren Netzhaut gebildet werden, wohingegen die Zellschicht am nächsten an der Linse ist die Ganglienzellschicht (GC), die Bestandteile lange Axone, die den Sehnerv und die Sehbahn bilden . Synaptischen Kontakte zwischen Ganglienzellen und die Zellen in der inneren Kernschicht in der inneren plexiformen Schicht (IPL) 11 ausgebildet sind. Die RPE liegt außerhalb der neurosensorischen Netzhaut und umgibt die Photorezeptoraußensegmente mit langen apikalen Mikrovilli 12. Weiterhin ist die Zebrafisch hoch regenerativen und Verletzungen ist in der Lage, Gehirn, Retina, Rückenmark, Herz und anderen Geweben 13 nachwachsen. Wenn Netzhautschädigung auftritt, Zellen in der INL, die vermutlich Müller Zellen werden aktiviert und das Potential haben, in verschiedenen Netzhautzelltypen zu differenzieren. Darüber hinaus erzeugen sie auch Stange Vorläufern, die in der ONL befinden. Ein weiteres source, die die Netzhaut des erwachsenen Zebrafisch mit neuen Zellen liefert die ciliary Randzone. Diese Quelle ist erforderlich, um eine konstante Dichte der Stäbchen-Photorezeptoren in den kontinuierlich wachsenden Zebrafischauge 14 zu erzielen.

Die MNU-Modell kann als eine einfache und reproduzierbare Degeneration / Regeneration Ansatz für Netzhautgewebe eingesetzt werden. Aufgrund bestimmter Ähnlichkeiten der biologischen Prozesse im Zebrafisch und in den Menschen könnte dies die Türen zu öffnen, sich zu engagieren Zelltod Wege zu identifizieren und mögliche neuroprotektive Medikamente auszusortieren. Basierend auf einer früheren Studie aus unserer Gruppe, jetzt haben wir veranschaulichen die Methoden dieser MNU-induzierte Zebrafisch-Modell der Netzhaut De- und konsequente Regeneration einschließlich funktionelle Veränderungen mit nach Labor Videos 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle Versuche der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen und Vision Research von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten werden.

1. Tiere

  1. Pflegen Sie die Wildtyp-Zebrafisch (Danio rerio) der AB (Oregon) Spannung zwischen 6-12 Monaten unter Standardbedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und einem 14/10 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus 15 Jahren.
  2. Befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die kantonalen Veterinäramt.

2. MNU-Behandlung

  1. Bereiten Sie Wasser mit 150 mg / L Trockensubstanz von N-Methyl-N -nitrosourea (MNU). VORSICHT! MNU ist giftig; kann Krebs, vererbbare Schäden oder Schädigung des ungeborenen Kindes führen.
  2. Inkubieren Zebrafisch in Wasser, das das MNU für 60 min bei Raumtemperatur.
  3. Schnell mit spülen Zebrafischfrischem Wasser und setzen die Fische in ein neues Aquarium ohne MNU. Pflegen Fisch unter Standardbedingungen, so lange für die Experimente gewünscht.

3. Sehschärfe Mess

  1. Starten Sie den optomotorischen System, wählen Sie "Test" aus dem Menü und die Optionen auf "Simple Treppe", "Acuity (Freq)" und "Randomisierte / Separate" 16.
  2. Installieren Sie eine Infusionsflasche mit 500 ml Wasser gefüllt ca. 1 m über der optomotorischen Systems.
  3. Legen Sie ein Zebrafisch in der Untersuchungskammer und an die Infusionsflasche. Legen Sie die Prüfung Kammer in der optomotorischen Systems.
  4. Starten Sie die Messung und die Augenbewegungen in Echtzeit auf dem Computerbildschirm zu beobachten. Dadurch wird eine positive Antwort ("Ja") als aufeinander folgende Sakkaden in die richtige Richtung definiert, während eine negative Antwort ("nein") stellt zufälligen Augenbewegungen ähnlich wie die mit der Station beobachtet wirdary Gitter. Wenn die Augen der Zebrafisch zeigen drei oder mehr aufeinanderfolgenden optokinetischen Antworten (OKR), drücken Sie "Ja"; Wenn nicht, drücken Sie "Nein".
  5. Extrahieren der Sehschärfe, die durch die Software durch Bestimmen der Schwelle der Raumfrequenz des optokinetischen Stimulus unter "Ergebnisse" im Menü berechnet wurde.

