Introduction
Genetiske studier på levende organismer ofte bruker kylling embryo som modell fordi i ovo elektroporering representerer en rask og rimelig måte å delvis transfektere embryonale strukturer in vivo med DNA konstruerer 1-5. Bicistronisk ekspresjonsvektorer som koder for en transkript inneholdende et fluoriserende reporter sammen med genet av interesse, slik som pCIG pMES 6 eller 7, tillater rask verifisering av transfeksjon kvalitet i det ønskede område under et stereomikroskop før behandlingen embryoer for genetisk analyse.
Med de siste fremskritt innen DNA-sekvensering, er det nå mulig å få digitale hele transkriptom uttrykk profiler fra RNA prøver ved hjelp av RNA-Seq 8,9. Derfor, i stedet for tidkrevende fremgangsmåter som muliggjør analyse av bare noen få genprodukter i parallell, så som in situ hybridisering, immunhistokjemi og qPCR, fremstilling av cDNA-biblioteker forhigh-throughput sekvensering kan gi informasjon av hele transkriptomet. Observasjon av de eksperimentelle effekter på ekspresjonsnivåer av hver enkelt gen kan i sin tur gi kraftige innsikt om trasé endret ved konstruksjonen anvendes. Dette er spesielt lett hvis en genomisk sammenstilling for den organisme som anvendes er tilgjengelig, igjen er således chick embryo en passende modell.
Hvis brukeren har tilgang til en pålitelig genomsekvense sentrum den viktigste saken å oppnå høy kvalitet RNA prøver. Dette arbeidet viser en fremgangsmåte for oppnåelse av RNA-prøver fra transfekterte nevrale rør som er egnet for RNA-Seq, samt nedstrøms for fremgangsmåten i silico-analyse av de resulterende datasett. Etter elektroporering på HH12-13 etterfulgt av 48 timers inkubasjon ble transfektert trunk ryggmargs halvdeler dissekert i ribonuklease frie forhold, umiddelbart lysert og videre beskyttet mot nedbrytning av ultra-lavt fryse før RNA rensing og bibliotek forberedelse;ion.
The Galaxy offentlig server 10 gir tilgang til gratis ressurser for å analysere high-throughput sekvense data. Mengden plass tilbudt for registrerte brukere er nok for små eksperimenter, og dermed eliminere behovet for lokal beregnings infrastruktur. RNA-Seq dataanalyse inkluderer filtrering, justering og kvantifisering / sammenligning av genuttrykk. Selv om det er generelle retningslinjer for RNA-Seq dataanalyse, vil filtreringsparametre i stor grad avhenge av kvaliteten på sekvensering og bør bestemmes etter kvalitetskontroll analyse av rådata.
Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å innhente og sammenligne RNA-Seq profiler fra kylling embryonale ryggmargen transfektert in vivo. Som et representativt resultat av sammenligning av datasett oppnådd fra to uavhengige kontrollprøver transfektert med tom vektor viste at metoden er reproduserbar, og bør tillate identifisering av differensielt expresaliserte utskrifter i eksperimentelle prøver. Derfor har anvendelsen av denne fremgangsmåte potensial til å betydelig øke antall oppdagelser etter en enkelt eksperiment, og således tilveiebringe et stort sett av data for etterfølgende undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. electroporate den Construct av interesse i Neural Rør av HH12-13 Chicken embryoene i ovo
Bruk en fluorescerende reporter, fortrinnsvis i en bicistronisk avskrift eller smeltet til protein av interesse med en interkalerende viral 2a peptid 11, for å muliggjøre rask identifisering av personer med tilfredsstillende nivåer av transfeksjon. MERK: Typisk Inkubasjonstiden for dette trinn er rundt 48 timer ved 37,8 ° C.
- Åpne et lite vindu i eggene etter fjerning av 3 ml av albumin med en sprøyte koblet til en 18 G x 1 1/2 nål. Å forbedre embryo visualisering, injisere en liten mengde tusj fortynnet 1:50 i steril Ringers løsning under embryo 1-4.
- Etter å ha kjørt embryoet med steril Ringers oppløsning, injiserer en 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 og 0,1% Food Dye (F, D & C) oppløsning inneholdende 2,5 pg / pl DNA gjennom den bakre ende av det nevrale røret til det fylleropp til hindbrain regionen. For å electroporate, posisjonsplatinaelektroder (0,5 mm i diameter) adskilt av en 4 mm langs flanken regionen og leverer fem pulser av 50 msec og 20 V med et intervall på 100 millisekunder mellom dem 4.
