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Neuroscience

एक Published: September 24, 2014 doi: 10.3791/51948
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Department of Mechanical Engineering, San José State University, 2J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 3Department of Physiology, Emory University School of Medicine, 4Department of Biological Sciences, San José State University

Summary

स्नायु संवेदी न्यूरॉन्स proprioceptor संकेतन में शामिल है और यह भी चयापचय राज्य और चोट से संबंधित घटनाओं पर रिपोर्ट कर रहे हैं. हम खिंचाव सक्रिय पेशी afferents पर अध्ययन के लिए इन विट्रो मांसपेशी तंत्रिका तैयारी में एक वयस्क माउस का वर्णन.

Abstract

स्नायु संवेदी न्यूरॉन्स पेशी spindles और Golgi कण्डरा अंगों proprioception के लिए आवश्यक लंबाई और बल परिवर्तन सांकेतिक शब्दों innervating. अतिरिक्त अभिवाही फाइबर metabolite buildup, तापमान, और nociceptive उत्तेजनाओं सहित पेशी पर्यावरण की अन्य विशेषताओं, निगरानी. कुल मिलाकर, संवेदी न्यूरॉन्स की असामान्य सक्रियण आंदोलन विकारों या पुराने दर्द सिंड्रोम हो सकता है. हम वयस्क माउस में खिंचाव पैदा अभिवाही प्रतिक्रियाओं की इन विट्रो अध्ययन के लिए extensor digitorum longus (EDL) मांसपेशी और तंत्रिका के अलगाव का वर्णन. संवेदी गतिविधि एक चूषण इलेक्ट्रोड के साथ तंत्रिका से दर्ज की गई है और व्यक्तिगत afferents स्पाइक छँटाई सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. इन विट्रो तैयारी संज्ञाहरण के संभावित घालमेल कर दिया है या बदल पेशी छिड़काव के बिना संवेदी afferents पर अच्छी तरह से नियंत्रित अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं. यहाँ हम पहचान करने और फैलाने के लिए मांसपेशी धुरी afferents की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. महत्वपूर्ण बात है,इस तैयारी भी दवा आवेदन और चूहों में शक्तिशाली आनुवंशिक दृष्टिकोण और रोग मॉडल का समावेश निम्नलिखित पेशी afferents, प्रतिक्रिया गुणों के अन्य subtypes के अध्ययन का समर्थन करता है.

