Methylnitrosourea (MNU) -indusert Retinal degenerasjon og regenerasjon i Sebrafisk: histologiske og funksjonelle egenskaper

Summary

Heri vi demonstrere kvantifisering av retinal de- og regenerering og dens innvirkning på visuell funksjon ved hjelp av N-metyl-N -nitrosourea i den voksne sebrafisk. Tap av synsskarphet og redusert fotoreseptorlidelser tall ble etterfulgt av spredning i indre kjernefysiske lag. Komplett morfologisk og funksjonell regenerering skjedde 30 dager etter første behandling.

Abstract

Retinal degenerative sykdommer, f.eks retinitis pigmentosa, med resulterende fotoreseptoren skader står for det meste av synstap i den industrielle verden. Dyremodeller er av avgjørende betydning for å studere slike sykdommer. I denne forbindelse fotoreseptoren spesifikke toksin N-metyl-N -nitrosourea (MNU) har vært mye brukt i gnagere til farmakologisk indusere retinal degenerasjon. Tidligere har vi etablert en MNU-indusert retinal degenerasjon modell i sebrafisk, en annen populær modell system i visuell forskning.

En fascinerende forskjell for pattedyr er den vedvarende neurogenesis i den voksne sebrafisk netthinnen og regenerering etter skade. For å kvantifisere denne observasjonen vi har ansatt synsskarphet målinger i den voksne sebrafisk. Derved ble den optokinetiske refleks brukes til å følge funksjonelle endringer i ikke-bedøvet fisk. Dette ble supplert med histologi samt immunhistokjemisk staining for apoptose (TUNEL) og spredning (PCNA) å korrelere utviklings morfologiske endringer.

I sammendrag, oppstår apoptose av fotoreseptorene tre dager etter behandling MNU, som blir fulgt av en markert reduksjon av celler i det ytre kjernelaget (onl). Deretter blir proliferasjon av celler i den indre kjernesjikt (INL) og onl observert. Heri viser vi at det ikke bare en fullstendig histologisk men også en funksjonell restitusjon skjer over et tidsforløp på 30 dager. Nå illustrerer vi de metoder for å kvantifisere og følge opp sebrafisk retinal de- og regenerering ved hjelp MNU i en video-format.

Introduction

Vision er den mest avgjørende betydning for mennesket og dets funksjon har en høy samfunnsøkonomisk effekt. I den industrialiserte verden, retinal degenerative sykdommer er den ledende årsak til synstap og blindhet blant eldre voksne ^en. Årsaken til de fleste degenerative retinal sykdommer er bare delvis forstått og terapeutiske løsninger for å gjenvinne tapt visjon er svært begrenset. Retinitis pigmentosa er et typisk eksempel på en retinal degenerativ sykdom med primære fotoreseptoren tap ^2-3. N-metyl-N -nitrosourea (MNU) induserer retinal degenerasjon og er derfor mye brukt i gnagere å modellere sykdommer med primære fotoreseptoren celledød ^4. Det er et alkyleringsmiddel, og fører til benigne og maligne tumorer, som vanligvis vises flere måneder etter eksponering ^5-7. I tillegg fører det spesifikke fotoreseptoren celledød i en kortvarig observasjonsperioden. Dermed tap av retinal lag strukturer;re og betydelig retinal tynning ble observert på en konsentrasjonsavhengig måte. Retinal gliaceller celler ble aktivert, men ingen endringer i retinal pigment epitel (RPE) ble funnet. Endoplasmatiske retikulum (ER) stressrelatert apoptose synes å være den viktigste sti av MNU handling i netthinnen ^åtte.

Vi har nylig introdusert MNU som en kjemisk modell for å indusere fotoreseptoren degenerasjon i sebrafisk ^ni. Blant andre grunner, har sebrafisk (Danio rerio) blitt viktig i visuell forskning på grunn av likheter i sin visuelle system til det av andre virveldyr ^10. Den ytre retina inneholder fotoreseptorer, som kan grupperes i fire ulike kjegle typer med peak følsomhet i ultrafiolett, kort, middels og lang bølgelengden til synlig spektra og en stang fotoreseptoren type. I indre kjernefysiske lag (INL), blir cellen likene av bipolare, horisontale og amacrine interneurons funnet, som well som cellen soma av Muller gliaceller celler. I den ytre plexiform lag (OPL) synaptiske kontakter mellom fotoreseptorene og den indre retina er dannet, mens cellelaget nærmest linsen er ganglion cellelaget (GC), som komponentene danner lange axoner omfattende den optiske nerven og den optiske veis . Synaptiske kontakter mellom ganglion-celler og cellene i den indre kjernesjikt er dannet i den indre plexiform lag (IPL) ^11. RPE ligger utenfor nevrosensorisk netthinnen og omgir fotoreseptorlidelser ytre segmenter med lang apikal microvilli ^12. Videre er sebrafisk sterkt regenerativ og i stand til å vokse lesioned hjerne, retina, ryggmarg, hjerte og andre vev ^13. Når retinal skade oppstår, celler i INL, som er antatt å være Muller-celler, er aktivert og har potensial til å differensiere i ulike retinale celletyper. I tillegg har de også generere stang stamceller, som er plassert i onl. En annen slikurce som forsyner netthinnen av voksen sebrafisk med nye celler er ciliary marginal sone. Denne kilden er nødvendig for å oppnå en konstant tetthet på stangfotoreseptorer i det kontinuerlig voksende sebrafisk øye ^14.

Den MNU modellen kan brukes som en enkel og reproduserbar degenerering / regenerering tilnærming for netthinnevevet. På grunn av visse likheter av biologiske prosesser i sebrafisk og hos mennesker dette kunne åpne dørene for å identifisere involverte celledødsveier og til skjermen potensielle nervecellene narkotika. Basert på en tidligere studie fra vår gruppe, har vi nå illustrere metodene for denne MNU-indusert sebrafisk-modellen av retinal de- og påfølgende regenerering inkludert funksjonelle endringer med henhold laboratorium videoer ^ni.

Protocol

Alle eksperimenter overholdt erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Visjon Forskning av Foreningen for Research in Vision og Ophthalmology (ARVO). 1. Dyr Opprettholde villtype sebrafisk (Danio rerio) av AB (Oregon) stamme i alderen mellom 6-12 måneder under standardbetingelser i vann med en temperatur på 26,5 ° C og en 14/10 timers lys / mørke syklus 15. Følg retningslinjene dyr vare på de involverte institusjonene for dyreforsøk etter go…

Representative Results

Synsskarphet: Den eksperimentelle oppsett [romlig frekvens: 0.042 sirkler / grad (c / d); Kontrast: 100%; drift hastighet: 20 grader / sekund (d / src); bakgrunnslys luminans: 152 cd / m 2] av denne studien aktivert okr vurdering av voksen sebrafisk. Gjennomsnittlig varighet av VA-måling var ca 5-10 minutter for hver sebrafisk, som tolerert behandlingen godt. Synsskarphet før MNU eksponering var 0.577 ± 0.014 sykluser / grad (c / d). Figur 1 viser synsskarphet …

Discussion

Tidligere har vår gruppe overført MNU modell av fotoreseptoren degenerasjon fra gnagere inn i sebrafisk system ^ni. De påfølgende hendelsene ble beskrevet og fulgt i opptil 30 dager. I denne tidsperioden komplett retinal morfologisk degenerasjon og regenerasjon skjedde etter den første behandlingen. Først avslører histologi en redusert stang celle telle fra dag 3 på med et minimum på dag 8. Tilsvarende identifiserer TUNEL farging apoptose av stang fotoreseptorer 3 dager etter MNU behandling. Regenerer…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
TrizmaÒ base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility