Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

doi: 10.3791/51909 Published: October 20, 2014

Summary

במסמך זה אנו מדגימים כימות של דה ברשתית והתחדשות והשפעתה על תפקוד ראייה באמצעות -nitrosourea N -methyl- N בדג הזברה המבוגר. מספרי קולטי אור אובדן של חדות ראייה והירידה היו במעקב על ידי התפשטות בשכבת הגרעין הפנימית. התחדשות מורפולוגית ופונקציונלית מלאה התרחשה 30 ימים לאחר הטיפול הראשוני.

Abstract

מחלות רשתית ניווניות, רטיניטיס פיגמנטוזה למשל, עם וכתוצאה מכך חשבון נזק קולטי אור עבור רוב אובדן הראייה בעולם התעשייתי. מודלים של בעלי החיים הם בעלי חשיבות מכרעת ללימודי מחלות כגון. בהקשר זה רעלן קולטי האור ספציפי -nitrosourea N -methyl- N (MNU) כבר בשימוש נרחב במכרסמים כדי לגרום פרמקולוגית ניוון רשתית. בעבר, הקמנו מודל מושרה MNU רשתית ניוון בדג הזברה, עוד מערכת מודל פופולרית במחקר חזותי.

הבדל מרתק ליונקים הוא נוירוגנזה המתמשכת ברשתית דג הזברה מבוגרת והתחדשותו לאחר פגיעה. כדי לכמת תצפית זו יש לנו עובדי מדידות חדות ראייה בדג הזברה המבוגר. וכך, רפלקס optokinetic שימש למעקב שינויים תפקודיים בדגים שאינם מורדמים. זה היה בתוספת היסטולוגיה, כמו גם staini immunohistochemicalng לאפופטוזיס (TUNEL) וההתפשטות (PCNA) כדי לתאם שינויים מורפולוגיים פיתוח.

לסיכום, אפופטוזיס של קולטני אור מתרחש שלושה ימים לאחר טיפול MNU, אשר מלווה ירידה ניכרת של תאים בשכבה החיצונית הגרעינית (ONL). לאחר מכן, התפשטות של תאים בשכבת הגרעין הפנימי (INL) וONL הוא ציין. בזאת, אנו מגלים שלא רק היסטולוגית אך מלאים גם התחדשות תפקודית מתרחשת על פני מסלול של 30 ימים זמן. עכשיו אנחנו ממחישים את השיטות לכמת ומעקב דה דג הזברה רשתית והתחדשות באמצעות MNU בוידאו בפורמט.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חזון הוא התחושה חיונית ביותר לאדם ויש לו ירידת הערך שלה השפעה חברתית וכלכלית גבוהה. בעולם המפותח, מחלות ניווניות ברשתית הן הסיבה המובילה לאיבוד ראייה ועיוורון בקרב אנשים מבוגרים 1. הסיבה למרבית המחלות רשתית ניווניות מובנת רק בחלקו ופתרונות טיפוליים כדי להחזיר את החזון אבוד הם מאוד מוגבלים. רטיניטיס פיגמנטוזה הוא דוגמא אופיינית למחלה ניוונית של רשתית עם אובדן קולטי אור העיקרי 2-3. N -methyl- -nitrosourea N (MNU) גורם לניוון רשתית ולכן בשימוש נרחב במכרסמים מודל מחלות עם מוות של תאי קולטי אור עיקריים 4. זה סוכן אלקילציה ומוביל לגידולים שפירים וממאירים, אשר מופיעים בדרך כלל מספר חודשים לאחר החשיפה 5-7. בנוסף, הוא גורם למוות של תאי קולטי אור ספציפיים בתוך תקופת תצפית לטווח קצר. וכך, אובדן structu שכבת הרשתיתמחדש ודילול רשתית משמעותי נצפה באופן תלוי ריכוז. תאי גליה רשתית הופעלו, אך לא חלה שינויים באפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נמצאו. אפופטוזיס הקשורות במתח reticulum (ER) endoplasmic נראה המסלול העיקרי של פעולת MNU ברשתית 8.

יש לנו לאחרונה הצגתי MNU כמודל כימי כדי לגרום לניוון קולטי אור בדג הזברה 9. , בין שאר, דג הזברה (Danio rerio) הפכה להיות חשובה במחקר חזותי בגלל הדמיון של מערכת הראייה שלה לזה של בעלי חוליות אחרות 10. הרשתית החיצונית מכילה קולטני האור, שניתן לקבץ לארבעה סוגים שונים קונוס עם רגישויות שיא באולטרה הסגול, קצר, בינוני, ואורך גל של הספקטרום הנראה לעין ארוכה וסוג קולטי אור מוט אחד. בשכבת הגרעין הפנימית (INL), גופי התא של הפרעה דו קוטבית, וinterneurons אופקיים, amacrine נמצאים, כמו well כסומה התא של תאי גליה מולר. בשכבת plexiform החיצוני (OPL) הקשרים סינפטיים בין קולטני אור והרשתית הפנימית נוצרים, ואילו שכבת התא הקרובה ביותר לעדשה היא שכבת תא גנגליון (GC), שרכיבים יוצר אקסונים ארוכים המרכיבים את עצב הראייה ומערכת הראייה . קשרים סינפטיים בין תאי הגנגליון והתאים בשכבת הגרעין הפנימי נוצרים בשכבה הפנימית plexiform (IPL) 11. הרשתית נמצאת מחוץ לרשתית נוירו ומקיפה מגזרים חיצוניים קולטי האור עם microvilli הפסגה ארוך 12. יתר על כן, דג הזברה הוא משובי ומסוגלים להצמיח מחדש מוח פצוע, רשתית, חוט השדרה, לב ורקמות אחרות 13 מאוד. כאשר נזק לרשתית מתרחשת, תאים בINL, אשר נחשבו לתאי מולר, מופעלים ויש להם הפוטנציאל להתמיין לסוגי תאים ברשתית שונים. בנוסף, הם גם ליצור אבות מוט, אשר ממוקמים בONL. כך אחרurce שמספק את הרשתית של דג הזברה מבוגרת עם תאים חדשים הוא האזור השולי הריסים. יש צורך במקור זה כדי להשיג צפיפות קבועה של קולטני אור מוט בעין דג הזברה גדלה ברציפות 14.

מודל MNU יכול לשמש כגישת ניוון / התחדשות פשוטה לשחזור לרקמת רשתית. בשל דמיון מסוים של תהליכים ביולוגיים בדג זברה ובבני אדם זה יכול לפתוח את הדלתות כדי לזהות מסלולים מעורבים מוות של תאים ולהקרין תרופות נוירו פוטנציאליות. בהתבסס על מחקר קודם מהקבוצה שלנו, אנחנו עכשיו להמחיש את השיטות של מודל דג הזברה-Induced MNU זו של דה ברשתית והתחדשות כתוצאה מכך לרבות שינויים פונקציונליים עם פי מעבדה קטעי וידאו 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים דבקו בהצהרה לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר של האגודה לחקר חזון אופתלמולוגיה (ארוו).

.1 בעלי חיים

  1. לשמור על דג הזברה wild-type (Danio rerio) של זן AB (אורגון) בגילים שבין 6-12 חודשים בתנאים סטנדרטיים במים עם טמפרטורה של 26.5 מעלות צלזיוס ו14/10 שעה מחזור אור / 15 כהה.
  2. פעל בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים של המוסדות המעורבים לניסויים בבעלי החיים לאחר שאושר על ידי לשכת הווטרינרית המחוזית.

