Summary
Qui dimostriamo quantificazione dei de- retina e la rigenerazione e il suo impatto sulla funzione visiva con N -methyl- N -nitrosourea in zebrafish adulto. Perdita di acuità visiva e diminuito il numero dei fotorecettori sono state seguite dalla proliferazione nello strato nucleare interno. Completa rigenerazione morfologica e funzionale si è verificato 30 giorni dopo il trattamento iniziale.
Abstract
Malattie degenerative della retina, ad esempio, retinite pigmentosa, con conseguente danno conto fotorecettore per la maggior parte della perdita della vista nel mondo industriale. I modelli animali sono di fondamentale importanza per lo studio di tali malattie. A questo proposito la tossina specifica-fotorecettore N -methyl- N -nitrosourea (MNU) è stato ampiamente utilizzato nei roditori per indurre farmacologicamente degenerazione retinica. In precedenza, abbiamo stabilito un modello di degenerazione retinica MNU indotta in zebrafish, un altro sistema modello popolare in ricerca visiva.
Una differenza affascinante per i mammiferi è la neurogenesi persistente nell'adulto retina zebrafish e la loro rigenerazione dopo un danno. Per quantificare questa osservazione abbiamo impiegato le misure di acuità visiva in zebrafish adulto. In tal modo, il riflesso optocinetica è stata utilizzata per seguire i cambiamenti funzionali nei pesci non anestetizzato. Questo è stato integrato con istologia e immunoistochimica staining per apoptosi (TUNEL) e la proliferazione (PCNA) di correlare i cambiamenti morfologici in via di sviluppo.
In sintesi, l'apoptosi dei fotorecettori avviene tre giorni dopo il trattamento MNU, che è seguita da una marcata riduzione delle cellule nello strato nucleare esterno (ONL). Successivamente, la proliferazione delle cellule nello strato nucleare interno (INL) e ONL si osserva. Qui, ci rivelano che non solo istologica completa, ma anche una rigenerazione funzionale si verifica nel corso di un corso di 30 giorni. Ora si illustrano i metodi per quantificare e seguire zebrafish de- retina e rigenerazione utilizzando MNU in un video formato.
Introduction
Vision è il senso più essenziale per l'essere umano e la sua perdita di valore ha un elevato impatto socio-economico. Nel mondo sviluppato, le malattie degenerative della retina sono la principale causa di perdita della vista e cecità tra gli adulti più anziani 1. La causa della maggior parte delle malattie degenerative della retina è solo parzialmente compreso e soluzioni terapeutiche per recuperare la vista perduta sono molto limitate. La retinite pigmentosa è un tipico esempio di una malattia degenerativa della retina con perdita dei fotorecettori primaria 2-3. N -methyl- N -nitrosourea (MNU) induce degenerazione retinica e quindi è ampiamente usato nei roditori per modellare malattie con fotorecettori primaria morte cellulare 4. Si tratta di un agente alchilante e porta a tumori benigni e maligni, che di solito compaiono diversi mesi dopo l'esposizione 5-7. Inoltre, provoca la morte cellulare dei fotorecettori specifica entro un periodo di osservazione di breve termine. In tal modo, la perdita dello strato structu retinare e significativo assottigliamento della retina sono stati osservati in maniera concentrazione-dipendente. Cellule gliali retiniche sono stati attivati, ma non sono state trovate variazioni nel epitelio pigmentato retinico (RPE). Reticolo endoplasmatico (ER) apoptosi legati allo stress sembra essere la via principale di azione MNU nella retina 8.