4. Histologie

  1. Einschläfern Der Zebrafisch durch eine Überdosis von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat- (200-300 mg / L) und entkernen Sie die Augen.
  2. Fixierung der ganzen Augen in 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° C für 12 h und dann Dehydratisierung der Proben in einer abgestuften Alkoholreihe.
  3. Einbetten der Proben in Paraffin, schneiden 5 um Schnitte durch den Sehnervenkopf (Papille) und montieren sie auf einen Glasobjektträger.
  4. Färben die deparaffized Paraffinschnitten mit Hämalaun für 4 min und tauchen die Dias zweimal in destilliertem Wasser, gefolgt von 0,2% iger acid und 0,8% Ammoniak. Färben die Schnitte mit Eosin für 3 min nach der Entwicklung der Hämalaun-Färbung in Leitungswasser für mindestens 10 min (H & E).
  5. Betten Sie die Folien in dehydriert Montagemedium und unter dem Lichtmikroskop beobachten die Folien.

5. Immunhistochemie

  1. Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL)
    1. Inkubiere die entparaffinierten Schnitte mit 20 ug / ml Proteinase K bei Raumtemperatur für 15 min. Dreimal mit Tris waschen Sie die Abschnitte Kochsalzlösung (TBS) für jeweils 5 min.
    2. In einer feuchten Kammer inkubieren die Abschnitte mit 50 ul TUNEL Reaktionsmischung (10% Markierungslösung und 90% Enzym-Lösung) bei 37 ° C für 60 min. Dreimal waschen mit TBS für jeweils 5 min.
    3. Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien.
  2. Wuchernden Cell Nuclear Antigen (PCNA) Färbung
    1. Man kocht die entparaffiniert Abschnitte in Antigen-Retrieval-Puffer (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9,0) für 3 min und dreimal mit TBS für jeweils 5 min. Block mit 100 ul Blockierungslösung (TBS + 10% Ziegennormalserum + 1% Rinderserumalbumin, pH 7,6) bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    2. Fleck mit Anti-PCNA primäre Antikörper in einer 1: 200-Verdünnung in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht. Dreimal für je 5 min waschen mit TBS + Tween 20.
    3. Beenden Sie die Erkennung mit den entsprechenden Sekundärantikörper in einer 1: 500-Verdünnung bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    4. Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sehschärfe:

Der Versuchsaufbau [Ortsfrequenz: 0,042 Kreise / Grad (C / D); Kontrast: 100%; Driftgeschwindigkeit: 20 Grad / Sekunde (d / src); Hintergrundbeleuchtung Helligkeit: 152 cd / m 2] der Studie aktiviert OKR Beurteilung der erwachsenen Zebrafisch. Die mittlere Dauer der VA Messung war etwa 5 - 10 Minuten für jeden Zebrafisch, die das Verfahren gut vertragen. Sehschärfe vor MNU Exposition war 0,577 ± 0,014 Zyklen / Grad (c / d). Abbildung 1 zeigt den Verlauf der Sehschärfe nach der Anwendung von 150 mg / L MNU. Ausgehend von Tag 1 zeigten die Messungen eine deutliche Abnahme der Sehschärfe und erreichte Minimalwerte an Tag 3. Beginn von Tag 8, eine Erhöhung der Sehschärfe auftritt, die eine vollständige Wiederherstellung der Sehschärfe von 30 Tagen nach MNU-Exposition. Zur statistischen Analyse wird ein one-way ANOVA, gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichstest angewendet wurde. Dabei sind die Unterschiede in der Sehschärfe zwischen Baseline und Messungen nach der Behandlung signifikant für den Tagen 1, 3, 5 war, und 8 (p <0,001, jeweils), aber nicht an den Tagen 15 und 30.

Histologische Beurteilung der Netzhautdegeneration:

H & E-Färbung wurde verwendet, um morphologische Veränderungen in einem Auge des Zebrafisches pro Zeitpunkt (n = 3) an der Grundlinie als auch 3, 8, 15 und 30 Tage nach der Behandlung (Figur 2) zu quantifizieren. Histologie wurde wie von Tappeiner et al beschrieben durchgeführt. 9. Dadurch Retinadegeneration einschließlich Unterbrechung der INL und Hohlraumbildung der ONL beobachtet beginnend an Tag 3. Die Anzahl der Zellen in der Ganglienzellschicht (GC), der inneren Kernschicht (INL) und die Anzahl der Stange (RN) und Kegel (CN) Photorezeptoren wurden manuell 250 um von der Mitte des ONH auf beiden Seiten der Augenabschnitt bestimmt (Größe der gezählten Bereich bezieht sich auf einen Netzhautabschnitt von 100 um Länge). Die Degeneration wurde 30 gefolgtTage nach der Behandlung mit der maximalen Stab ONL Verlust an Tag 8. Dadurch gefunden, die Anzahl der Stäbchen-Photorezeptoren (RN) sank auf 82% an Tag 3 und 71% am Tag 8 und 77% an den Tagen 15 und 30 der ursprünglichen Anzahl . Weiterhin Akkumulation von Zellclustern wurde gefunden, hauptsächlich in der INL.