.2 MNU טיפול

  1. הכן מים המכילים חומר יבש 150 מ"ג / L של -nitrosourea -methyl- N N (MNU). זהירות! MNU הוא רעיל; עלול לגרום לסרטן, נזק גנטי תורשתי או לפגיעה בעובר.
  2. דגירה דג הזברה במים המכילים MNU ל60 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. יש לשטוף את דג הזברה במהירות עםמים וטריים לשים את הדגים לאקווריום חדש בלי MNU. לשמור על דגים בתנאים סטנדרטיים כל עוד רצוי לניסויים.

.3 מדידת חדות ראייה

  1. להפעיל את מערכת optomotor, לבחור 'בדיקה' מהתפריט ולהגדיר את האפשרויות ל" מדרגות פשוטות "," חדות (תדר) "ו16" אקראיים / נפרדים ".
  2. התקן בקבוק עירוי מלא ב500 מ"ל מים על 1 מ 'מעל מערכת optomotor.
  3. הנח דג הזברה אחד בחדר הבדיקה ולחבר אותו לבקבוק העירוי. מניחים את חדר הבדיקה במערכת optomotor.
  4. התחל את המדידה ולבחון את תנועות עיניים בזמן אמת על מסך המחשב. וכך, תגובה חיובית ("כן") מוגדרת כקפיצות האלה ברציפות בכיוון הנכון, ואילו תשובה שלילית ("לא") מייצג תנועות עיניים אקראיות דומות לאלה שנצפו עם תחנהשבכות האר"י. אם העיניים של תערוכת דג הזברה שלוש או יותר תגובות optokinetic שלאחר מכן (OKR), לחץ על 'כן'; אם לא, לחץ על 'לא'.
  5. חלץ את חדות הראייה, שחושב על ידי התוכנה על ידי קביעת הסף של התדר המרחבי של גירוי optokinetic, תחת "תוצאות" בתפריט.

.4 היסטולוגיה

  1. להרדים את דג הזברה על ידי מנת יתר של אתיל methanesulfonate 3-aminobenzoate (200-300 מ"ג / ליטר) וenucleate העיניים.
  2. לתקן את כל העיניים בparaformaldehyde 4% (PFA) שבנאגר מלוח פוספט (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 12 ולאחר מכן מייבשים את הדגימות בסדרת אלכוהול מדורגת.
  3. להטביע את הדגימות בפרפין, לחתוך 5 מיקרומטר סעיפים דרך ראש עצב הראייה (ONH) ולעגן אותן בשקופיות זכוכית.
  4. כתם חלקי פרפין deparaffized עם hemalum למשך 4 דקות וטובלים את השקופיות פעמיים במים מזוקקים ואחריו 0.2% ACI הידרוכלוריתאמוניה ד ו0.8%. כתם החלקים עם eosin במשך 3 דקות לאחר הפיתוח של הכתמת hemalum במים ברז לדקות לפחות 10. (H & E).
  5. להטביע את השקופיות מיובשים בהרכבה בינונית ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ האור.

.5 אימונוהיסטוכימיה

  1. transferase deoxynucleotidyl מסוף תיוג סוף dUTP ניק (TUNEL)
    1. דגירה סעיפי deparaffinized עם 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. שטוף את החלקים שלוש פעמים עם טריס שנאגרו מלוח (TBS) במשך 5 דקות כל אחד.
    2. דגירה הסעיפים בתערובת 50 μl תגובת TUNEL (10% פתרון תיוג ו90% פתרון אנזים) בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לשטוף שלוש פעמים עם כפות במשך 5 דקות כל אחד.
    3. הר השקופיות עם ההרכבה בינונית המכיל DAPI ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. הגרעיני Antigen מכתים תא מתרבים (PCNA)
    1. מרתיחים את חלקי deparaffinized במאגר אחזור אנטיגן (טריס-EDTA 0.05 + Tween% 20, pH 9.0) במשך 3 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. לחסום עם 100 μl פתרון החסימה (TBS + 10% + 1% אלבומין בסרום שור העז הנורמלי בסרום, pH7.6) בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
    2. כתם עם נוגדנים ראשוניים אנטי PCNA בדילול 1: 200 בתא humidified על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף שלוש פעמים עם כפות + Tween 20 ל5 דקות כל אחד.
    3. לסיים את זיהוי עם הנוגדנים משני המתאימים בדילול 1: 500 בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
    4. הר השקופיות עם ההרכבה בינונית המכיל DAPI ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חדות ראייה:

ניסיוני ההגדרה [תדר המרחבי: 0.042 חוגים / תואר (ג / ד); ניגודיות: 100%; מהירות סחיפה: 20 מעלות / שני (ד / src); בחזרה בהיקות אור: 152 cd / m 2] של מחקר זה אפשרה הערכת OKR של דג הזברה מבוגרת. משך הממוצע של מדידת VA היה על 5 - 10 דקות לכל דג הזברה, אשר נסבל ההליך היטב. חדות ראייה לפני חשיפת MNU היו .577 ± 0.014 מחזורים / תואר (ד / ג). איור 1 מציג את קורס חדות הראייה לאחר היישום של 150 מ"ג / ליטר MNU. החל מיום 1, המדידות גילו ירידה ניכרה בחדות ראייה, הגיעו לערכי מינימום ביום 3 החל מהיום 8, גידול של חדות ראייה מתרחש, מראה התאוששות מלאה של חדות ראייה 30 ימים לאחר חשיפת MNU. לניתוח סטטיסטי ANOVA חד סטרי ואחריו מבחן ההשוואה מרובה של Bonferroni יושם. ובכך, את ההבדלים בbetwe חדות ראייהen תחילת המחקר ומדידות לאחר הטיפול היה משמעותי עבור ימים 1, 3, 5, ו -8 (p <0.001, כל אחד), אך לא לימים 15 ו30.

הערכה היסטולוגית של ניוון הרשתית:

צביעת H & E שימשה לכמת שינויים מורפולוגיים בעין של דג הזברה לנקודת זמן אחת (n = 3) בתחילת מחקר, כמו גם 3, 8, 15, ו30 ימים לאחר הטיפול (איור 2). היסטולוגיה בוצעה כפי שתואר על ידי et Tappeiner אל. 9. וכך, ניוון רשתית, כולל שיבוש היווצרות INL והחלל של ONL נצפה החל משעת היום .3 מספר התאים בשכבת תא גנגליון (GC), השכבה הפנימית הגרעינית (INL) ומספר המוט (RN) וחרוט קולטני אור (CN) נקבע באופן ידני 250 מיקרומטר ממרכז ONH משני צידי סעיף העיניים (גודל השטח נספר מתייחס לסעיף ברשתית של 100 מיקרומטר אורך). הניוון היה במעקב במשך 30ימים לאחר טיפול עם הפסד המרבי מוט onl מצא ביום .8 בכך, מספר קולטני אור מוט (RN) ירד ל 82% ביום 3, 71% ביום 8 ו77% בימים 15 ו30 של המספר המקורי . יתר על כן, הצטברות של צבירי תאים נמצאה, בעיקר בINL.

כימות של אפופטוזיס:

מכתים TUNEL בוצע על פי היצרן (בתא אתר המוות ערכת זיהוי; רוש יישומים מדעי, Rotkreuz, שווייץ). ניוון הרשתית שנצפה לאחר טיפול MNU נגרם על ידי אפופטוזיס. זה התגלה על ידי צביעת TUNEL חיובית בשכבות תאים שונות ברשתית החושית. לכימות, מספר התאים TUNEL חיובי נקבע באופן ידני בשני אזורים ברשתית של אורך מיקרומטר 450 כל, החל משעת הפריפריה של הרשתית. וכך, הרוב המכריע של תאי TUNEL החיוביים נמצא בONL ביום .3 עם זאת, תאים מתים נראו גם בINL שבנקודת הזמן (איור 3). אין תאי TUNEL החיוביים רלוונטיים היו לגילוי לפני הטיפול.