Abbiamo recentemente introdotto MNU come modello chimico per indurre degenerazione dei fotorecettori in zebrafish 9. Tra le altre ragioni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato importante nella ricerca visiva a causa della somiglianza del suo sistema visivo a quello di altri vertebrati 10. La retina esterna contiene i fotorecettori, che possono essere raggruppati in quattro diversi tipi di coni con sensibilità di punta in nell'ultravioletto, a breve, medio e lungo lunghezze d'onda dello spettro visibile e una canna tipo di fotorecettori. Nello strato nucleare interno (INL), i corpi cellulari dei bipolari, orizzontali, amacrine e interneuroni si trovano, come well come il soma cellulare delle cellule gliali Muller. Nello strato plessiforme esterno (OPL) si formano i contatti sinaptici tra fotorecettori e la retina interna, mentre lo strato di cellule più vicino alla lente è lo strato di cellule gangliari (GC), quali componenti formano lunghi assoni che costituiscono il nervo ottico e delle vie ottiche . Contatti sinaptici tra le cellule gangliari e le cellule nello strato nucleare interno si formano nello strato plessiforme interno (IPL) 11. La RPE si trova al di fuori della retina neurosensoriale e circonda i segmenti esterni dei fotorecettori con lunghi microvilli apicale 12. Inoltre, il pesce zebra è altamente rigenerativa e in grado di far ricrescere cervello lesionato, retina, midollo spinale, cuore, e di altri tessuti 13. Quando si verifica un danno retinico, le cellule del INL, che si pensa siano le cellule Müller, sono attivati e hanno il potenziale di differenziarsi in vari tipi di cellule retiniche. Inoltre, essi generano anche progenitori asta, che si trovano nella ONL. Un altro modopubblico Fonte che alimenta la retina di zebrafish adulto con nuove cellule è la zona marginale ciliare. Questa fonte è necessaria per ottenere una densità costante di bastoncelli nel zebrafish continua crescita dell'occhio 14.
Il modello MNU può essere utilizzato come un approccio semplice e riproducibile degenerazione / rigenerazione di tessuto retinico. A causa di alcune somiglianze di processi biologici in zebrafish e negli esseri umani questo potrebbe aprire le porte ad individuare percorsi di morte cellulare coinvolti e per lo screening potenziali farmaci neuroprotettivi. Sulla base di un precedente studio del nostro gruppo, che ora illustreremo i metodi di questo modello zebrafish MNU indotta di de- retina e conseguente rigenerazione compresi i cambiamenti funzionali con funzione video laboratorio 9.
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Protocol
Tutti gli esperimenti hanno aderito alla Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research dell'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO).
1. Gli animali
- Mantenere il wild-type zebrafish (Danio rerio) del ceppo AB (Oregon) di età compresa tra 6-12 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un 14/10 luce hr / ciclo scuro 15.
- Seguire le linee guida per la cura degli animali delle istituzioni coinvolte per gli esperimenti sugli animali dopo l'approvazione da parte dell'Ufficio cantonale di veterinaria.
2 MNU Trattamento
- Preparare acqua contenente 150 mg / l di sostanza secca di N -methyl- N -nitrosourea (MNU). ATTENZIONE! MNU è tossico; può provocare il cancro, alterazioni genetiche ereditarie o danneggiare i bambini non ancora nati.
- Incubare zebrafish in acqua contenente la MNU per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Sciacquare zebrafish rapidamente conacqua dolce e mettere il pesce in un nuovo serbatoio di pesce senza MNU. Mantenere i pesci in condizioni standard il tempo desiderato per gli esperimenti.
3. acuità visiva di misura
- Avviare il sistema optomotor, scegliere 'testing' dal menu e impostare le opzioni di "Simple Staircase", "Acuity (Freq)" e "Randomized / separato" 16.
- Installare una bottiglia di infusione riempita con 500 ml di acqua circa 1 m sopra il sistema optomotor.
- Mettere uno zebrafish nella camera di esame e collegarlo alla bottiglia di infusione. Posizionare la camera di esame nel sistema optomotor.
- Avviare la misura e osservare il movimento degli occhi in tempo reale sullo schermo del computer. In tal modo, una risposta positiva ("sì") è definito come saccadi consecutive nella direzione giusta, mentre una risposta negativa ("no") rappresenta movimenti casuali degli occhi simili a quelli osservati con la stazionegrigliati ary. Se gli occhi della mostra zebrafish tre o più successive risposte optokinetic (okr), premere 'sì'; se non, premere 'no'.