Introduction

कंकाल की मांसपेशियों मांसपेशी पर्यावरण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र प्रदान कि संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा innervated रहे हैं. स्नायु स्पिंडल अत्यधिक extrafusal मांसपेशी फाइबर के साथ समानांतर में स्थित हैं कि intrafusal मांसपेशी फाइबर से बना समझाया संरचनाओं विशेष कर रहे हैं. Spindles समूह आइए और मांसपेशियों की लंबाई और intrafusal फाइबर स्वर में परिवर्तन गतिशील innervating गामा मोटर न्यूरॉन्स 1 द्वारा नियंत्रित किया जाता है सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि द्वितीय afferents द्वारा innervated रहे हैं. समूह आईबी afferents मांसपेशी फाइबर और उनके पट्टा सम्मिलन के बीच तैनात है और मांसपेशियों में संकुचन 2 के दौरान उदाहरण के लिए पेशी बल में परिवर्तन, के प्रति संवेदनशील होते हैं. समूह आइए, आईबी और द्वितीय afferents उपयुक्त मोटर नियंत्रण में एड्स कि proprioceptive प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं. पेशी भर में स्थित मांसपेशियों afferents की अतिरिक्त आबादी (समूह तृतीय और चतुर्थ) metabolite buildup, nociceptive उत्तेजनाओं की उपस्थिति, और मांसपेशियों तापमान संकेत की सेवा 4 पर आधारित उनकी फायरिंग पैटर्न बदल सकते हैं. Nociceptors की सक्रियता संतुलन या आंदोलन 6 के साथ समस्याओं को जन्म दे सकता है पुराने दर्द राज्यों 5 और मांसपेशियों proprioceptors से न्यायपालिका सिगनल की प्रेरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हम (हैं दिखाया 2-4 महीने पुराने C57BL / 6 चूहों से प्रतिक्रियाएं) दोनों लिंगों के वयस्क चूहों से पेशी संवेदी न्यूरॉन रिसेप्टर अंत की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो तैयारी में एक अलग मांसपेशी तंत्रिका का उपयोग करें. माउस स्तनधारियों में पढ़ाई के लिए मॉडल आनुवंशिक प्रजाति है. यह तैयारी sciatic तंत्रिका के गहरे peroneal शाखा और extensor digitorum longus (EDL) मांसपेशी, कम पैर के पार्श्व भाग में पाया peroneal समूह की एक तेजी से चिकोटी मांसपेशियों के अलगाव की आवश्यकता है. EDL अक्सर मांसपेशी सिकुड़ा गुण 7-9 अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ते हैआसान कर रहे हैं कि ndons अलग और बाकी पर और उचित संकुचन कर्तव्य चक्र 10 के साथ पर्याप्त वाचाल ऑक्सीजन की आपूर्ति की अनुमति देने के लिए काफी छोटा है. (उदाहरण soleus और tibialis पूर्वकाल के लिए) इस क्षेत्र में अन्य मांसपेशियों समान आकार के हैं और इस तैयारी आसानी से इन मांसपेशियों से afferents से रिकॉर्ड करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. एक चूषण इलेक्ट्रोड पेशी संवेदी अभिवाही फायरिंग रिकॉर्ड करने के लिए तंत्रिका की कटौती अंत पर रखा गया है. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पहचान और स्पाइक छँटाई सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अपने कील आकार के आधार पर विश्लेषण किया जा सकता है. स्नान में या तंत्रिका पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड मांसपेशियों में संकुचन पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मांसपेशियों की लंबाई और बल नियंत्रित और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम का उपयोग कर मापा जा सकता है. इसी प्रकार इन विट्रो तैयारी EDL 11 चूहे में टी में, चूहे चौथे lumbrical पैर के अंगूठे की मांसपेशी में समूह आइए और द्वितीय धुरी afferents 12 और समूह III और IV पेशी afferents समूह तृतीय और चतुर्थ पेशी afferents अध्ययन करने के लिए कृन्तकों में इस्तेमाल किया गया है मेंमाउस तल पेशी 13 वह.

इन विट्रो प्रणाली औषधीय पहुंच और तापमान और पीएच तरह perfusate और physiochemical चर के प्रत्यक्ष नियंत्रण के फायदे हैं. इन विट्रो दृष्टिकोण विवो में संभावित संज्ञाहरण और मांसपेशियों छिड़काव स्थिति का घालमेल कर दिया समाप्त. मांसपेशी तंत्रिका तैयारी afferents पर एक गड़बड़ी की सीधी प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, vivo में 14 या पूर्व 3 की तैयारी के रूप में बलिदान विवो के साथ संभव है कि धुरी संवेदनशीलता और अन्य एकीकृत प्रतिक्रियाओं के गामा अपवाही मॉडुलन अध्ययन करने की क्षमता इस तैयारी में कोई neuronal सेल निकायों रहे हैं.

यह तैयारी पहले से रैंप की एक बैटरी के लिए माउस मांसपेशी धुरी afferents की प्रतिक्रिया विशेषताएँ और फैला है और कंपन पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और यह कि माउस धुरी अभिवाही respons निर्धारित किया गया थातों ऐसे चूहों, बिल्लियों, और मनुष्य के रूप में अन्य प्रजातियों की रिपोर्ट में उन लोगों के लिए समान थे. माउस धुरी अभिवाही प्रतिक्रियाओं 34 डिग्री सेल्सियस निरपेक्ष फायरिंग दरों में तेजी से थे, हालांकि 24 डिग्री सेल्सियस और 34 डिग्री सेल्सियस तापमान स्नान दोनों में समान हो पाया और afferents 15 परिवर्तन तेजी से लंबाई के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे. हम इस तैयारी मांसपेशी धुरी afferents की पहचान और अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे नीचे का वर्णन. इसके अलावा, इस तैयारी को आसानी से एक दवा या रोग राज्य या मिश्रित अन्य चर (जैसे, उम्र, लिंग, जीन पीटा) के जवाब में संवेदी afferents के गुणों की तुलना करने, अन्य मांसपेशियों अभिवाही उपप्रकार 13 की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

Protocol

उपयुक्त राष्ट्रीय और संस्थागत नैतिकता पशु प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले प्राप्त किया जाना चाहिए.

EDL मांसपेशियों और तंत्रिका की 1 हटाना

  1. वजन और गहराई से 5% isofluorane साथ एक vaporizer प्लस एक 1.5 एल / मिनट ऑक्सीजन का प्रवाह दर या तल पर isofluorane लथपथ कपास के साथ एक बेल जार का उपयोग साँस isofluorane साथ एक वयस्क माउस anesthetize.
  2. माउस गहरा anesthetized है और एक पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं है कि सुनिश्चित करें. जल्दी बड़े, तेज कैंची या एक गिलोटिन का उपयोग कर सिर काटना.
  3. कैंची का उपयोग पसलियों के माध्यम से एक उदर midline कटौती करें और आंतरिक अंगों को निकालने के.
  4. गर्दन क्षेत्र से त्वचा लोभी और पैर अतीत यह खींच कर पशुओं की त्वचा.
  5. कूल्हों के ऊपर काटने से पैर निकालें और carbogenated ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक पकवान, (95% ओ 2, 5% सीओ 2) कम कैल्शियम, उच्च मैग्नीशियम बाइकार्बोनेट खारा बफर समाधान contai में चमड़ी पैर जगहमिमी में निंग: 128 NaCl, 1.9 KCl, 1.2 के.एच. 2 पीओ 4, 26 NaHCO 3, 0.85 CaCl 2, 16 में 6.5 4 MgSO, और 10 ग्लूकोज (7.4 ± 0.05 का पीएच). कम कैल्शियम, उच्च मैग्नीशियम समाधान विच्छेदन के दौरान synaptic प्रसारण को रोकता है.
  6. डिश में पैर पृष्ठीय पक्ष रखें और पैरों को पिन और घुटने और टखने के जोड़ों एक 90 डिग्री के कोण पर इतना है कि सुई या कीट पिन का उपयोग कर नीचे कूल्हों. जगह में ऊतक पकड़ करने के लिए प्रत्येक पैर के अंत और पूर्वकाल और कूल्हों और जांघों में से प्रत्येक पर एक पिन पर एक पिन रखें.
  7. Castroviejo वसंत कैंची का प्रयोग, जांघों पर पेशी के ऊपर परत उठा और सीधे नीचे sciatic तंत्रिका बेनकाब करने की कटौती एक midline बनाने. sciatic तंत्रिका सिर्फ शीर्ष पेशी परत के नीचे स्थित है और कूल्हों के पास अपनी विदाई से फीमर ऊपर चलाता है जब तक सिर्फ संयुक्त घुटने से पहले आम peroneal और tibial तंत्रिका में शाखाओं.
  8. पीओ तक sciatic तंत्रिका ऊपर मांसपेशी निकालेंपूर्णांक जिस पर flexor hallucis longus (FHL) मांसपेशी में गहरी peroneal तंत्रिका शाखा dives दिख रहा है.
  9. # 55 संदंश का प्रयोग, टिबिया के औसत दर्जे का पक्ष में हैं जो gastrocnemius और soleus मांसपेशियों, से यह मुक्त करने के लिए peroneal शाखा के आसपास संयोजी ऊतक काटना. Gastrocnemius और soleus मांसपेशियों की tendons कट और ध्यान से तंत्रिका के नीचे से उन्हें हटा दें.
  10. प्रादेशिक सेना के नीचे छिपा edl के साथ, FHL, EDL, और tibialis पूर्वकाल (टीए): संयुक्त से औसत दर्जे का पार्श्व टखने में तीन अलग कण्डरा बंडलों को बेनकाब करने के लिए टिबिया के पार्श्व पक्ष पर सतही मांसपेशियों निकालें.
  11. , टखने संयुक्त पर टीए कण्डरा कट edl से ऊपर और दूर टीए उठा, और इसे दूर करने के घुटने के पास पेशी काटा.
  12. टखने में FHL कण्डरा कट और तंत्रिका FHL में प्रवेश करती है जहां क्षेत्र तक पहुंचने के लिए इसे वापस उठा. सिर्फ उस बिंदु से नीचे कट और FHL पेशी के ~ 2/3 को हटा दें.
  13. स्थिति के रूप में कूल्हे के करीब sciatic तंत्रिका कटअसंभव और धीरे गहरी peroneal शाखा को छोड़कर सभी तंत्रिका शाखाओं दूर पट्टी.
  14. बड़े वसंत कैंची का उपयोग दोनों टखने और घुटने के जोड़ों में EDL tendons काटें.
  15. तेज कैंची का प्रयोग, घुटने पर टिबिया हड्डी के माध्यम से काटने से आसपास के ऊतकों से EDL, शेष FHL और तंत्रिका को हटाने और जांघ के माध्यम से रास्ते के मध्य में. इतना है कि सिर्फ EDL, FHL और तंत्रिका का हिस्सा बने हुए शेष टिबिया हड्डी दूर कटौती.

ऊतक स्नान में EDL मांसपेशियों और तंत्रिका के 2 बढ़ते (चित्रा 1 ए)

  1. प्रयोग की शुरुआत से पहले, ऊतक स्नान तैयार करते हैं. लगातार साथ स्नान छिड़कना ऑक्सीजन (100% 2 हे) सिंथेटिक मध्य द्रव (SIF) 123 NaCl, 3.5 KCl (मिमी में) युक्त, 0.7 MgSO 4, 1.7 नाह 2 पीओ 4, 2.0 2 CaCl, 9.5 एनएसी 6 एच 11 हे ( सोडियम gluconate), 5.5 ग्लूकोज, 7.5 सूक्रोज, और 10 एन -2-hydroxyethylpiperazine- 'एन -2-EThanesulfonic एसिड (HEPES); पीएच 7.4 ± 0.05 17. 15-30 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर की सिफारिश की है. स्नान के नीचे, एक घुड़सवार ऊतक पोस्ट और एक बल और लंबाई नियंत्रक के लिए एक पर्वत (लगभग स्नान आयामों को तय दो उत्तेजक इलेक्ट्रोड के साथ 25 एमएल क्षमता का एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्नान दिखाया 8.5 सेमी एक्स 3 सेमी एक्स 1 सेमी; विनिर्देशों के लिए ) सामग्री / उपकरण की तालिका देखें.
  2. पृथक मांसपेशी तंत्रिका संभाल और ऊतक स्नान में जगह के लिए शेष FHL ऊतक का प्रयोग करें. डिश के तल पर Sylgard का एक छोटा सा टुकड़ा प्लेस और मांसपेशियों को स्थिर करने के लिए शेष FHL ऊतकों के माध्यम से एक कीट पिन का उपयोग करें.
  3. दोनों tendons टाई और एक ऊतक संदेश का अंत और बल और लंबाई नियंत्रक का लीवर हाथ को अन्य प्रत्यय 6-0 रेशम टांके का उपयोग करें (विनिर्देशों के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें). व्यावहारिक है कि छोटी से छोटी सीवन लंबाई का उपयोग करें. आप tendons करार किया है के बाद कीट पिन और Sylgard निकालें. नोट: आसान सुविधाजनक बनाने के लिएलीवर के लिए कनेक्शन के तार का एक छोटा सा टुकड़ा epoxy के साथ लीवर हाथ में एक "जम्मू" आकार का हुक में तुला और तय किया जा सकता है हाथ. सिवनी तो तार से बंधा बजाय लीवर हाथ पर छोटे छेद में पिरोया जा सकता है.
  4. पहले एक गिलास micropipette खींचने का उपयोग करके एसए 16 गिलास से चूषण इलेक्ट्रोड बनाओ (हीट = 286, = 0, वेग = 150, समय = 200 खींचो); वापस टिप तोड़ने और स्वयं एक 3 मिमी घटना के बारे में जब तक वहाँ एक sharpening पत्थर पर पीस. (इलेक्ट्रोड उत्पाद जानकारी के लिए योजनाबद्ध और टेबल सामग्री का / उपकरण के लिए आंकड़े 1 बी -1 सी देखें) एक से नमूना करना चाहती तंत्रिका के क्षेत्र के आधार पर 100 माइक्रोन - 10 के बीच की यात्रा की नोक भीतरी व्यास को एक microforge का उपयोग टिप पिघला.
  5. SIF साथ भीतरी चांदी के तार करने के लिए एक premade कांच चूषण इलेक्ट्रोड भरें.
  6. इलेक्ट्रोड में तंत्रिका की कटौती अंत सक्शन और एक अंतर एम्पलीफायर के सकारात्मक पोर्ट से कनेक्ट. एक chlorided चांदी के साथ इलेक्ट्रोड लपेटेंheadstage के नकारात्मक बंदरगाह को जोड़ता है कि तार. Headstage की जमीन बंदरगाह के स्नान से एक दूसरे chlorided चांदी के तार चलाकर SIF स्नान जमीन. इसके अलावा छिड़काव पंप के माध्यम से शुरू की बिजली के शोर को कम करने के लिए कई बिंदुओं पर फैराडे पिंजरे में छिड़काव ट्यूबिंग जमीन.
  7. एक चिकोटी संकुचन प्रेरित करने के लिए ऊतक स्नान में पेशी के दोनों ओर बढ़ इलेक्ट्रोड के माध्यम से पेशी उत्तेजित. वैकल्पिक रूप से तंत्रिका की कटौती अंत पर एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड जगह है. एक चोटी सिकुड़ा बल मनाया जाता है जब तक उत्तेजक वोल्टेज में वृद्धि और फिर supramaximal वोल्टेज (0.5 मिसे नाड़ी चौड़ाई) तक पहुँचने के लिए एक अतिरिक्त 15% की वृद्धि वोल्टेज. बीच में एक 10 सेकंड आराम के साथ, supramaximal वोल्टेज पर चिकोटी संकुचन जारी है, लेकिन एक चोटी सिकुड़ा बल जब तक मांसपेशियों की लंबाई बदलती पेशी के इष्टतम लंबाई (एल ओ) को खोजने के लिए पहुँच जाता है. सभी लंबाई रैंप और कंपन इस लेंग में पेशी के साथ शुरू होगावें.
  8. मांसपेशी तंत्रिका तैयारी ऊतक स्नान तापमान तक पहुँचने के लिए और सामान्य synaptic प्रसारण के लिए एक कम कैल्शियम समाधान में विच्छेदन निम्नलिखित ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए बाद में डेटा संग्रह से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए स्नान में रहने की अनुमति दें.
  9. कमरे के तापमान के अलावा किसी अन्य के तापमान पर डेटा इकट्ठा करने के लिए, मांसपेशियों के निकट ऊतक स्नान में एक तापमान जांच जगह है. धीरे धीरे ऊतक स्नान बेस प्लेट के माध्यम से गर्म पानी पंप से तापमान को स्नान को ले आओ. एक स्थिर तापमान बनाए रखने में मदद करने के लिए SIF जलाशय के चारों ओर मिट्टी माइक्रोवेव हीटिंग पैड लपेटें.

3 डाटा संग्रह

  1. , एक धुरी अभिवाही के रूप में एक अभिवाही पहचान दोहराया चिकोटी एक बार वितरित एक 0.5 मिसे supramaximal वोल्टेज प्रोत्साहन द्वारा उत्पादित संकुचन हर दूसरे दौरान neuronal गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए. नोट: मांसपेशी धुरी afferents चिकोटी संकुचन 18,19 (चित्रा 2) के दौरान थामने चाहिए.
  2. उपयोग दाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर अलग गति में और अलग अलग लंबाई की लंबाई परिवर्तनों को लागू करने के लिए. इस कार्य को स्वचालित (दी हिस्सों को अनुकूलित करने के बारे में स्क्रिप्ट और दिशाओं का स्क्रीनशॉट के लिए पूरक जानकारी देखें) करने के लिए एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करें. 2.5%, 5%, और 7.5% एल ओ के खिंचाव लंबाई और / सेकंड में 15 से 20, 40, या 60% एल ओ के खिंचाव गति पर 4 सेकंड के लिए रैंप और पकड़ हिस्सों को लागू करें. नोट: आवश्यक वोल्टेज करने वाली मिलीमीटर रूपांतरण कारक के लिए विशिष्ट बल और लंबाई नियंत्रक के लिए उपयोगकर्ता पुस्तिका देखें.
  3. प्रयोग के अंत में, अधिक से अधिक Isometric धनुस्तंभीय संकुचन (500 मिसे ट्रेन, 120 हर्ट्ज ट्रेन आवृत्ति, 0.5 मिसे नाड़ी चौड़ाई, supramaximal वोल्टेज) का उपयोग कर 24 डिग्री सेल्सियस पर पेशी स्वास्थ्य का निर्धारण. जैसा कि पहले बताया मूल्यों के शिखर सिकुड़ा बल की तुलना करें (~ 24 एन / 2 सेमी 9,20).

Representative Results

पेशी afferents की प्रतिक्रिया का अध्ययन किया जा रहा है जो अभिवाही उप प्रकार पर निर्भर करता है, perturbations की एक किस्म निम्न दर्ज किया जा सकता है. मांसपेशियों में संकुचन और रैंप और खिंचाव पकड़ के लिए मांसपेशी धुरी afferents के प्रतिनिधि प्रतिक्रियाओं यहाँ दिखाए जाते हैं. एक धुरी अभिवाही के रूप में एक अभिवाही की पहचान करने के लिए, चिकोटी संकुचन संकुचन 18,19 दौरान फायरिंग में एक ठहराव है यह देखने के लिए एक बार हर दूसरे (0.5 मिसे नाड़ी चौड़ाई) दिया जाता है. 2 चित्रा neuronal गतिविधि और मांसपेशियों में तनाव का एक प्रतिनिधि का पता लगाने के दौरान पता चलता है इन चिकोटी संकुचन. धुरी afferents के लिए उम्मीद के रूप में नहीं neuronal गतिविधि, चिकोटी संकुचन के दौरान मनाया जाता है. दर्ज अभिवाही एक समूह आईबी Golgi कण्डरा अंग अभिवाही, संकुचन के दौरान दर फायरिंग में वृद्धि हुई थी, तो उम्मीद होगी.

नियंत्रण की स्थिति 34 डिग्री सेल्सियस पर सबसे 24 डिग्री सेल्सियस पर एक नियमित फायरिंग पैटर्न (~ 12 आवेगों / सेकंड के साथ afferents और ~ 32 आवेगों / धारा के तहत) मांसपेशी धुरी afferents हैं. धुरी afferents के एक सबसेट केवल आग खिंचाव के दौरान (हमारे हाथ में ~ धुरी afferents का 11%) 15. चित्रा 3A दो मांसपेशी धुरी afferents के एक प्रतिनिधि कच्चे ट्रेस एक रैंप पर प्रतिक्रिया और बल और लंबाई नियंत्रक द्वारा उत्पादित खिंचाव पकड़ से पता चलता है. LabChart की स्पाइक हिस्टोग्राम सुविधा की पहचान और तात्कालिक अलग से दो व्यक्ति न्यूरॉन्स की फायरिंग आवृत्ति (आंकड़े -3 बी -3 सी) का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 अलग मांसपेशी तैयारी एक) extensor digitorum longus (EDL) और innervating sciatic तंत्रिका ऑक्सीजन सिंथेटिक मध्य द्रव (SIF) के साथ perfused एक अलग ऊतक स्नान में बढ़ रहे हैं. एक sucti से जुड़े एक बाह्य एम्पलीफायरइलेक्ट्रोड पर तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड. उपयुक्त सॉफ्टवेयर नियंत्रण और उपायों पेशी बल और लंबाई नियंत्रक के साथ एक दोहरी बल और लंबाई. ऊतक स्नान इलेक्ट्रोड चिकोटी या धनुस्तंभीय संकुचन का उत्पादन करने के लिए उत्तेजनाओं देने. आंतरिक स्नान थाली चैनलों के माध्यम से गर्म पानी पम्पिंग ऊतक स्नान तापमान. बी) खींच लिया गिलास चूषण इलेक्ट्रोड नियंत्रण एक microforge का उपयोग कर उत्पादन किया है कि चूषण इलेक्ट्रोड के लिए आदर्श टिप आकार की ~ 3 मिमी पतला टिप. सी) Magnified चित्रण के साथ. यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

चित्रा 2
संकुचन चिकोटी चित्रा 2 तकला अभिवाही रिस्पांस. Neuronal activitवाई (शीर्ष ट्रेस) और 30 चिकोटी संकुचन से मांसपेशियों में तनाव (नीचे ट्रेस) काले रंग में शीर्ष अतिव्यापी का पता लगाने के साथ आरोपित कर रहे हैं. अभिवाही गतिविधि मांसपेशी धुरी afferents की एक विशेषता प्रतिक्रिया है जो संकुचन प्रेरित तनाव में वृद्धि, के दौरान रुक जाता है. गतिविधि रुका हुआ है जब शीर्ष ट्रेस ऊपर ब्रैकेट और तीर संकुचन के दौरान समय निरूपित.

चित्रा 3
चित्रा 3 तकला अभिवाही प्रतिक्रिया रैंप और मांसपेशियों को एक पकड़) दो afferents (शीर्ष ट्रेस) कच्चा तंत्रिका गतिविधि एक रैंप के दौरान और EDL (नीचे का पता लगाने में दिखाया मांसपेशियों की लंबाई). बी) तात्कालिक फायरिंग आवृत्ति (संस्थान के लिए लागू खिंचाव पकड़ लिए. फादर, ए से एल ओ में गतिविधि का प्रदर्शन इकाई की प्रति सेकंड आवेगों) () नीले रंग में दिखाया गया है. सी) Instantaneकेवल आग खिंचाव के दौरान (नारंगी में दिखाया गया है) कि छोटी इकाई के ous फायरिंग आवृत्ति. दोनों इकाइयों मांसपेशी धुरी afferents 1 की विशेषता है कि खिंचाव के दौरान कील आवृत्ति अनुकूलन दिखा रहे हैं.

Discussion

इस लेख के लक्ष्य के लिए एक अलग माउस मांसपेशी तंत्रिका तैयारी में पेशी धुरी afferents से रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का वर्णन करने के लिए किया गया था. हम माउस धुरी afferents चूहों, बिल्लियों और मनुष्यों 15 से उन के रूप में फैलाने के लिए इसी तरह का जवाब मिल गया है कि, और अन्य प्रयोगशालाओं मांसपेशियों और इन विट्रो में त्वचा दोनों में संवेदी न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए मॉडल जीवों के रूप में चूहों का इस्तेमाल किया है (उदाहरण 3,13 के लिए) .

स्नायु संवेदी afferents 24 डिग्री सेल्सियस और 34 डिग्री सेल्सियस दोनों में कम से कम 6-8 घंटे के लिए रिकॉर्ड किया जा सकता है. EDL और तंत्रिका निपटने को कम करने के लिए, जब भी संभव ऊतक को संभालने के लिए FHL के शेष भाग का उपयोग करें. विच्छेदन के बाद, ऊतक स्नान के तापमान को और सामान्य synaptic प्रसारण को ठीक करने के लिए संतुलित करने की अनुमति देने के लिए डेटा संग्रह शुरू करने के लिए कम से कम 1 घंटे के इंतजार. इससे पहले, मांसपेशियों स्वास्थ्य अधिक से अधिक धनुस्तंभीय कॉन्ट्रा कि निर्धारित करने से इस तैयारी में इस्तेमाल की मांसपेशियों के एक सबसेट पर सत्यापित किया गया थामांसपेशियों द्वारा उत्पन्न ctile बल प्रयोग में 15 की शुरुआत और अंत में दूसरों के द्वारा सूचित किया है कि के समान है.

मांसपेशी धुरी afferents (चित्रा 3) (चित्रा 2) के संकुचन चिकोटी के जवाब में फायरिंग में एक विशेषता को थामने के लिए देख रहे हैं और साथ ही लंबाई में परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया में उम्मीद की तात्कालिक आवृत्ति बढ़ द्वारा इस तैयारी में कार्यात्मक रूप में पहचान की गई. हमारे अनुभव में, नियंत्रण की स्थिति में आग है कि सबसे afferents मांसपेशी धुरी afferents हैं. इस तैयारी (~ 7 मिमी अधिकतम) में बनाए रखा तंत्रिका की लंबाई पेशी अभिवाही उपप्रकार 13 की पहचान करने के लिए अभिवाही चालन वेग मतभेद का उपयोग करने के लिए पर्याप्त समय नहीं है. साथ ही, बिल्लियों और मनुष्यों के विपरीत, गतिशील संवेदनशीलता के उपायों (आगे की चर्चा के लिए विल्किनसन एट अल. 15 देखें) स्पष्ट रूप से चूहों में समूह आइए और द्वितीय afferents अंतर करने में सक्षम नहीं थे. Afferents के अन्य उपप्रकार (यानी., समूह तृतीय और चतुर्थ) आदि, ischemia के लिए मांसपेशियों को उजागर, स्नान पीएच कम, capsaicin, एटीपी, या ब्रैडीकाइनिन तरह 3,13,21-23 पदार्थ जोड़कर उदाहरण के लिए, इस तैयारी में अतिरिक्त कार्यात्मक परीक्षण का उपयोग कर पहचाना जा सकता है चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग एक भी पेशी से एकत्र किया जा सकता है कि डेटा की मात्रा बढ़ जाती है, जो कई संवेदी न्यूरॉन्स से गतिविधि को एक बार में दर्ज होने की अनुमति देता है. यह तैयारी संवेदी न्यूरॉन आबादी प्रतिक्रियाओं या पहचान afferents की प्रतिक्रियाओं पर एक गड़बड़ी के समग्र प्रभाव गेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कील आकार काफी अद्वितीय हैं, तो 4 संवेदी न्यूरॉन्स के लिए ऊपर () Spike2 दोनों (कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन) और LabChart प्रो (ई साधनों इसी तरह प्रदर्शन किया है) सॉफ्टवेयर द्वारा भेदभाव किया जा सकता है. न्यूरॉन्स भेदभाव नहीं किया जा सकता है जहां मामलों में, इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट या टिप व्यास में परिवर्तन आसानी से लागू किया जा सकता है.

इन विट्रो prepar में संक्षेप में, माउस मांसपेशी तंत्रिकासमझना विभिन्न भौतिक perturbations, चोट और बीमारी मॉडल को पेशी संवेदी afferents की प्रतिक्रिया गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक साधारण प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है. साथ ही, यह तैयारी आदर्श ट्रांसजेनिक जानवरों और optogenetic उपकरण सहित चूहों में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण, का लाभ उठाने के लिए अनुकूल है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Force and Length Controller & Tissue Bath Aurora Scientific, Inc. 300C-LR & 809B-IV 
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head Cole Parmer EW-07523-80 & EW-77200-60
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier A-M Systems Model 1800; 700000 & 700500
Simulator Grass
OR
Aurora Scientific, Inc.		 S88
OR
701 C
Dissecting Microscope Swift 892070
Fiber Optic Light Source Fiberlite Model 190
Analog to Digital Board AD Instruments PL3508/P (PowerLab 8/35)
Data Acquisition & Analysis Software AD Instruments LabChart Pro 7
Electrode Holder A-M Systems 672445
Electrode Glass Dagan SA16
Electrode Puller Sutter Instrument Co. P-80/PC
Microforge Narishige MF-9
Isoflourane MWI Veterinary Supply 18627
Surgical Tools
Large Dissecting Scissors Fine Science Tools 14014-17
Large Forceps Fine Science Tools 11000-12
Large Spring Scissors Fine Science Tools 15006-09
#5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
#55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Sharp Scissors Fine Science Tools 14059-11
6-0 Silk Suture Fine Science Tools 18020-50
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF
(Low Calcium solution is equilibriated with 95% O2/5% CO2 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 ± 0.05)
Sodium chloride Sigma S9888-1KG
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 230391-500G
Calcium chloride dihydrate Sigma 223506-500G
Sodium gluconate Sigma S2054-500G
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G
Glucose Sigma G5767-500G
Sucrose Sigma S5016-500G
HEPES Sigma H3375-250G
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Potassium chloride Sigma P3911-500G
Sodium bicarbonate Sigma S6014-500G

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 91 मांसपेशी धुरी मांसपेशियों अभिवाही extensor digitorum longus संवेदी न्यूरॉन्स इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
एक<em&gt; इन विट्रो</emस्नायु afferents की गोलीबारी गुणों के लिए अध्ययन&gt; वयस्क माउस स्नायु तंत्रिका तैयारी
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Franco, J. A., Kloefkorn, H. E.,… More

Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents. J. Vis. Exp. (91), e51948, doi:10.3791/51948 (2014).

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