כימות של התפשטות תאים:

כדי להעריך התפשטות לאחר מוות של תאים, רשתיות היו מוכתמות למתרבות אנטיגן התא הגרעיני (PCNA) כפי שתואר על ידי et Tappeiner אל. 9. לכימות, מספר התאים PCNA חיובי נקבע באופן ידני כפי שתואר לעיל. המוות של תאים בעקבות התפשטות מושרה נתפסה כתאי PCNA חיובי (איור 4). וכך, המרבי של תאים מתרבים נמדד בINL ביום .5 בנוסף, תאים בONL (בעיקר מוטות) הראו צביעה חיובית לPCNA עד סוף המחקר (היום 30). תאי PCNA החיוביים כמה באזור השולי הריסים היו לגילוי לפני ובכל זמן הנקודות לאחר טיפול.

ד / 51,909 / "width =" 51909fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1:. חדות ראיית מדידה של חדות ראייה בדג זברה מבוגרת לאחר היישום של 150 מ"ג / ליטר MNU. ירידה משמעותית של חדות ראייה עם מינימום ביום 3 לאחר הטיפול בעקבות התאוששות מלאה, המתחילה ביום 5, עד שיום 30 (ממוצע ± SD, n = 3).

איור 2
איור 2: היסטולוגיה דוגמאות של H & E המוכתמות סעיפים היסטולוגית של רשתית דג הזברה בתחילת המחקר (א) ו 3 (ב), 8 (ג), 15 (ד '), ובימי 30 (E) לאחר הטיפול בMNU.. CN, גרעיני קונוס; RN, גרעיני מוט; INL, שכבת גרעין פנימית; GC, שכבת תא גנגליון. החיצים לסמן צבירי תאים בINL. סרגל קנה מידה שווה 50 מיקרומטר.

gether.within-page = "תמיד"> איור 3
תאי תאי TUNEL החיובי TUNEL חיובי (אדום) ברשתית דג הזברה ביום 3 לאחר טיפול MNU: איור 3.. התאים היו ממוקמים בעיקר בONL אבל נמצאו גם בINL. הלוח מתאר את השליטה, ואילו לוח ב 'מציג את התמונות לאחר טיפול MNU. סרגל קנה מידה מצביע 50 מיקרומטר.

איור 4
איור 4:. תאי PCNA חיובי תאי PCNA חיוביים (אדום) ברשתית דג הזברה ביום 5 לאחר טיפול MNU בהשוואה למדגם השליטה. הלוח מתאר את השליטה, ואילו לוח ב 'מציג את התמונות לאחר טיפול MNU. סרגל קנה מידה מצביע 100 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעבר, הקבוצה שלנו העבירה את מודל MNU של ניוון קולטי אור ממכרסמים למערכת דג הזברה 9. האירועים שלאחר מכן תוארו ואחריו לתקופה של עד 30 ימים. בפרק זמן זה ניוון רשתית מלא מורפולוגיים והתחדשות התרחשו לאחר הטיפול הראשוני. ראשית, היסטולוגיה מגלה תא מוט מופחת לספור מיום 3 בעם מינימום ביום .8 במקביל, מכתים TUNEL מזהה אפופטוזיס של קולטני אור מוט 3 ימים לאחר טיפול MNU. התחדשות מתחילה בINL ביום 3, עם מקסימום ביום .5 בONL, יכולים להיות שנצפו תאים מתרבים עד תום תקופת התצפית עם מקסימום ביום .5 זאת בניגוד לINL בהם לא עלה תפוצה נצפה לאחר יום 15. האזור השולי הריסים הוא המיקום היחיד של הרשתית שבו חלק מהתאים החיוביים PCNA נמצאו ברשתית שלא טופלה. זה מצביע על אזור עם throug נוירוגנזה כל הזמן ברשתיתהחיים hout 14. זיהוי של סוגי תאים מעורבים בהתחדשות של קולטני אור פגוע פרמקולוגית בדג הזברה לא היה בפוקוס של כתב היד הזה. עם זאת, בפרסומים קודמים התהליך כבר העביר לתאים מתחדשים בINL שהוצעו להיות תאי מולר 9,17,18.