- Estrarre l'acuità visiva, che è stato calcolato dal software determinando la soglia della frequenza spaziale dello stimolo optocinetico, alla voce "Risultati" nel menu.
4. Istologia
- Euthanize il zebrafish da un'overdose di etil 3-aminobenzoato methanesulfonate (200-300 mg / L) e di enucleare gli occhi.
- Fissare l'intero occhi in 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per 12 ore e poi disidratare i campioni in una serie graduata di alcol.
- Incorpora i campioni in paraffina, tagliati 5 micron sezioni attraverso la testa del nervo ottico (TNO) e montarli su un vetrino.
- Colorare le sezioni di paraffina deparaffized con hemalum per 4 min e immergere i vetrini due volte in acqua distillata seguita da 0,2% aci cloridricod e 0,8% di ammoniaca. Colorare le sezioni con eosina per 3 minuti dopo lo sviluppo della colorazione hemalum in acqua di rubinetto per almeno 10 min (H & E).
- Incorporare le diapositive disidratati in mezzo di montaggio e osservare i vetrini al microscopio luce.
5. Immunoistochimica
- Terminal deossinucleotidil transferasi etichettatura fine dUTP nick (TUNEL)
- Incubare le sezioni deparaffinate con 20 mg / ml di proteinasi K a temperatura ambiente per 15 min. Lavare le sezioni tre volte con Tris Buffered Saline (TBS) per 5 minuti ciascuno.
- Incubare le sezioni con 50 microlitri miscela di reazione TUNEL (soluzione di etichettatura 10% e soluzione enzimatica del 90%) in una camera umidificata a 37 ° C per 60 min. Lavare tre volte con TBS per 5 minuti ciascuno.
- Montare i vetrini con terreno contenente DAPI montaggio e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.
- Nucleare di cellule proliferative Antigen (PCNA) colorazione
- Lessare le sezioni deparaffinate nel buffer di recupero dell'antigene (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9.0) per 3 minuti e lavare tre volte con TBS per 5 minuti ciascuno. Blocco con 100 microlitri di blocco a temperatura ambiente la soluzione (TBS + 10% di siero di capra normale + 1% di albumina sierica bovina, pH7.6) per 1 ora.
- Macchia con anti-PCNA anticorpi primari in una diluizione 1: 200 in una camera umidificata a 4 ° C per una notte. Lavare tre volte con TBS + Tween 20 per 5 minuti ciascuna.
- Termina la rilevazione con gli appropriati anticorpi secondari in una diluizione 1: 500 a temperatura ambiente per 1 ora.
- Montare i vetrini con terreno contenente DAPI montaggio e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
Acuità visiva:
Il set-up sperimentale [frequenza spaziale: 0.042 circoli / grado (c / d); contrasto: 100%; velocità di deriva: 20 gradi / secondo (d / src); indietro luminanza luce: 152 cd / m 2] di questo studio ha permesso la valutazione okr di zebrafish adulto. La durata media della misurazione VA era circa 5-10 minuti per ogni zebrafish, che tollerato bene la procedura. L'acuità visiva prima dell'esposizione MNU era 0,577 ± 0,014 cicli / grado (c / d). Figura 1 mostra il corso di acuità visiva dopo l'applicazione di 150 mg / L MNU. A partire dal giorno 1, le misurazioni hanno rivelato una marcata diminuzione dell'acuità visiva, raggiungendo valori minimi al giorno 3 A partire dal giorno 8, con un incremento di acuità visiva si verifica, mostrando un completo recupero dell'acuità visiva 30 giorni dopo l'esposizione MNU. Per l'analisi statistica è stata applicata una ANOVA a una via seguita da test di confronto multiplo di Bonferroni. In tal modo, le differenze di acuità visiva betweit basale e misure dopo il trattamento è stato significativo per i giorni 1, 3, 5, e 8 (p <0.001, ciascuno), ma non per i giorni 15 e 30.
La valutazione istologica della degenerazione retinica:
Colorazione H & E è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti morfologici in un occhio del pesce zebra per ogni punto temporale (n = 3) al basale e 3, 8, 15, e 30 giorni dopo il trattamento (Figura 2). Istologia è stata eseguita come descritto da Tappeiner et al. 9. In tal modo, degenerazione retinica comprese eventuali interruzioni della INL e cavità formazione del ONL stata osservata partendo giorno 3 Il numero delle cellule nello strato delle cellule gangliari (GC), lo strato interno nucleare (INL) e il numero di asta (RN) e cono (CN) fotorecettori sono stati determinati manualmente 250 micron dal centro della TNO su entrambi i lati della sezione dell'occhio (dimensione dell'area contato riferisce ad una sezione retinica di 100 micron di lunghezza). La degenerazione è stata seguita per 30giorni dopo il trattamento con la massima dell'asta onl perdita trovato il giorno 8 In tal modo, il numero di bastoncelli (RN) è sceso al 82% il giorno 3, il 71% il giorno 8 e il 77% nei giorni 15 e 30 del numero originale . Inoltre, è stato trovato accumulo di gruppi di cellule, soprattutto nel INL.
Quantificazione dell'apoptosi:
TUNEL colorazione è stata eseguita secondo il produttore (in situ delle cellule morte kit di rilevamento; Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Svizzera). La degenerazione retinica osservata dopo il trattamento MNU è stata causata da apoptosi. Lo rivela positivo colorazione TUNEL in diversi strati di cellule nella retina sensoriale. Per la quantificazione, il numero di cellule TUNEL-positivi è stata determinata manualmente in due aree retiniche di 450 micron di lunghezza ciascuno, a partire dalla periferia della retina. In tal modo, la maggior parte delle cellule TUNEL-positivi è stata trovata nel ONL al giorno 3 Tuttavia, le cellule morenti sono stati osservati anche nel INL a quel punto di tempo (Figura 3). Non particolarmente cellule TUNEL-positivi erano rilevabili prima del trattamento.
La quantificazione della proliferazione cellulare:
Per valutare la proliferazione dopo la morte delle cellule, retine sono state colorate per antigene nucleare della proliferazione cellulare (PCNA), come descritto da Tappeiner et al. 9. Per la quantificazione, il numero di cellule PCNA-positivi è stata determinata manualmente come descritto sopra. La morte cellulare è stata seguita da proliferazione indotta visto come cellule PCNA-positive (Figura 4). In tal modo, il massimo di cellule proliferanti è stata misurata nel INL il giorno 5 Inoltre, le cellule del ONL (principalmente aste) hanno mostrato positività per PCNA fino alla fine dello studio (giorno 30). Poche cellule PCNA-positive nella zona marginale ciliare erano rilevabili prima e in tutti i punti temporali dopo il trattamento.
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Figura 1:. Acuità visiva Misura della acuità visiva in zebrafish adulto dopo l'applicazione di 150 mg / L MNU. Significativa diminuzione di acuità visiva con un minimo al giorno 3 post trattamento è stato seguito da un recupero completo, a partire dal giorno 5, fino al giorno 30 (media ± SD, n = 3).
Figura 2: Istologia Esempi di H & E macchiato sezioni istologiche della retina zebrafish al basale (A) e 3 (B), 8 (C), 15 (D), e 30 (E) giorni dopo il trattamento MNU.. CN, nuclei cono; RN, nuclei asta; INL, strato nucleare interno; GC, strato di cellule gangliari. Le frecce indicano gruppi di cellule nel INL. Barra di scala uguale a 50 micron.
Cellule cellule TUNEL-positive TUNEL-positivi (rossi) nella retina zebrafish al giorno 3 dopo il trattamento MNU: Figura 3.. Le cellule sono state situate principalmente nella ONL ma sono stati trovati anche nel INL. Pannello A raffigura il controllo, considerando pannello B mostra le immagini dopo il trattamento MNU. Barra della scala indica 50 micron.
Figura 4:. Cellule PCNA-positive cellule PCNA-positivo (rosso) della retina zebrafish al giorno 5 dopo il trattamento MNU rispetto al campione di controllo. Pannello A raffigura il controllo, considerando pannello B mostra le immagini dopo il trattamento MNU. Barra della scala indica 100 micron.
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Discussion
In precedenza, il nostro gruppo ha trasferito il modello MNU di degenerazione dei fotorecettori dai roditori nel sistema zebrafish 9. Gli eventi successivi sono stati descritti e seguiti fino a 30 giorni. In questo periodo di tempo completa degenerazione morfologica della retina e la rigenerazione avvenuti dopo il trattamento iniziale. In primo luogo, istologia rivela una conta di cellule asta ridotto da 3 giorni su con un minimo al giorno 8 Corrispondentemente, TUNEL colorazione identifica l'apoptosi dei fotorecettori rod 3 giorni dopo il trattamento MNU. Rigenerazione inizia nel INL al giorno 3, con un massimo a giorno 5. ONL, cellule proliferanti possono essere osservati fino al termine del periodo di osservazione con un massimo a giorno 5 Ciò è in contrasto con la INL dove nessun aumento della proliferazione è stato osservato dopo giorno 15. La zona marginale ciliare è l'unico luogo della retina, dove sono stati trovati nella retina trattata alcune cellule PCNA positive. Questo indica una zona con costante retinica neurogenesi througHout vita 14. L'identificazione dei tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione dei fotorecettori danneggiati farmacologicamente in zebrafish non era il focus di questo manoscritto. Tuttavia, in pubblicazioni precedenti il processo è stato rintracciato alle cellule rigeneranti della INL che sono state proposte per essere cellule Müller 9,17,18.
Nel presente studio, abbiamo anche valutato i cambiamenti funzionali nel modello zebrafish MNU indotta. Per quantificare la funzione visiva nei pesci adulti, valutazione del okr è stato impiegato, una delle diverse tecniche per misurare in modo affidabile l'acuità visiva (VA) di piccoli animali 19. In tal modo, il okr, sulla base di un comportamento innato, non ha bisogno prima in termini di tempo di formazione degli animali 20. Inoltre, come la okr può essere ripetutamente suscitato indipendentemente cooperazione degli animali, e gli occhi grandi può essere facilmente osservato, la valutazione del okr è un metodo ideale per seguire l'acuità visiva During degenerazione e rigenerazione in zebrafish. Misurazioni okr nel presente studio ha rivelato una acuità visiva decrescente fino al giorno 3, seguita da una restaurazione completa della funzione visiva al giorno 30 Ciò è in accordo con i cambiamenti istologici de- e rigenerative dopo l'applicazione MNU che mostra un massimo di apoptosi in giorno 3.
Un vantaggio del modello è la sua semplicità come MNU è veloce da preparare e può essere sciolto direttamente nel serbatoio dell'acqua del zebrafish. Trattamento di zebrafish con MNU viene eseguita in un'ora. Il numero di pesci che può essere trattata in massa è limitato solo dalle dimensioni del serbatoio di pesce. Nel complesso, questo permette semplice induzione della retina degenerazione in un gran numero di zebrafish senza la necessità di manipolazione di individui. Pertanto, questo modello è meno invasivo rispetto ad altri modelli di degenerazione della retina che utilizzano intravitreali o chirurgiche tecniche indotte 21-23 e può quindi presentare una riproducibilità migliore.
In generale, questo modello MNU zebrafish è uno strumento versatile per indurre degenerazione specifica-fotorecettori e di visualizzare il seguente rigenerazione non solo morfologicamente, ma anche funzionale. Pertanto, siamo fiduciosi che il modello aiuta a comprendere meglio il processo di rigenerazione e degenerazione della retina sensoriale in generale e si apre la possibilità di confrontare il suo risultato con il sistema dei mammiferi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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