Introduction
Ovo elektroporasyon DNA 1-5 yapıları ile kısmen in vivo embriyonik yapıların transfect için hızlı ve ucuz bir şekilde temsil ettiği için canlı organizmalar üzerinde genetik araştırmalar sık sık bir model olarak tavuk embriyo kullanın. Örneğin pCIG 6 veya 7 PMES gibi, ilgi konusu gen ile birlikte, bir flüoresan raportör ihtiva eden ve bir transkript şifreleyen bisistronik ekspresyon vektörleri, alt analizi için embriyolar işlemeden önce bir stereo mikroskop altında arzu edilen bir bölgede transfeksiyon kalitesinin hızlı doğrulama sağlar.
DNA dizilimi son gelişmeler ile, RNA-seg 8,9 kullanılarak RNA örneklerinden dijital tüm transcriptome ifade profillerini elde etmek artık mümkün. Bu yüzden, bunun yerine örneğin, in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve qPCR, cDNA kütüphanelerinin hazırlanması için olduğu gibi paralel olarak sadece birkaç gen ürünlerinin, analizine imkan veren zaman alıcı bir yöntemYüksek verimli sekanslama, tüm transcriptome bilgi sağlayabilir. Her bir genin ekspresyon seviyeleri üzerindeki deneysel etkilerinin gözlenmesi da kullanılan yapı tarafından değiştirilmiş yolları üzerinde güçlü bir anlayış temin edebilmektedir. Bu, kullanılan organizma için bir genomik montaj varsa özellikle kolaydır, böylece civciv embriyo yine uygun bir modeldir.
Kullanıcı güvenilir bir genom dizileme merkezine erişimi varsa, ana konu yüksek kaliteli RNA örnekleri elde edilir. Bu çalışma, elde edilen veri setleri in silico analiz için RNA sekansına uygun transfekte sinir tüpleri, hem de alt adımları RNA örnekleri elde etmek için bir yöntemi gösterir. 48 saatlik bir inkübasyon takip HH12-13 de Elektroporasyon işleminden sonra, transfekte edilen gövde omurilik yarısı, ribonükleaz içermeyen koşullarda kesilmiş, hemen yok edilmekte ve daha fazla RNA saflaştırma işlemi ve kütüphane preparatın kadar ultra-düşük donma bozulmaya karşı korunaniyonu temsil etmektedir.
Galaxy public server 10 yüksek verim sıralama verilerini analiz etmek için ücretsiz kaynaklara erişim sağlar. Kayıtlı kullanıcılar için sunulan alan miktarı böylece lokal hesaplama altyapısı için ihtiyacı ortadan kaldırarak, küçük deneyler için yeterli. RNA Dizi veri analizi filtreleme, uyum ve gen ekspresyonunun nicelendirilmesi / karşılaştırmayı içermektedir. RNA-Seq veri analizi için genel kurallar olmasına rağmen, filtreleme parametreleri dizileme kalitesine bağlı olacaktır ve ham verilerin kalite kontrol analizinden sonra tespit edilmelidir.
Bu protokol almak ve in vivo transfekte tavuk embriyonik omurilik RNA-Dizi profillerini karşılaştırmak için adımları açıklar. Temsili bir sonucu olarak, bir boş vektör ile transfekte edilmiş iki farklı kontrol numunelerinden elde edilen veri setlerinin karşılaştırılması yöntem, yeniden üretilebilir ve farklı olarak Expres tanımlanmasına olanak gerektiğini gösterdiDeney örneklerindeki SED transkript. Bu nedenle, bu yöntemin uygulanması büyük ölçüde tek bir deneyde sonra keşiflerin sayısını artırmak ve böylece müteakip soruşturma için büyük bir veri kümesi sağlamak potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. electroporate HH12-13 Tavuk Embriyolar Sinir Tüpler ovo yılında İlgi Construct
Bir transfeksiyon tatmin edici seviyelere sahip bireylerin hemen tespit edilmesini sağlamak için, tercihen bir bisistronik transkriptte, bir flüoresan raportör kullanarak ya da araya giren virüs 2a peptit 11 ile ilgi proteinine. NOT: Bu aşamada tipik inkübasyon süresi 37.8 ° C'de yaklaşık 48 saat olduğunu.
- Bir 18 G x 1 1/2 iğne bağlanmış bir şırınga ile albümini 3 ml çıkardıktan sonra yumurta küçük bir pencere açar. Embriyo görünümünü geliştirmek için, embriyo 1-4 altında steril Ringer çözeltisi içinde 1:50 seyreltilmiş ve Hint mürekkebi az miktarda enjekte edilir.
- Steril Ringer solüsyonu ile embriyo kat ettikten sonra, 2.5 ug nöral tüpün arka ucundan bir DNA doldurur kadar / ul ihtiva eden, 10 mM Tris-HCI, pH 8.2 ve% 0.1 bir gıda boyası (K, D & C) çözelti enjekteBeyin bölgeye kadar. , Dış yan yüz bölgesi boyunca, 4 mm, 1 ile ayrılmış pozisyonlar platin elektrotları (çapı 0,5 mm) elektroporasyona ve bunların 4 ila 100 msn bir aralık ile 5 ila 50 ms arasında bakliyat ve 20 V sunmak.
- Elektroporasyondan sonra, bu aşamada HH23 ulaşana kadar daha fazla 48 saat için manipüle embriyolar inkübe ve flöresanlı bir stereomikroskop altında dış yan yüz bölgesinde transfeksiyon yüksek düzeyde sunulması bireylerin belirlenmesi.
Not: Elektroporasyondan sonra inkübasyon süresi Deneyin amacı bağlıdır. Electroporated plazmidler 2 saat sonra 2 anlamlı ifadesi düzeyleri oluşturabilirsiniz. İlgi erken başlangıçlı gen içinde ise Böylece sonrası elektroporasyon Kuluçka süresi azaltılabilir.
2. Hasat Başarıyla Embriyolar Geçiştirilmiş ve Electroporated Omurilik yarıları teşrih
NOT: Bu işlem her 10 embriyo ve verimleri 1 2-3 saat sürer-2 Embriyo başına mikrogram toplam RNA. Nöral tüp diseksiyonu ince hareketlerini gerektirir ve bazı antremanları deneysel örnekleri uygulamadan önce gerekli olabilir.
- RNaz dekontaminasyon solüsyonu ya da 4 saat 12 boyunca 150 ° C'de fırınlanması ile metalik diseksiyon araçları dekontamine ve DEPC ile muamele edilmiş PBS hazırlar. Sadece yeni sertifikalı RNazsız plasticware kullanın.
NOT: Hasattan sonra, o diseksiyonu sırasında Rnase bulaşmasını önlemek için standart bakım takip etmek önemlidir. - Ince kesici bir makas ve bir elenmiş toplama kaşık kullanarak embriyoların hasat. 100 mm Petri kabındaki soğuk DEPC ile muamele edilmiş PBS içinde embriyolar tutun.
- Ince bir cımbız ile, (ön bacak tomurcuk ve arka bacak tomurcuk ön sınırı posterior sınırı arasında) bütün yan bölgeyi kesip ve soğuk DEPC tedavi PBS içeren yeni bir çanak için bu bölümü aktarmak.
- Üç farklı at delmek için iki ince cam iğneler kullanınnöral tüp ve paraksiyel mezoderm arasında embriyonun her dorsolateral tarafında işaret ediyor.
- Merkez perforasyon iki cam iğneler tanıtmak ve yavaş yavaş nöral tüp ön-arka eksen boyunca onlardan birini uzağa taşıyın. İlk hareketlerin ulaştığı değil deliklerden için bu işlemi tekrarlayın. Ince bir cımbız ile müstakil paraksiyel mezoderm çıkarın.
- Yanlara embriyo çevirin nöral tüp ve Notokordun arasında cımbız ipuçları yerleştirin ve iki yapıyı ayırmak için ön-arka eksen boyunca ters yönlerde kaydırın.
Not: Bu aynı zamanda mezodermin çoğu hala nöral tüp takılı kaldırmanız gerekir. - Gerekirse, hafifçe cımbız başka bir çift nöral tüp tutarken bir çift cımbız ile çekerek bağlı kalır mesodermic dokusunun herhangi bir büyük parçaları çıkarın. Bittiğinde, yavaşça kullanılarak soğuk DEPC tedavi PBS içeren başka bir kaba nöral tüp transferiRNazsız cam Pasteur pipet manuel pipet pompasına bağlanmış ve tüm tüpler disseke kadar buz üzerinde tutmak.
- Ikiye sinir tüpleri bölün. Bunun için, lümeninde cımbız kapalı bir çift keskin ucu takın ve içinden cımbız dışarı taşıyarak çatı plakasını açın. Bundan sonra, cımbız uçları ile taban plakasını keserek yarısını ayırmak.
- Sıralama buz soğukluğunda DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile doldurulmuş bir 1.5 ml'lik tübe floresan bir diseksiyon kapsam ve transfer altında olmayan elektroporasyona yarıları elektroporasyona. Gerekirse, plastik duvarlarına bağlı herhangi bir dokuyu çıkarmak için ve bu tüplerin tortulaşmayı teşvik etmek için hafifçe mikrotüpler hafifçe vurun.
- 3 sn 100 xg'de Spin ve 1 ml mikropipet ile mümkün olduğu kadar PBS gibi çok yavaşça kaldırın. Herhangi bir embriyonik malzeme pipet emilir eğer izlemek için mikrotüpünden parlar bir ışık kaynağına bakarak bu süre yapmak; Bu olursa, yavaş yavaş deşarj ve centrifuga tekrarlayınyon.
- Nöral tüp devre başına RNA ekstraksiyonu için lizis çözeltisinin 70 ul ekleyin ve içerikleri karıştırmak üzere tüp hafifçe vurun. Kuvvetli bir şekilde 5 dakika ve vorteks oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika inkübasyondan sonra, vorteks iki kez daha tekrarlayın. -80 ° C'de saklayın.
- Bir sonraki aşama için yeterli bir verimi sağlamak için, numune başına en az sekiz nöral tüp yarıyı toplayın. Birkaç elektroporasyon / diseksiyon oturumları nöral tüp yeterli sayıda biriktirmek için gerekiyorsa daha küçük örnekler havuzu. Her durum için çiftleri veya üçlülerdeki için yeterli örnekleri saklamak.
3. Arındırıcı RNA ve Illumina dizinleri için Kütüphaneler hazırlayın
- -80 ° C'de depolama ile ilgili örnekleri çıkarın ve 15-30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Tamamlanıncaya kadar oda sıcaklığında çözülme devam edin.
- Girdap de ve 5 dakika için oda sıcaklığında bırakın. 1 dakika 15.000 xg'de tekrar karıştırın ve santrifüj çözünmeyen malzeme peletlendi.
- Yeni bir tüpe süpernatant aktarınve toplam RNA izolasyon kiti kullanım talimatlarına uygun olarak RNA ekstraksiyonu geçin. Konsantrasyonunu arttırmak için önerilen minimum hacimde Zehir.
NOT: Temiz-up sonra DNaz tedavi RNA-Dizi veri kümelerinde genomik DNA dizilerinin potansiyel kontaminasyonu önlemek için tavsiye edilir. - Içerikleri karıştırmak ve kalite kontrol analizi için 5 ul nin uzaklaştırılması için boru hafifçe vurun. Kütüphane hazırlanana kadar -80 ° C de, geri kalan örnek Mağaza; Bu örneklerin RNA bozulmasını önlemek için sadece bir kez çözdürülmelidir.
- RNA 6000 Nano kiti kullanarak Bioanalyzer enstrüman saflaştırılmış RNA çalıştırın; RIN değeri en az 7, yukarıda devam etmek gerekir.
- Bir Illumina uyumlu bir RNA-Dizi kütüphane hazırlama kitini kullanarak kütüphaneleri oluşturmak ve tek okur 100 bp oluşturmak için ayarlanmış bir HiSeq aletinin bir şeritte 4 kütüphanelere kadar multipleks. Mümkünse, potansiyel teknik eserler en aza indirmek için aynı vadede tüm örnekleri yer alıyor.
NOT: Bu 50 milyon r kadar verim gerekirçoğu genler 13 kapsama almak için fazlasıyla yeterli olduğunu numune başına EADS.
4. Galaxy Kamu Server 10 RNA-Dizi Veri Kümeleri karşılaştırın.
NOT: Server depolama alanı sınırlı olduğu ve birçok örnekleri karşılaştırarak deneyler filtreleme adımda oluşturulan ara dosyaların silinmesini isteyebilir.
- (Galaxy kamu sunucusunda bir kullanıcı hesabı oluşturun https://usegalaxy.org ) ve FTP fastq formatında Illumina veri setlerini yükleyin.
- NGS altında FastqGroomer 14 aracı ile yüklenen dosyaları hazırlayın: QC ve manipülasyon menü; kalite puanları zaten Phred + 33 (Sanger) olarak kodlanmış ise, basitçe her veri kümesi için Öznitelikler altında fastqsanger için dosya türünü değiştirerek bu adımı atlayın.
- QC ve manipülasyon beni: genel NGS altında FastQC aracını kullanarak her veri kümesi kalitesini analiznu.
Not: Bu okur uçlarını düzeltmek için kullanılan parametreler için tahminler sağlayacak gibi özel dikkat, baz dizisi kalite başına ve her baz dizilimi içerik için çıkan grafik verilmelidir. - Trim '3 atmak için okur aracını NGS altında fastq Kalite Giyotin 14 kullanılarak düşük kaliteli veri ile biter: QC ve manipülasyon menü. Sadece 3 '20 altında kalite puanı biter işlemek için aracı ayarlayın.
- Klip aracını kullanarak (okuduğunda adaptör dizilerinin kaldırmak http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ QC ve manipülasyon menüsü: NGS altında). Az kalan 45 bp, giriş kullanılan adaptörün dizisi ile okur atmak ve hem de kısaltıldı olmayan kırkılmış dizileri ihtiva çıkışını seçmek için aracı ayarlayın. Ayrıca, en düşük kaliteli bazlar zaten son adımda çıkarıldı beri bilinmeyen üsleri ile dizileri atmak değil tercih. Aracı Trim dizileri (kullanarak http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ NGS altında): FastQC tarafından algılanan 5 'dizisi önyargı (genellikle 10) kaldırmak için okur QC ve manipülasyon menüsü, ilk üsleri kırpın.
NOT: Bu noktada, tekrar FastQC çalıştırın ve veri kümesi kalitesinin düzeldiği olmadığını belirlemek için önceki analizi ile karşılaştırmak için iyi bir fikirdir. - Download ve Illumina iGenomes gelen UCSC genom tarayıcı için son tavuk genom aksamını paketinden ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) ve tüm genom Fasta biçimi dosyası ve genler açıklama GTF biçimi dosya upload Veri Al menüsü altında araç Dosya Yükle kullanarak Galaxy tarihine.
- Harita altında hizalama TopHat2 15 kullanılarak tavuk genomunun her bir numune için okumaNGS: RNA Analizi menüsü. Tarih bir genomu kullanmayı tercih (adım 4.7 yüklenen Fasta dosyasını seçin).
- RNA Analiz menüsünde: NGS altında Kol Düğmeleri 16 kullanılarak her bir örnek için bir tahmin transcriptome oluşturun. Bir rehber olarak referans notu kullanın (adım 4.7 yüklenen GTF dosyayı seçin) ve seçenekleri açmak (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyadan) Eğilim Düzeltme gerçekleştirin ve çok okumak doğru kullanın seçin.
- RNA Analiz menüsünde: NGS altında Cuffmerge 16 kullanan tüm örnekler için tahmin transcriptomes Birleştirme. (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyasından) ve sekans verileri (adım 4,7 GTF dosyası) referans notu kullanın seçin.
- RNA Analiz menüsünde: NGS altında Cuffdiff 16 kullanılarak her bir örnek için TopHat2 tarafından oluşturulan BAM dosyalarını karşılaştırın. Alan Kopyalarıyla de beni seçinrged transcriptome Cuffmerge tarafından oluşturulan ve seçenekleri (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyadan) Eğilim Düzeltme gerçekleştirin açmak ve çoklu-okuma doğru kullanın.
- Sıralama diferansiyel ifade Filtresi altında araç Sıralama kullanarak sayısal sütun 13 (q değeri) olarak artan tabloları test ve menü sıralayın.
Not: Genler / düşük q değerlerinin sunacak deneysel koşullar arasında anlamlı bir diferansiyel ekspresyonu gösteren transkript. - Kapsama grafikler ile görsel olarak sonuçları kontrol etmek için, öncelikle aracı BEDTools menüsü altında genom kapsama 17 bir BedGraph kullanarak oluşturun bedGraph formatında BAM dosyalarını dönüştürebilirsiniz. Kapsama olmadan bölgelerin bildirimini devre dışı, farklı aralıklarla olarak eklenmiş girişleri tedavi ve tüm gerçekleştirmede karşılaştırılan için sıralama derinliği normalleştirir bir faktör tarafından kapsama ölçek seçin.
- Kullanarak kodaman formatında çıkan bedGraph dosya dönüştürmearacı Peruk / BedGraph-to-kodaman ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) Dönüştür Biçimleri menüsü altında. UCSC genom tarayıcı (özel parça olarak kodaman dosya upload http://www.genome.ucsc.edu/ galGal4 montaj için) ve veri kümelerinde kapsama görselleştirmek için ilgilenilen geni arayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anlatılan yöntem doğrulamak için, iki kontrol numuneleri, boş vektör PMES 7 ve uç tavuk SCRT2 18 çinko-parmak sahalarını kodlayan SCRT2-ZNF, yapıyı içeren aynı vektör ile transfekte edilmiş embriyolar, bir örnek ile elektropore edildi embriyolardan elde edilmiştir. Her 11-22 ug toplam RNA elde edildi Örnekler 8-12 embriyo havuzlarından elde edilmiştir. Her üç numune, yüksek kaliteli, RNA bu protokol ile elde edilebileceğini gösteriyor, Bioanalyzer cihazı (Şekil 1) ile yapılan kalite kontrolünde, 10 optimal RIN değeri attı.
Sekanslama sonra tanımlanan filtreleme işlemi okur 83 ve% 91 arasında hizalama hızını arttırdı (veriler gösterilmemiştir). Beklendiği gibi, küresel bir dağılım arsa karşılaştırıldığında iki kontrol örneklerinden transcriptomes karşılaştırılması (Şekil 2) açık bir fark gösterdi ve Pearson korelasyon katsayısı 0 oldu.99. Buna ek olarak, SCRT2 dizisinin bir bölümünü içeren yivin geometrik konumu boyunca her üç veri setleri için kapsama görüntüleme aşın olduğunu belirten, deney örneği (Şekil 3), bu bölgede eşlenmiş okur sayısında belirgin bir artış gösterdi Başarılı ve Deney ve kontrol numuneleri arasındaki farklar burada anlatılan yöntem ile tespit edilebilir olması.
Şekil 1:. RNA kalite kontrol Bioanalyzer 18S ve 28S ribozomal RNA zirveleri tarafından gösterilen iki kontrol total RNA örnekleri için bütünlüğün yüksek seviyesini gösteren elektroferogramlar. Insets çalıştırmak için sanal bir jel temsil eder.
Figu2 re:., RNA-Sıra niceleme sonuçların tekrar elde edilebilirliğini en genleri için bu RPKM gösteren grafiğini saçılmış sinyallerin her ikisi kontrol numunelerinde aynıdır. Hemen hemen bu desen uymayan tüm genler çok düşük RPKM değerlerine sahip ve bu nedenle genellikle transcriptome karşılaştırmalar göz ardı edilir.
Şekil 3: Bir deney numunesinde farklılıklar görselleştirilmesi proteini tanım (SCRT2-ZnF) kodlayan ektopik ifade bölgenin içerisinde belirgin bir artış gösteren tavuk genomunda SCRT2 yerinin (galGal4) olarak ucsc Genom Tarayıcı ekran. Deneysel örnek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tavuk omuriliğin elektroporasyon sonra etkilerini analiz etmek için yönergeler sağlamak. DNA vektörlerine elektroporasyonu daha sık ilgi konusu bir geni fazla-sentezlemek üzere kullanılmasına rağmen, tek bir gen fonksiyonu yok etme koşulları 19-21 oluşturmak üzere siRNA'lar dominant negatif, quimeric proteinler veya öncülerini kodlayan yapıları kullanabilir. Aslında, gain- ve kayıp fonksiyon-analiz hem kaynaklanan transcriptome profilleri karşılaştırılması farklı şekilde böylece potansiyel daha spesifik etkilerini ortaya çıkarmak zorunda, her durumda zıt şekillerde ifade genleri işaret edebilir.
Herhangi bir yöntem RNA ekstraksiyonu için aşağı doğru uygulandığında, bir RNA-Seq kütüphanelerden sentezi başlangıç malzemesi bir minimum başlangıç gerektirir. Bu protokol ile 8 embriyolar yaklaşık 10 ug toplam RNA elde etmek için yeterli olmalıdır. Yeterli bir çalışma konsantrasyonunu ödün vermeden bireylerin daha düşük bir sayı ile başlayan muhtemelenDaha küçük hacimlerde final seyreltme izin RNA ekstraksiyonu sistemlerinin kullanımı ile mümkündür.
Bu bazı aşinalık gerektirir narin bir adım olarak tüm mezodermden nöral tüpün doğru ayrımı, önemli örnekleri uygulamadan önce bir kaç kez uygulanmalıdır. Diseksiyon adım sırasında aşırı RNA bozulmasını önlemek için, yaklaşık 1-2 saat içinde tüm sinir tüpleri için tüm prosedürü tamamlamak için de önemlidir. Yine, uygulama diseksiyon süresini artırmak için önemli olacaktır. Bir önemli gözlem mezoderm dokular arasındaki bağlantı, böylece mezodermal yapıları, özel Notokordun çekerek, mezoderm ve nöral tüp arasındaki bağlantı daha güçlü istenmeyen doku kesmek için çalışırken daha verimli olmasıdır. Ayrıca, araştırmacılar, kendi tekniği kendi diseksiyon koşulları için optimize geliştirmek için çekinmeyin. Ancak, bakım, yüzey olarak ve böylece benzer şekilde çıkarılmasına bir aynı deneyde göre örnekler için alınmalıdırmezodermal doku ile kirlenme l örnekleri arasında mümkün olduğu kadar homojen bir yapıdadır.
Bizim protokol aşamasında HH12-13 transfekte sahne HH23 tavuk embriyonik omurilik gelen transcriptome profilleri mukayesesini göstermektedir. Bununla birlikte, küçük ayarlamalar erken aşamalarında hasat embriyolar başvurusunu izin vermelidir. Sonraki aşamalarında sonuç analizi için arzu edilir ise, diğer taraftan, sözü edilen bisistronik vektörler, gelişme ilerledikçe hücre başına moleküllerin sayısı sürekli bir azalmaya uygun olmayabilir. Bu nedenle, istenen son nokta Transfeksiyondan sonra en fazla 72 saat sonra elde edilir, özellikle, bu 22 kullanılan yapının transpozon aracılı genomik entegrasyon kodlayan vektörler kullanmak gerekli olabilir.
Dikkate alınması gereken diğer bir konu elektroporasyon verimliliği heterojenliktir. Transfekte-olmayan hücre sayısı önemli bir amo birkaç aralıklarıventral nöral tüpte unt, özellikle olanlar. Diseksiyonu sonrası tüm hücreleri aşağı analize tabi olduğundan, düşük elektroporasyon verimliliği tahlil hassasiyetini azaltacaktır. Elektroporate edilmiş hücrelerde ile örnek zenginleştirmek için bir yaklaşım, son örnek 23 olmayan transfekte edilmiş hücrelerin popülasyonunun düşürülmesi için (FACS), flüoresans ile aktifleştirilen hücre kullanılmasıdır. Bu tür bir yaklaşım kullanıldığında, ancak, embriyolar daha fazla sayıda RNA Dizi kütüphane hazırlanması için yeterli bir verimle elde etmek için gerekli olacaktır.
Bu daha yaygın diğer platformlarda 24 karşılaştırıldığında basitleştirilmiş sıralama merkezleri tarafından ve siliko RNA-Dizi veri analizi sunulmaktadır gibi Illumina sıralama önerilmektedir. Veri filtreleme seçilen platformu için daha uygun adımlarının Ancak, diğer seçenekleri hala modifikasyonları ile yeterli. RNA-Seq veri analizi rehber hala tamamen kurulmuş ve çıkışları fr karşılaştırılması değilZaten Galaxy kamu sunucusu dahil bunlardan bazıları om kullanılabilir farklı araçları, şiddetle tavsiye edilir. Yine de, burada açıklanan içinde silikotüberküloz analiz yüksek kaliteli veri setlerinden iyi karşılaştırma sonuçları elde etmek için uygun olmalıdır. Biyoloji diğer alanlarda olduğu gibi, yüksek verimli bir sıralama artışlar son derece basit bir deneyle elde edilebilir olan bilgi miktarı, burada tarif edilen yöntem, omurilik gelişimini çalışmaya uygulamadan bir yoludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