Quantifizierung der Apoptose:

TUNEL-Färbung wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt (in situ Cell Death Detection Kit, Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Schweiz). Die beobachtete Degeneration der Netzhaut nach MNU-Behandlung wurde durch Apoptose verursacht. Dies wurde durch positive TUNEL-Färbung in verschiedenen Zellschichten in der sensorischen Netzhaut offenbart. Für die Quantifizierung wurde die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen manuell an zwei Netzhautbereiche von 450 um Länge jedes bestimmt, ausgehend von der Peripherie der Retina. Dadurch wurde die Mehrheit der TUNEL-positiven Zellen in der ONL am Tag 3 jedoch gefunden, sterbende Zellen wurden auch in der INL zu diesem Zeitpunkt gesehen (Abbildung 3). Keine relevanten TUNEL-positiven Zellen wurden vor der Behandlung nachweisbar.

Quantifizierung der Zellproliferation:

Proliferation nach Zelltod zu beurteilen, wurden die Netzhaut für wuchernden cell nuclear antigen (PCNA), wie von Tappeiner et al. 9 beschrieben gefärbt. Für die Quantifizierung wurde die Anzahl der PCNA-positiven Zellen wie oben beschrieben manuell bestimmt. Zelltod wurde durch induzierte Proliferation als PCNA-positiven Zellen (Figur 4) gesehen folgt. Dabei wurde das Maximum der proliferierenden Zellen in der INL am Tag 5 zusätzlich gemessenen Zellen im ONL (hauptsächlich Stäbe) zeigten eine positive Färbung für PCNA bis zum Ende der Studie (Tag 30). Wenige PCNA-positiven Zellen in der Randzone ciliary nachweisbar waren vor und zu allen Zeitpunkten nach der Behandlung.

d / 51909 / 51909fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Abbildung 1:. Sehschärfe Messung der Sehschärfe bei erwachsenen Zebrafisch nach der Anwendung von 150 mg / L MNU. Signifikante Abnahme der Sehschärfe mit einem Minimum an Tag 3 nach der Behandlung wurde durch vollständige Genesung folgte, beginnend am Tag 5 bis Tag 30 (Mittelwert ± SD, n = 3).

Figur 2
Figur 2: Histologie Beispiele von H & E gefärbten histologischen Schnitten der Zebrafisch Netzhaut an der Basislinie (A) und 3 (B), 8 (C), 15 (D) und 30 (E) Tage nach der Behandlung MNU.. CN, Kegel Kerne; RN, Stäbchenkerne; INL, innere Körnerschicht; GC, Ganglienzellschicht. Die Pfeile markieren Zellhaufen in der INL. Maßstab entspricht 50 um.


Abbildung 3:. TUNEL-positiven Zellen TUNEL-positiven Zellen (rot) in der Zebrafisch Netzhaut am Tag 3 nach der MNU-Behandlung. Die Zellen wurden hauptsächlich im ONL sind, aber wurden auch in der INL gefunden. Panel A zeigt die Steuerung, während Panel B zeigt die Bilder nach der MNU-Behandlung. Maßstabsleiste zeigt an, 50 um.

Figur 4
Figur 4:. PCNA-positiven Zellen PCNA-positive Zellen (rot) in Zebrafisch Retina am Tag 5 nach der MNU Behandlung im Vergleich zu der Kontrollprobe. Panel A zeigt die Steuerung, während Panel B zeigt die Bilder nach der MNU-Behandlung. Maßstabsleiste zeigt an, 100 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bisher hat unsere Gruppe die MNU Modell der Photorezeptordegeneration von Nagetieren in den Zebrafisch-System 9 übertragen. Die folgenden Ereignisse wurden beschrieben und anschließend für bis zu 30 Tage. In dieser Zeit trat vollständige Netzhaut morphologischen Degeneration und Regeneration nach der ersten Behandlung. Erstens zeigt die Histologie eine reduzierte Stange Zellzahl von Tag 3 auf mit einem Minimum an Tag 8. Entsprechend identifiziert TUNEL-Färbung Apoptose von Stäbchen-Photorezeptoren 3 Tage nach MNU-Behandlung. Regeneration beginnt in der INL am Tag 3, mit einem Maximum an Tag 5. ONL, bis zum Ende der Beobachtungszeit mit einem Maximum an Tag 5. Dies ist im Gegensatz zu der INL wo keine erhöhte Proliferation proliferierenden Zellen beobachtet werden wurde nach Tag 15. Der ciliare Randzone beobachtet wird, ist die einzige Stelle der Netzhaut, wo einige PCNA-positiven Zellen wurden in der unbehandelten Netzhaut. Dies zeigt eine Fläche mit ständig Netzhautneurogenese throughout Lebensdauer 14. Die Identifizierung der bei der Regeneration von Photorezeptoren pharmakologisch beschädigt im Zebrafisch beteiligt Zelltypen war nicht im Fokus dieses Manuskript. Doch in früheren Veröffentlichungen der Prozess zu regenerierenden Zellen in der INL, die vorgeschlagen wurden, um Müllerzellen 9,17,18 verfolgt worden sein.

In der vorliegenden Studie haben wir ebenfalls bewertet funktionelle Veränderungen in der MNU-induzierte Zebrafisch-Modell. Um die visuelle Funktion bei erwachsenen Fische zu quantifizieren, Beurteilung des OKR angewendet worden, eine von mehreren Techniken, um zuverlässig messen die Sehschärfe (VA) von Kleintieren 19. Dadurch wird die OKR, basierend auf einer angeborenen Verhalten, braucht nicht vor zeitraubend Ausbildung der Tiere 20. Darüber, wie der OKR wiederholt unabhängig von der Zusammenarbeit der Tiere hervorgerufen werden, und die großen Augen leicht beobachtet werden kann, ist Beurteilung des OKR eine ideale Methode, um die Sehschärfe Durin folgeng Degeneration und Regeneration im Zebrafisch. OKR Messungen in der vorliegenden Studie zeigte eine abnehmende Sehschärfe bis Tag 3, gefolgt von einer vollständigen Wiederherstellung der Sehfunktion an Tag 30. Dies ist in Übereinstimmung mit den histologischen De- und regenerativen Veränderungen nach MNU-Anwendung, die ein Maximum von Apoptose bei Shows Tag 3.

Ein Vorteil des Modells ist seine Einfachheit als MNU ist schnell zuzubereiten und können direkt in den Wassertank des Zebrafisches aufgelöst werden. Behandlung von Zebrafisch mit MNU ist in einer Stunde durchgeführt. Die Anzahl der Fische, die in Massen behandelt werden können, ist nur durch die Größe des Beckens begrenzt. Insgesamt ermöglicht diese einfache Induktion von Retina-Degeneration in einer Vielzahl von Zebrafisch ohne die Notwendigkeit einer Manipulation der Fische. Daher ist dieses Modell weniger invasiv als andere Modelle der Netzhautdegeneration, die intravitreale oder chirurgische Techniken induziert 21-23 verwenden, und es kann dadurch eine bessere Reproduzierbarkeit aufweisen.

In der Regel ist dies Zebrafisch MNU Modell ein vielseitiges Instrument zur Photorezeptor-Degeneration spezifischer zu induzieren und die folgende Regeneration nicht nur morphologisch, sondern auch funktionell zu visualisieren. Daher sind wir zuversichtlich, dass das Modell hilft, die Degeneration und Regeneration Prozess in der sensorischen Netzhaut im Allgemeinen besser zu verstehen und eröffnet die Möglichkeit, ihre Ergebnisse mit dem Säugersystem zu vergleichen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland A6283
Ammonia Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 294993 0.80%
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 05470
Dako Pen Dako, Glostrup, Danmark S2002
DAPI mounting medium Vector Labs, Burlingame, CA, USA H-1200
Eosin Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 45260
Ethanol Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 2860 100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland E10521 Tricaine
Eukitt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 3989
Goat anti-rabbit Alexa 594 Life Technologies, Zug, Switzerland  A11012
Goat normal serum Dako, Glostrup, Danmark X0907
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 320331 0.20%
In situ Cell Death Detection Kit Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland 11684795910 TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution Merck, Darmstadt, Germany 109249
Methylnitrosourea (MNU) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland N4766 Toxic
OptoMotry CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada n.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5368
Proteinase K Dako, Glostrup, Danmark S3004
Rabbit anti-PCNA  Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA sc-33756
Superfrost Plus glass slides Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany 10149870
Tris buffered saline (TBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5912
Trizma base Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P1379
Xylene Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain University of Fribourg, Dept. of Biology n.a. Own fish facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51, (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6, (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29, (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, (1), 10 (2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45, (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92, (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).More

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter