Introduction
Genetiska studier av levande organismer använder ofta kyckling embryot som modell eftersom i ovo elektroporering representerar ett snabbt och billigt sätt att delvis transfektera embryonala strukturer in vivo med DNA-konstruktioner 1-5. Bicistronisk expressionsvektorer som kodar för ett transkript som innehåller en fluorescerande reporter tillsammans med genen av intresse, såsom pCIG 6 eller pMES 7, möjliggöra snabb kontroll av transfektion kvalitet i den önskade regionen under ett stereomikroskop innan bearbetning embryon för nedströms analys.
Med senaste framstegen inom DNA-sekvensering, är det nu möjligt att få digitala hela transkriptom uttryck profiler från RNA-prover som använder RNA-Seq 8,9. I stället för tidskrävande metoder som möjliggör analys av endast ett fåtal genprodukter parallellt, till exempel in situ hybridisering, immunohistokemi och qPCR, utarbetande av cDNA-bibliotek förhög genomströmning sekvensering kan ge information om hela transkriptom. Observation av de experimentella effekter på uttrycksnivåer av varje enskild gen kan i sin tur ge kraftfulla insikter om banorna förändras av konstruktionen används. Detta är särskilt lätt om en genomisk aggregat för den använda organismen är tillgänglig, återigen är sålunda kycklingembryo en lämplig modell.
Om användaren har tillgång till en tillförlitlig genomsekvense centrum är den viktigaste frågan att få hög kvalitet RNA-prover. Detta arbete visar en metod för att erhålla RNA-prov från transfekterade neurala rören lämpliga för RNA-Seq, liksom de efterföljande stegen för in silico-analys av de resulterande datamängderna. Efter elektroporering vid HH12-13 följt av 48 timmars inkubation, transfekterades trunkryggmärgs halvor dissekerades i ribonukleas fria betingelser, omedelbart lyserades och ytterligare skyddas från nedbrytning genom ultra-låg frys tills RNA-rening och bibliotek Förberedelsejon.
Galaxy allmän server 10 ger tillgång till fria resurser för att analysera hög genomströmning sekvenseringsdata. Det utrymme som erbjuds för registrerade användare är nog för små experiment, vilket eliminerar behovet av lokal beräknings infrastruktur. RNA-Seq dataanalys inkluderar filtrering, anpassning och kvantifiering / jämförelse av genuttryck. Även om det finns allmänna riktlinjer för RNA-Seq dataanalys, kommer filtreringsparametrar beror till stor del på kvaliteten på sekvensering och bör bestämmas efter kvalitetskontroll analys av rådata.
Detta protokoll beskriver stegen för att få och jämföra RNA-Seq profiler från kyckling embryonal ryggmärg transfekterade in vivo. Som ett representativt resultat, jämförelse av datauppsättningar som erhållits från två oberoende kontrollprover transfekterade med en tom vektor visade att metoden är reproducerbar och bör göra det möjligt att identifiera differentiellt ExpresSED-transkript i experimentprover. Därför har tillämpningen av denna metod potentialen att kraftigt öka antalet upptäckter efter ett enda experiment och ger därmed en stor uppsättning data för efterföljande undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. electroporate konstruktionen av intresse i neurala Rör av HH12-13 Chicken embryon i ovo
Använd en fluorescerande reporter, helst i ett bicistronisk avskrift eller smält till proteinet av intresse med en intercalating viral 2a peptid 11, för att möjliggöra snabb identifiering av individer med tillfredsställande nivåer av transfektion. OBS: Typisk inkubationstid för denna etapp är ca 48 timmar vid 37,8 ° C.
- Öppna ett litet fönster i äggen efter avlägsnande 3 ml av albumin med en spruta kopplad till en 18 G x 1 1/2 nål. För att öka embryo visualisering, injicera en liten mängd tusch utspätt 1:50 i steril Ringers lösning under embryot 1-4.
- Efter att ha täckt embryot med steril Ringers lösning, injicera en 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 och 0,1% Food Dye (F, D & C) lösning innehållande 2,5 ug / ul DNA genom den bakre änden av det neurala röret tills den fyllerupp till bakhjäman regionen. För att elektroporera, positionsplatinaelektroder (0,5 mm i diameter) separerade av fyra mm 1 längs flankregionen och leverera 5 pulser av 50 ms och 20 V med ett intervall på 100 ms mellan dem 4.
- Efter elektroporering, inkubera manipulerade embryon i 48 timmar mer tills de når scenen HH23 och identifiera fysiska personer som uppvisar hög transfektion vid flankregionen under ett fluorescerande stereomikroskop.
OBSERVERA: Varaktigheten av inkubation efter elektroporering beror på syftet med experimentet. De elektroporerade plasmider kan generera betydande uttrycksnivåer efter 2 timmar 2. Om sålunda intresse ligger i tidig debut gener efter elektroporering inkubationsperiod kan reduceras.
2. Harvest framgångsrikt Transfekterad embryon och dissekera electroporated ryggmärg Halvor
OBS: Denna procedur varar från 2-3 timmar för varje 10 embryon och avkastning 1-2 | Ig totalt RNA per embryo. Dissektion av neurala rör kräver fina rörelser och vissa övningar kan vara nödvändig innan det till experimentprover.
- Dekontaminera metalliska dissektion verktyg med RNas dekontamineringslösning eller genom bakning vid 150 ° C under 4 h 12 och förbereda DEPC-behandlat PBS. Använd endast nya certifierade RNas fria plasten.
OBS: Efter skörden är det viktigt att följa standardbehandling för att förhindra RNas kontaminering under dissektion. - Skörda embryon med hjälp av ett par fina dissekera sax och en siktade uppsamlings sked. Hålla embryona i kall DEPC-behandlat PBS i en 100 mm petriskål.
- Med ett par fina pincett, klipp ut hela flankområdet (mellan den bakre gränsen för den främre extremiteten linda och den främre gränsen för bakre lem knopp) och överför detta avsnitt till en ny maträtt med kall DEPC-behandlad PBS.
- Använd två fina glas nålar att perforera på tre olikapekar på varje dorsolaterala sidan av embryot mellan det neurala röret och det paraxiella mesoderm.
- Presentera de två glas nålar i centrala perforeringen och sakta flytta en av dem bort längs neuralröret främre-bakre axeln. Upprepa detta för de perforeringar som inte nås av de första rörelserna. Ta bort den avlägsnade paraxiala mesoderm med ett par fina pincett.
- Vrid embryot i sidled, för in spetsarna på pincetten mellan neuralröret och notochord och skjut dem i motsatta riktningar längs den främre-bakre axeln för att separera de två strukturerna.
OBS: Detta bör också ta bort det mesta av mesoderm fortfarande fäst till det neurala röret. - Om det behövs, ta bort alla större bitar av mesodermic vävnad som sitter kvar genom att dra med en pincett Håll lätt neuralröret med en annan pincett. När du är klar, försiktigt överföra neuralröret till en annan maträtt som innehåller kall DEPC-behandlad PBS med hjälp av enRNas fritt glas pasteurpipett kopplad till en manuell pipett pump och hålla på is tills alla rör dissekeras.
- Dela upp neurala rören i två halvor. För detta, sätt in den vassa spetsen på en sluten pincett i lumen och öppna takplåt genom att flytta pincett ut genom den. Efter detta, separera halvorna genom att skära golvplattan med pincett tips.
- Sortera electroporated från icke-elektro halvor under ett fluorescerande dissekera omfattning och överföring till ett 1,5 ml rör fyllt med iskallt DEPC-behandlad PBS. Om nödvändigt snärta mikrorören försiktigt för att frigöra eventuell vävnad fäst vid plastväggarna och för att främja sedimentering av rören.
- Centrifugera vid 100 x g under 3 sek och ta bort mycket långsamt så mycket PBS som möjligt med en 1 ml mikropipett. Gör detta medan du tittar på en ljuskälla som lyser igenom mikroröret för att övervaka om något embryonala material sugs till pipettspetsen; Om detta händer, sakta ur och upprepa centrifugation.
- Lägg 70 pl lyslösning för RNA-extraktion per neuralrörsdefekter halv och flick röret för att blanda innehållet. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min och skaka kraftigt. Upprepa 5 min inkubation och vortexning två gånger till. Förvara vid -80 ° C.
- Samla minst åtta neuralrörsdefekter halvor per prov för att säkerställa en tillräcklig avkastning för nästa steg. Pool mindre prover om flera elektroporering / dissektion sessioner krävs för att samla tillräckligt många neurala rör. Förvara tillräckliga prover för dubbletter eller tripletter för varje tillstånd.
3. Rena RNA och förbereda Bibliotek för Illumina sekvense
- Ta prover från -80 ° C lagring och placera på is i 15-30 minuter. Återuppta upptining vid rumstemperatur tills fullständig.
- Vortex väl och låt stå i rumstemperatur i 5 minuter. Vortex igen och centrifugera vid 15.000 xg under 1 min för att pelletera olösligt material.
- Överför supernatanten till ett nytt röroch fortsätt till RNA-extraktion enligt den totala RNA isolering kit manuella instruktioner. Eluera i minsta rekommenderade volymen för att öka koncentrationen.
OBS: DNas behandling efter sanering rekommenderas för att undvika eventuella föroreningar av genomiska DNA-sekvenser i RNA-Seq datamängder. - Flick röret för att blanda innehållet och ta bort 5 ul för kvalitetskontroll analys. Lagra det återstående provet vid -80 ° C fram till biblioteket preparatet; dessa prover ska tinas endast en gång för att undvika RNA nedbrytning.
- Kör renat RNA i en Bioanalyzer instrument med hjälp av RNA 6000 Nano kit; RIN-värdet måste vara över 7 för att fortsätta.
- Generera bibliotek använder en Illumina kompatibelt RNA-Seq förberedelse biblioteks kit och multiplex upp till 4 bibliotek i ett körfält på en HiSeq instrument in för att generera 100 bp singel läser. Om det är möjligt, omfatta alla prover i samma körning för att minimera potentiella tekniska artefakter.
OBS: Detta bör ge upp till 50 miljoner rEADS per prov, vilket är mer än tillräckligt för att få täckning för de flesta gener 13.
4. Jämför RNA-Seq Dataset i Galaxy Public Server 10.
OBS: Serverlagringsutrymme är begränsat och experiment som jämför många prover kan kräva radering av mellanliggande filer som genereras i filtreringssteg.
- Skapa ett användarkonto i Galaxy allmän server ( https://usegalaxy.org ) och FTP ladda upp Illumina dataset i fastq format.
- Förbered uppladdade filer med FastqGroomer 14 verktyget under NGS: QC och manipulation menyn; om kvalitetsresultat redan kodade i Phred + 33 (Sånger), hoppa över detta steg genom att helt enkelt ändra filtypen till fastqsanger under attribut för varje dataset.
- Analysera den allmänna kvaliteten på varje dataset med hjälp av FastQC verktyget under NGS: QC och manipulation mignu.
OBS: Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt de resulterande grafik för per bassekvens kvalitet och per bassekvens innehåll, eftersom dessa kommer att ge uppskattningar för de parametrar som används för att trimma ändarna av läsningar. - Trim läser att göra sig av 3-ändarna med kvalitetsdata låga med hjälp av verktyget FASTQ Quality Trimmer 14 under NGS: QC och manipulation menyn. Ställ in verktyget för att bearbeta endast 3 'ändar för kvalitets score under 20.
- Ta adaptersekvenser från läser med hjälp av Clip verktyget ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) under NGS: QC och manipulation menyn. Ställ in verktyget att kassera läser med mindre än 45 bp till vänster, mata in den sekvens av adaptern som används och välja utsignalen att innefatta både klippta och icke-klippta sekvenser. Dessutom väljer att inte göra sig av sekvenser med okända baser eftersom de flesta låg kvalitet baser redan togs bort i det sista steget. Genom att använda verktyget Trim sekvenserna ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) under NGS: QC och manipulation menyn, trimma de första baserna i den läser att avlägsna 5 'sekvens partiskhet upptäcks av FastQC (normalt 10).
OBS: Vid denna punkt, är det en bra idé att köra FastQC igen och jämföra med föregående analys för att avgöra om dataset kvaliteten förbättrades. - Ladda ner och packa upp den senaste kyckling genomet församling för UCSC genomet webbläsare från Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) och ladda upp hela genomet FASTA-fil och generna anteckning GTF-fil till galaxen historia med hjälp av verktyget Överför fil under Get Data-menyn.
- Karta läser för varje prov till kyckling-genomet med hjälp av riktan TopHat2 15 enligtNGS: RNA Analysis menyn. Välj att använda ett genom från History (markera FASTA filen upp i steg 4.7).
- Bygg en förutsagd transkriptom för varje prov genom Manschettknappar 16 under NGS: RNA Analysis menyn. Välj att använda referens anteckning som en guide (markera GTF filen upp i steg 4.7) och vrid på alternativen Utför Bias Correction (från historia, Fasta fil från steg 4,7) och använda fler läsa korrekt.
- Merge förutsedda transcriptomes för alla prover med Cuffmerge 16 under NGS: RNA Analysis menyn. Välj att använda referens anteckning (GTF fil från steg 4,7) och sekvensdata (från historia, Fasta fil från steg 4,7).
- Jämför BAM filer som genereras av TopHat2 för varje prov genom Cuffdiff 16 under NGS: RNA Analysis menyn. I fält Avskrifter välja migrged transkriptom genereras av Cuffmerge och slå på alternativen Utför Bias Correction (från historia, Fasta fil från steg 4,7) och använda multi-läst rätt.
- Sortera differentialuttryck testar tabeller numeriskt stigande i kolumn 13 (q-värde) med hjälp av verktyget Sortera under Filter och sortera menyn.
OBS: Gener / utskrifter som visar signifikant differentiellt uttryck mellan experimentella betingelser kommer att presentera de lägsta q-värden. - För att kontrollera resultaten visuellt med täckningsdiagram, först konvertera BAM-filer till bedGraph format med hjälp av verktyget Skapa en BedGraph av genom täckning 17 under BEDTools menyn. Inaktivera rapportering av regioner utan täckning, väljer att behandla skarvade poster som särskilda intervaller och skala täckningen med en faktor som normaliserar sekvensedjup för alla datamängder som jämförs.
- Konvertera den resulte bedGraph filen till Bigwig format med hjälp avVerktyget Wig / BedGraph-to-Bigwig ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) under konvertera format menyn. Ladda upp höjdare filer anpassade spår i UCSC genomet webbläsare ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) för galGal4 montering och söka en gen av intresse att visualisera täckningen av dataunderlag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera den metod som beskrivs, har två kontrollprover som genereras från embryon elektroporerade med den tomma vektorn pMES 7 och ett prov från embryon som transfekterats med samma vektor innehållande insatsen konstruera SCRT2-ZNF, som kodar de zink-fingerdomäner av kyckling SCRT2 18. Prover som ger 11-22 mikrogram totalt RNA vardera erhölls från pooler av 8 till 12 embryon. Samtliga tre prover gjorde ett optimalt RIN värde av 10 i en kvalitetskontroll utförs med Bioanalyzer instrumentet (Figur 1), vilket visar att hög kvalitet RNA kan erhållas med detta protokoll.
Efter sekvensering, ökade den beskrivna filtreringsprocessen inriktningshastighet 83-91% av läser (data ej visade). Som väntat, jämförelse av transcriptomes från två kontrollprover visade ingen tydlig skillnad när världen jämförs i ett spridningsdiagram (figur 2) och Pearson korrelationskoefficient var 0.99. Dessutom visning av täckning för alla de tre datamängder längs locus som innehåller den del av SCRT2 sekvensen visade en tydlig ökning av antalet läsningar mappas till denna region i försöksprovet (figur 3), vilket tyder på att överuttryck var framgångsrik och att skillnader mellan kontroll- och experimentprover bör upptäckas med den metod som beskrivs här.
Figur 1:. RNA kvalitetskontroll Bioanalyzer elektroferogrammen visar hög integritet för de två kontroll totala RNA-prov indikeras av 18S och 28S ribosomala RNA toppar. Inläggningar representerar en virtuell gel för körningen.
Figure 2:. Reproducerbarhet av RNA-Seq kvantifiering resultat spridningsdiagram som visar att RPKM för de flesta gener är densamma i båda kontrollproven. Så gott som alla gener som inte följer detta mönster har mycket låga RPKM värderingar och därmed är oftast ignoreras av transkriptom jämförelser.
Figur 3: Visualisering av skillnader i en experimentell prov UCSC Genome Browser visning av SCRT2 locus i kyckling genomet (galGal4) som visar en synlig ökning av täckningen av regionen som kodar för proteindomän (SCRT2-ZnF) ectopically uttrycks i. experimentella provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här ger vi riktlinjer för att analysera effekter efter elektroporering av hönan ryggmärgen. Även elektroporering av DNA-vektorer är oftare används för att överuttrycker en gen av intresse, kan man även använda konstruktioner som kodar dominerande negativ, quimeric proteiner eller prekursorer för siRNA att generera geners funktion knock-down förhållanden 19-21. I själva verket kan jämföra transkriptom profiler som följer av både gain och förlust av funktionsanalys påpeka gener differentiellt uttryckta i motsatta sätt i varje tillstånd, vilket har potential att avslöja mer specifika effekter.
Som någon metod som tillämpas nedströms till RNA extraktion, syntes av RNA-Seq bibliotek kräver minst initial mängd utgångsmaterial. Med detta protokoll, bör 8 embryon vara tillräcklig för att ge omkring 10 pg av total RNA. Från och med ett lägre antal individer utan att kompromissa en tillräcklig nyttjandekoncentration är troligenmöjligt med användning av RNA-extraktionssystem som tillåter slutlig utspädning i mindre volymer.
Korrekt segregering av neuralröret från all mesoderm bör övas några gånger innan de ansöker till viktiga prover, eftersom detta är ett känsligt steg som kräver viss erfarenhet. För att undvika överdriven nedbrytning RNA under dissektion steget, är det också viktigt att fullfölja hela proceduren för alla neurala rör i ca 1-2 timmar. Återigen kommer praktiken att vara viktigt att förbättra dissektion tid. En viktig iakttagelse är att sambandet mellan mesoderm vävnader är starkare än sambandet mellan mesoderm och neuralrörsdefekter, vilket drar mesodermala kroppar som är speciellt notochord, är effektivare än att försöka skära oönskad vävnad. Dessutom bör forskare välkommen att utveckla sin egen teknik optimerad för att deras egna dissektion förhållanden. Dock bör försiktighet iakttas för prover jämfört i en samma experiment som ska dissekeras på liknande så att level av förorening med mesodermala vävnader är så homogen som möjligt mellan proven.
Vår protokoll visar jämförelsen av transkriptom profiler från scenen HH23 kyckling embryonala ryggmärg transfekterade i etapp HH12-13. Dock bör små justeringar låta sin ansökan till embryon som skördas i tidigare led. Å andra sidan, om senare skeden är önskvärda för analys av slutresultatet, de bicistroniska vektor nämns kanske inte passar på grund av en kontinuerlig minskning av antalet molekyler per cell som utvecklingen fortskrider. Därför, i synnerhet om den avsedda slutpunkten uppnås efter mer än 72 h efter transfektion, kan det vara nödvändigt att använda vektorer som kodar transposon medierad genomisk integrering av konstruktionen som används 22.
En annan fråga som måste beaktas är heterogenitet elektro effektivitet. Antalet icke-transfekterade celler varierar från ett fåtal till ett betydande amoUNT, speciellt de i den ventrala neuralrörsdefekter. Sedan efter dissektion alla celler utsätts för nedströms analys kommer en låg elektro verkningsgrad minskar analysens känslighet. Ett tillvägagångssätt för att anrika provet med elektroporerade celler är användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att minska populationen av icke-transfekterade celler från det slutliga provet 23. Om ett sådant tillvägagångssätt används, kommer dock ett större antal embryon vara nödvändiga för att uppnå tillräcklig avkastning för RNA-Seq bibliotek beredning.
Illumina sekvense rekommenderas eftersom det är mer allmänt erbjuds av sekvensecentra och in silico-RNA-Seq dataanalys är förenklad jämfört med andra tillgängliga plattformar 24. Men andra alternativ fortfarande är lämpliga med ändringar i datafiltrering steg mer passande till plattformen som valts. RNA-Seq riktlinjer för dataanalys är fortfarande inte helt etablerad och jämförelse av utgångar frOMs olika tillgängliga verktyg, varav vissa redan ingår i Galaxy allmän server, rekommenderas starkt. Ändå bör analysen i silico beskrivs här vara lämpliga för att uppnå goda jämförelseresultat från högkvalitativa datamängder. Som på alla andra områden i biologi, hög genomströmning sekvense ökar enormt mängden information som kan erhållas från ett enda experiment, och den metod som beskrivs här är ett sätt att tillämpa den på studier av ryggmärgen utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