- Etter elektroporering, inkuber manipulerte embryo i 48 timer mer før de når stadiet HH23 og identifisere enkeltpersoner presentere høyt nivå av transfeksjon på flanken område under en fluorescerende stereomikroskop.
MERK: Varigheten av inkubering etter elektroporering avhenger av Målet med eksperimentet. De elektroporerte plasmider kan generere betydelige uttrykk nivåer etter 2 timer 2. Dermed, hvis interesse ligger i tidlig debut gener etter elektroporering inkubasjonstiden kan reduseres.
2. Harvests Vellykket Transfekterte Embryoet og Skjær elektroporerte ryggmarg halvdeler
MERK: Denne prosedyren varer 2-3 timer for hver 10 embryoer og gir en-2 Mikrogram total RNA per embryo. Disseksjon av nevrale rør krever gode bevegelser og noen øvelser kan være nødvendig før du bruker den til eksperimentelle prøver.
- Dekontaminere metalliske disseksjon verktøy med RNase dekontaminering løsning eller ved baking ved 150 ° C i 4 timer 12 og forberede DEPC-behandlet PBS. Bruk kun ny sertifisert RNase-fritt plasticware.
MERK: Etter høsting, er det viktig å følge standardbehandling for å hindre RNase forurensning under disseksjon. - Høste embryoer ved hjelp av et par fine disseksjonssaksen og en siktet samling skje. Hold embryoene i kaldt DEPC-behandlet PBS i en 100 mm petriskål.
- Med et par fine pinsett, kuttet ut hele flanken regionen (mellom den bakre grensen av fremre benet knopp og fremre grense på bakre lem knopp) og overføre denne delen til en ny rett som inneholder kaldt DEPC-behandlet PBS.
- Bruk to fine glass nåler å perforere på tre forskjelligepeker på hver dorsolateral side av embryoet mellom nevralrøret og paraksiale mesoderm.
- Introdusere de to glass nåler i den sentrale perforering og sakte flytte en av dem bort sammen nevralrøret anterior-posterior aksen. Gjenta dette for de perforeringer som ikke ble nådd av de første bevegelsene. Ta av frittliggende paraksiale mesoderm med et par fine pinsett.
- Snu embryo sidelengs, setter tuppen av pinsett mellom nevralrøret og ryggstreng og skyve dem i motsatte retninger langs anterior-posterior aksen for å skille de to strukturene.
MERK: Dette bør også fjerne det meste av mesoderm fortsatt festet til nevralrøret. - Om nødvendig, fjern eventuelle større biter av mesodermic vev som forblir festet ved å trekke med en pinsett, mens du holder lett nevralrøret med en annen pinsett. Når du er ferdig, forsiktig overføre nevralrøret til en annen skål med kaldt DEPC-behandlet PBS ved hjelp av enRNase-fritt glass Pasteur pipette koplet til en manuell pipette pumpe og holde på is inntil alle rør er dissekert.
- Del nevrale rør i to halvdeler. For dette, må du sette den skarpe enden av en lukket pinsett i lumen og åpne taket plate ved å flytte pinsett ut gjennom den. Etter dette, skille de to halvdelene ved å kutte gulvplate med pinsett tips.
- Sorter elektroporert fra ikke-elektroporert halvdeler i fluorescerende dissekere omfang og overføring til en 1,5 ml rør fylt med iskald DEPC-behandlet PBS. Hvis det er nødvendig, flick mikrorør forsiktig for å løsne alle vev festet til de plastvegger og for å fremme sedimentering av rørene.
- Spin ved 100 xg i 3 sekunder og fjern veldig sakte så mye PBS som mulig med en 1 ml mikropipette. Gjør dette mens du ser på en lyskilde som skinner gjennom microtube til å overvåke om noen embryonale materiale suges til pipettespissen; hvis dette skjer, sakte ut og gjenta sentrifugesjon.
- Legg 70 mL av lysis løsning for RNA ekstraksjon per nevralrøret halvdel og flick røret for å blande innholdet. Inkuber ved romtemperatur i 5 min og virvle kraftig. Gjenta 5 min inkubasjon og vortexblanding to ganger til. Oppbevar ved -80 ° C.
- Samle minst åtte anencephalus halvdeler per prøve for å sikre et tilstrekkelig utbytte for det neste trinn. Pool mindre prøver dersom flere elektroporering / disseksjon økter er nødvendig for å samle tilstrekkelig antall nevrale rør. Oppbevare tilstrekkelige prøver for duplikater eller triplicates for hver tilstand.
3. Rens RNA og Forbered Libraries for Illumina sekvense
- Fjern prøver fra -80 ° C lagring og legg på is i 15-30 min. Gjenoppta tining ved værelsestemperatur inntil fullført.
- Vortex godt og la ved romtemperatur i 5 min. Vortex igjen og sentrifugert ved 15000 xg i 1 min for å pelletere uoppløselig materiale.
- Overfør supernatanten til et nytt rørog fortsette til RNA-ekstraksjon i henhold til de totale RNA isolering kit manuelle instruksjoner. Elueres i den minste anbefalte volumet å øke konsentrasjonen.
MERK: DNase behandling etter clean-up er anbefalt for å unngå potensiell forurensning av genomisk DNA-sekvenser i RNA-Seq datasett. - Flikk røret for å blande innholdet og fjerne fem ul for kvalitetskontroll analyse. Lagre den gjenværende prøven ved -80 ° C inntil bibliotek preparatet; disse prøvene skal ikke tines opp en gang for å unngå RNA degradering.
- Kjør renset RNA i en Bioanalyzer instrument ved hjelp av RNA 6000 Nano kit; RIN-verdien må være minst over 7 for å gå videre.
- Generere bibliotekene ved hjelp av en Illumina kompatibel RNA-Seq bibliotek forberedelse kit og multiplekse opptil fire biblioteker i ett kjørefelt av en HiSeq instrument satt til å generere 100 bp enkelt leser. Hvis det er mulig, inkludere alle prøvene i samme løp for å minimere mulige tekniske gjenstander.
MERK: Dette bør gi opp til 50 millioner rEADS per prøve, noe som er mer enn nok til å oppnå dekning for de fleste 13 gener.
4. sammenligne RNA-Seq datasett i Galaxy Public Server 10.
MERK: Server lagringsplass er begrenset og eksperimenter som sammenligner mange prøver kan kreve sletting av mellom filer generert i filtreringstrinn.
- Opprett en brukerkonto i Galaxy offentlig server ( https://usegalaxy.org ) og FTP laste opp Illumina datasett i fastq format.
- Forbered opplastede filer med FastqGroomer 14 verktøyet under NGS: QC og manipulasjon meny; Hvis kvaliteten score er allerede kodet i Phred + 33 (Sanger), kan du hoppe over dette trinnet ved å endre filtypen til fastqsanger under attributter for hvert datasett.
- Analyser den generelle kvaliteten på hvert datasett bruker FastQC verktøyet under NGS: QC og manipulasjon megnu.
MERK: Spesiell oppmerksomhet bør gis til de resulterende grafikk for per basesekvensen kvalitet og per basesekvensen innhold, da disse vil gi estimater for parametrene som brukes for trimming endene av lyder. - Trim leser å forkaste 3 'slutter med lav kvalitet data ved hjelp av verktøyet FASTQ Quality Trimmer 14 under NGS: QC og manipulasjon menyen. Sett verktøyet til å behandle kun 3 'ender for kvalitetspoeng under 20.
- Fjern adapter sekvenser fra leser bruker Clip verktøyet ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) under NGS: QC og manipulasjon menyen. Sett verktøyet for å forkaste leser med mindre enn 45 bp venstre, inngangs sekvensen til adapteren brukes og velge den utgang for å inkludere både avkuttede og ikke-beskjærte sekvenser. I tillegg velger å ikke forkaste sekvenser med ukjente baser siden de fleste lav kvalitet baser var allerede fjernet i det siste trinnet. Ved hjelp av verktøyet Trim sekvenser ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) under NGS: QC og manipulasjon menyen, trim de første basene av lyder å fjerne 5 'sekvens skjevhet oppdaget av FastQC (vanligvis 10).
MERK: På dette punktet, er det en god idé å kjøre FastQC igjen og sammenligne med forrige analyse for å finne ut om datasettet kvaliteten ble forbedret. - Last ned og pakk ut den nyeste kylling genomet forsamlingen for UCSC genom leseren fra Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) og laste opp hele genomet fasta format filen og gener annotering GTF format filen til Galaxy historie ved hjelp av verktøyet Last opp fil under menyen Get Data.
- Kart leser for hver prøve til kylling genomet ved hjelp av aligner TopHat2 15 etterde NGS: RNA Analyse menyen. Velger å bruke et genom fra History (velg fasta fil lastet opp i trinn 4.7).
- Bygg en spådd transkriptomet for hver prøve ved hjelp Mansjettknapper 16 under NGS: RNA Analyse menyen. Velger å bruke referanse annotering som en guide (velg gtf fil lastet opp i trinn 4.7) og slå på alternativene Utfør Bias Correction (fra History, fasta fil fra trinn 4.7) og Bruk multi-leser riktig.
- Flett spådd transcriptomes for alle prøver ved hjelp Cuffmerge 16 under NGS: RNA Analyse menyen. Velger å bruke referanse annotering (GTF-fil fra trinn 4.7) og sekvensdata (fra History, fasta fil fra trinn 4.7).
- Sammenligne BAM filer generert av TopHat2 for hver prøve ved hjelp Cuffdiff 16 under NGS: RNA Analyse menyen. I felt Transkripsjoner velge megrged transkriptomet generert av Cuffmerge og slå på alternativene Utfør Bias Correction (fra History, fasta fil fra trinn 4.7) og Bruk multi-leser riktig.
- Sorter differensial uttrykk testing tabeller numerisk stigende i kolonne 13 (q-verdi) ved hjelp av verktøyet Sorter under Filter og sorteringsmenyen.
MERK: Gener / karakterutskrifter som viser betydelig differensial uttrykk mellom eksperimentelle forhold vil presentere de laveste q-verdier. - For å sjekke resultatene visuelt med dekning grafer, først konvertere BAM filer til bedGraph format ved hjelp av verktøyet Lag en BedGraph av genom dekning 17 under BEDTools menyen. Deaktivere rapportering av regioner uten dekning, velger å behandle skjøtes oppføringer som distinkte intervaller og skalere dekningen med en faktor som normaliserer sekvensedybde for alle datasettene som sammenlignes.
- Konverter den resulterende bedGraph filen til bigwig format ved hjelp avverktøy Wig / BedGraph-til-bigwig ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) under konvertere formater menyen. Last opp bigwig filer som egendefinerte spor i UCSC genom nettleser ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) for galGal4 montering og søke et gen av interesse å visualisere dekning i datasettene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å validere metoden beskrevet, ble to kontrollprøver genereres fra embryoer elektroporerte med de tomme vektor pMES 7 og en prøve fra embryoer transfektert med samme vektor som inneholder innsatsen konstruere SCRT2-ZNF, som koder for de sink-finger domener av kylling SCRT2 18. Prøver som ga 11-22 mikrogram total RNA hvert ble hentet fra bassenger av 8 til 12 embryoer. Alle tre prøvene scoret RIN en optimal verdi på 10 i en kvalitetssjekk utført med Bioanalyzer instrumentet (figur 1), noe som viser at høy kvalitet RNA kan bli oppnådd med denne protokoll.
Etter sekvensering, øket den beskrevne filtreringsprosessen innrettingshastigheten 83-91% av lese (data ikke vist). Som forventet, sammenligning av transcriptomes fra to kontrollprøver viste ingen klar forskjell når globalt sammenlignet i et spredningsdiagram (figur 2) og Pearson korrelasjonskoeffisient var 0.99. I tillegg, visning av dekning for alle de tre datasett langs locus som inneholder den del av SCRT2 sekvensen viste en klar økning i antall leser tilordnet til denne regionen i den eksperimentelle prøven (figur 3), noe som indikerer at det var overekspresjon vellykket og at forskjeller mellom kontroll og eksperimentelle prøver bør være påvisbart med fremgangsmåten beskrevet her.
Figur 1:. RNA kvalitetskontroll Bioanalyzer electropherograms viser høy grad av integritet for de to kontroll totale RNA prøver indikerte av 18S og 28S ribosomale RNA topper. Innfellinger representerer en virtuell gel for kjøringen.
Figure 2:. reproduserbarhet av RNA-Seq kvantiteringsstandarder resultater spredningsdiagram som viser at RPKM for de fleste gener er den samme i begge kontrollprøver. Nesten alle gener som ikke følger dette mønsteret har svært lave RPKM verdier og dermed blir ignorert fra transkriptom sammenligninger.
Figur 3: Visualisering av forskjeller i en forsøksprøve UCSC Genome Browser visning av SCRT2 locus i genomet kylling (galGal4) som viser en synlig økning i dekningsområdet til den regionen som koder for proteinet domene (SCRT2-ZNF) ectopically uttrykt i. eksperimentelle prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi retningslinjer for å analysere effekter etter elektroporering av kylling ryggmargen. Selv elektroporering av DNA vektorer blir oftere brukt til å overuttrykke et gen av interesse, kan man også bruke konstruksjoner som koder dominerende negativer, quimeric proteiner eller forløpere for sirnas å generere genfunksjon knock-down forhold 19-21. Faktisk kan transkriptom sammenligning av profiler som følge av både gevinst-og tap-av-funksjon-analyse påpeke gener som uttrykkes differensielt i motsatte måter i hver tilstand, og dermed ha potensial til å avdekke mer spesifikke effekter.
Som en hvilken som helst fremgangsmåte anvendes nedstrøms til RNA-ekstraksjon, syntese av RNA-Seq biblioteker krever et minimum innledende mengde av utgangsmateriale. Med denne protokollen, bør 8 embryoer være tilstrekkelig for å gi omkring 10 mikrogram av total RNA. Fra og med et lavere antall individer uten at det går en tilstrekkelig arbeidskonsentrasjon er sannsynligvismulig med bruk av RNA-ekstraksjon systemer som tillater endelig fortynning i mindre volumer.
Riktig segregering av nevralrøret fra alle mesoderm bør praktiseres et par ganger før du bruker til viktige prøver, da dette er en delikat punkt som krever litt kjennskap. For å unngå overdreven RNA-degradering under disseksjonen trinnet, er det også viktig å fullføre hele prosedyren for alle nevrale rør i omtrent 1-2 timer. Igjen, vil praksis være viktig for å bedre disseksjon tid. En viktig observasjon er at forbindelsen mellom mesoderm vev er sterkere enn forbindelsen mellom mesoderm og neural røret, og dermed trekke mesodermal strukturer, spesielt ryggstreng, er mer effektivt enn å prøve å kutte uønsket vev. Også forskere skal føle seg fri til å utvikle sin egen teknikk optimalisert til sine egne disseksjon forhold. Imidlertid bør man være forsiktig for prøvene sammenlignet i en samme eksperiment for å bli dissekert på samme måte, slik at level av forurensning med mesodermal vev er så homogen som mulig mellom prøvene.
Vår protokollen viser sammenligning av transkriptom profiler fra scenen HH23 kylling embryonale ryggmargen transfektert på scenen HH12-13. Imidlertid bør små justeringer la sin søknad til embryoer høstet på tidligere stadier. På den annen side, hvis senere stadier er ønsket for analyse av sluttresultatet, bicistronisk de vektorer som er nevnt kan ikke være egnet på grunn av en kontinuerlig reduksjon i antall molekyler pr celle som utviklings skrider frem. Derfor, særlig hvis det tilsiktede sluttpunkt oppnås etter mer enn 72 timer etter transfeksjon, kan det være nødvendig å bruke vektorer som koder for transposon-mediert integrasjon av genomisk konstruktet blir brukt 22.
Et annet problem som skal vurderes er heterogene elektroporeringsmetoden effektivitet. Antallet av ikke-transfekterte celler varierer fra noen få til en betydelig amount, særlig de i ventral nevralrøret. Siden etter disseksjon alle cellene er utsatt for genetisk analyse, vil en lav virkningsgrad elektroporering analysen følsomhet reduseres. En tilnærming for å anrike prøven med elektroporerte celler er bruk av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) for å redusere populasjonen av ikke-transfekterte celler fra den endelige prøven 23. Hvis en slik fremgangsmåte anvendes, vil imidlertid et større antall embryoer være nødvendig for å oppnå tilstrekkelig kapasitet for RNA-bibliotek Seq preparat.
Illumina sekvense anbefales da dette er mer allment tilbys av sekvenseringssentre og i silico-RNA Seq dataanalyse er forenklet sammenlignet med andre tilgjengelige 24 plattformer. Men andre alternativer er likevel tilstrekkelig med modifikasjoner i data filtrering trinn mer egnet til plattformen valgt. RNA-Seq retningslinjer dataanalyse er fortsatt ikke helt etablert og sammenligning av utganger frOM forskjellige tilgjengelige verktøy, hvorav noen allerede er inkludert i Galaxy offentlig server, er sterkt anbefalt. Ikke desto mindre bør den i silico-analyse beskrevet her være egnet for å oppnå gode sammenligningsresultater av høy kvalitet datasett. Som i alle andre områder i biologi, high-throughput sekvense øker enormt mengden av informasjon som kan hentes fra et enkelt eksperiment, og metoden som er beskrevet her er en måte å bruke det på studiet av ryggmargen utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