במחקר הנוכחי, יש לנו גם הערכה של שינויים תפקודיים במודל דג הזברה-Induced MNU. כדי לכמת תפקוד ראייה בדגים בוגרים, הערכה של OKR כבר מועסק, אחד מכמה טכניקות למדידת חדות הראייה (VA) של בעלי חיים קטנים 19 באופן מהימן. וכך, OKR, המבוסס על התנהגות מולדת, לא צריך הכשרת זמן רב מראש של בעלי החיים 20. יתר על כן, כפי שOKR ניתן הושר שוב ושוב באופן עצמאי לשיתוף הפעולה של בעלי החיים, והוא יכול בקלות להיות שנצפה בעיניים הגדולות, הערכה של OKR היא שיטה אידיאלית למעקב חדות ראייה דוריןניוון g והתחדשות בדג זברה. מדידות OKR במחקר הנוכחי גילו חדות יורדות חזותיות עד יום 3, ואחריו שיקום של תפקוד הראייה ביום 30. זה בהתאם לשינויי דה ומשובים היסטולוגית לאחר יישום MNU מלא שמראה מרבי של אפופטוזיס ב יום 3.

יתרון של המודל הוא הפשטות שלו כMNU הוא מהיר להכנה ויכולה להיות מומס ישירות במכל המים של דג הזברה. טיפול בדג הזברה עם MNU מתבצע בשעה אחת. מספר הדגים שיכול להיות מטופלים בהמוניהם מוגבל רק על ידי הגודל של האקווריום. בסך הכל, זה מאפשר אינדוקציה פשוטה של ​​ניוון רשתית במספר רב של דג הזברה ללא הצורך במניפולציה של דגים בודדים. לכן, המודל הזה הוא פחות פולשני בהשוואה לדגמים אחרות של ניוון רשתית המשתמשות בטכניקות מושרה זגוגית או כירורגית 21-23 וזה ובכך עשוי להפגין שחזור טוב יותר.

באופן כללי, מודל MNU דג הזברה זה הוא כלי תכליתי כדי לגרום לניוון קולטי אור ספציפי וכדי להמחיש את ההתחדשות הבאה לא רק מורפולוגית, אלא גם מבחינה תפקודית. לכן, אנו בטוחים כי המודל עוזר להבין את הניוון ותהליך התחדשות ברשתית החושית באופן כללי טוב יותר ופותח את האפשרות להשוואת תוצאותיה עם המערכת של היונקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland A6283
Ammonia Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 294993 0.80%
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 05470
Dako Pen Dako, Glostrup, Danmark S2002
DAPI mounting medium Vector Labs, Burlingame, CA, USA H-1200
Eosin Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 45260
Ethanol Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 2860 100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland E10521 Tricaine
Eukitt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 3989
Goat anti-rabbit Alexa 594 Life Technologies, Zug, Switzerland  A11012
Goat normal serum Dako, Glostrup, Danmark X0907
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 320331 0.20%
In situ Cell Death Detection Kit Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland 11684795910 TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution Merck, Darmstadt, Germany 109249
Methylnitrosourea (MNU) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland N4766 Toxic
OptoMotry CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada n.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5368
Proteinase K Dako, Glostrup, Danmark S3004
Rabbit anti-PCNA  Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA sc-33756
Superfrost Plus glass slides Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany 10149870
Tris buffered saline (TBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5912
Trizma base Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P1379
Xylene Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain University of Fribourg, Dept. of Biology n.a. Own fish facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51, (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6, (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29, (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, (1), 10 (2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45, (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92, (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).More

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter