Introduction
Estudos genéticos sobre os organismos vivos utilizam frequentemente o embrião de galinha como modelo porque em eletroporação in ovo representa uma forma rápida e barata para transf parcialmente estruturas embrionárias in vivo com DNA constrói 1-5. Vectores de expressão bicistrónicos que codificam um transcrito contendo um repórter fluorescente em conjunto com o gene de interesse, tais como PCIG 6 ou 7 PMES, permitir a verificação rápida da qualidade transfecção na região desejada sob um microscópio estereoscópico antes de processar os embriões para análise a jusante.
Com os recentes avanços na sequenciação de ADN, é agora possível obter perfis de expressão transcriptoma digitais inteiras a partir de amostras de ARN utilizando ARN-8,9 Seq. Portanto, em vez de métodos demorados que permitem a análise de apenas alguns produtos de genes em paralelo, tais como hibridação in situ, imuno-histoquímica e qPCR, preparação de bibliotecas de cDNA parade alto rendimento seqüenciamento pode fornecer informações de todo o transcriptoma. Observação dos efeitos experimentais sobre os níveis de cada gene único de expressão podem, por sua vez fornecem insights poderosos sobre os percursos alterados pela construção usado. Isto é particularmente fácil, se uma montagem genómico para o organismo utilizado, está disponível, assim, o embrião de galinha é novamente um modelo adequado.
Se o usuário tem acesso a um centro de sequenciamento do genoma de confiança, a questão principal é a obtenção de amostras de RNA de alta qualidade. Este trabalho demonstra um método para a obtenção de amostras de ARN a partir de tubos neurais transfectadas adequadas para a RNA-Seq, bem como os passos a jusante para a análise in silico dos conjuntos de dados resultantes. Após eletroporação em HH12-13 seguido de 48 horas de incubação, tronco transfectadas metades da medula espinhal foram dissecados em condições livres de ribonuclease, imediatamente lisadas e mais protegida da degradação por ultra-baixo de congelamento até purificação RNA e biblioteca preparatião.
O servidor público Galaxy 10 fornece acesso a recursos livres para análise de dados de sequenciamento de alto rendimento. A quantidade de espaço oferecido para usuários registrados é suficiente para pequenos experimentos, eliminando assim a necessidade de infra-estrutura computacional local. A análise de dados de RNA-Seq inclui filtragem, alinhamento e quantificação / Comparação da expressão do gene. Embora existam diretrizes gerais para a análise de dados de RNA-Seq, parâmetros de filtragem dependerá em grande parte a qualidade do sequenciamento e deve ser determinada após a análise dos dados brutos de controle de qualidade.
Este protocolo descreve os passos para obter e comparar os perfis de RNA-Seq de frango embrionário medulas espinhais transfectadas in vivo. Como um resultado representativo, a comparação de conjuntos de dados obtidos a partir de duas amostras de controlo independentes transfectadas com um vector vazio mostraram que o método é reprodutível e deve permitir a identificação de expres diferencialmentetranscrições sed em amostras experimentais. Portanto, a aplicação deste método tem o potencial para aumentar grandemente o número de descobertas após uma única experiência e, assim, proporcionar um grande conjunto de dados para investigação posterior.
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Protocol
1. electroporate do construto de interesse nos tubos neurais da HH12-13 frango embriões no ovo
Usar um repórter fluorescente, de preferência, em uma transcrição bicistr�ica ou fundido com a proteína de interesse com um péptido intercalante 2a viral 11, para permitir uma rápida identificação de indivíduos com níveis satisfatórios de transfecção. NOTA: O tempo de incubação típico para esta fase é de cerca de 48 horas a 37,8 ° C.
- Abrir uma pequena janela em que os ovos após a remoção de 3 ml de albumina com uma seringa acoplada a um 18 G x 1 1/2 agulha. Para melhorar a visualização do embrião, injetar uma pequena quantidade de tinta nanquim diluída 1:50 em solução de Ringer estéril sob o embrião 1-4.
- Depois de cobrir o embrião com a solução estéril de Ringer, injectar uma solução de 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 e 0,1% Corante Alimentar (F, D e C) contendo 2,5 mg / mL de ADN através da extremidade posterior do tubo neural, até que preenchaaté a região hindbrain. Para electroporate, eletrodos de platina posição (0,5 milímetros de diâmetro) separados por quatro milímetros ao longo de uma região do flanco e entregar cinco pulsos de 50 ms e 20 V com um intervalo de 100 ms entre eles 4.
- Após eletroporação, incubar os embriões manipulados por 48 horas mais até atingirem estágio HH23 e identificar indivíduos com alto nível de transfecção na região flanco sob microscópio estereoscópico fluorescente.
NOTA: A duração da incubação após a electroporação depende do objectivo da experiência. Os plasmídeos eletroporados pode gerar níveis de expressão significativa após 2 horas 2. Assim, se o interesse reside nos genes de início precoce do período de incubação pós-electroporação pode ser reduzida.
2. Colheita sucesso Transfected Embriões e dissecar as Metades Medula Espinhal electroporados
NOTA: Este procedimento dura 2-3 horas para cada 10 embriões e rendimentos 1-2 Ug de RNA total por embrião. A dissecção de tubos neurais requer movimentos finos e algumas sessões de prática pode ser necessária antes de aplicá-lo a amostras experimentais.
- Descontaminar instrumentos de dissecação metálicas com solução de descontaminação de RNase ou por cozedura a 150 ° C durante 4 h 12 e preparar tratada com DEPC PBS. Use somente novo plasticware livre de RNase certificado.
NOTA: Após a colheita, é importante seguir o tratamento padrão para evitar a contaminação RNase durante a dissecção. - Colher os embriões usando um par de tesouras de dissecação multa e uma colher coleção peneirada. Manter os embriões no frio tratada com DEPC PBS numa placa de Petri de 100 milímetros.
- Com um par de pinças finas, cortar a região do flanco inteiro (entre o limite posterior do broto de membro anterior eo limite anterior do broto de membro posterior) e transfira esta seção para um novo prato contendo frio tratados com DEPC PBS.
- Use duas agulhas de vidro finos para perfurar em três diferentesaponta em cada lado dorsolateral do embrião entre o tubo neural e da mesoderme paraxial.
- Introduzir as duas agulhas de vidro na perfuração central e mover-se lentamente uma delas distância ao longo do tubo do eixo ântero-posterior neural. Repita esse procedimento para as perfurações que não foram alcançados pelos primeiros movimentos. Retire a mesoderme paraxial isolada com um par de pinças finas.
- Ligue o embrião lateralmente, inserir as pontas das pinças entre o tubo neural e da notocorda e deslizá-los em sentidos opostos ao longo do eixo ântero-posterior para separar as duas estruturas.
NOTA: Este também deve remover a maior parte da mesoderme ainda ligado ao tubo neural. - Se necessário, retire todos os pedaços maiores de tecido mesodérmica que permanecem ligados puxando com um par de pinças, enquanto levemente segurando o tubo neural com outro par de pinças. Quando terminar, gentilmente transferir o tubo neural para outro prato contendo frio tratados com DEPC PBS usando umLivre de RNase pipeta de Pasteur de vidro acoplado a uma bomba de pipeta manual e manter em gelo até que todos os tubos são dissecados.
- Dividir os tubos neurais em duas metades. Para isso, insira a ponta afiada de um par de pinças fechado na luz e abrir a placa de telhado movendo a pinça para fora através dele. Após isso, separar as metades cortando a placa de piso com as pontas pinças.
- Ordenar electroporadas a partir de metades não-electroporado sob um escopo de dissecação fluorescente e transferir para um tubo de 1,5 ml cheio com gelado tratada com DEPC PBS. Se necessário, os microtubos agite suavemente para libertar qualquer tecido ligado às paredes de plástico e para promover a sedimentação dos tubos.
- Rotação a 100 xg por 3 segundos e remover muito lentamente, tanto PBS possível com uma micropipeta de 1 ml. Faça isso enquanto olha para uma fonte de luz que brilha através do microtubo para monitorar se qualquer material embrionário é sugado para a ponta da pipeta; se isso acontecer, lentamente descarregar e repita a centrifugação.
- Adicionar 70 ml de solução de lise para extração de RNA por tubo neural metade e apertar o tubo para misturar o conteúdo. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min e vórtex vigorosamente. Repetir a 5 min de incubação e vórtex mais duas vezes. Armazenar a -80 ° C.
- Recolher pelo menos oito metades do tubo neural por amostra para garantir um rendimento adequado para o passo seguinte. Piscina amostras menores se várias sessões de eletroporação / dissecação são obrigados a acumular número suficiente de tubos neurais. Armazenar amostras suficientes para duplicatas ou triplicatas para cada condição.
3. Purify RNA e Prepare Bibliotecas para Illumina Sequencing
- Retirar amostras de -80 ° C de armazenamento e colocar no gelo por 15-30 min. Retomar o descongelamento à temperatura ambiente até estar completa.
- Vortex bem e deixe em temperatura ambiente por 5 min. Vortex e centrifuga-se novamente a 15000 xg durante 1 min para sedimentar o material insolúvel.
- Transferir o sobrenadante para um novo tuboe proceder à extração de RNA de acordo com as instruções de isolamento de RNA total de manuais kit. Eluir no volume mínimo recomendado para aumentar a concentração.
NOTA: tratamento DNase após clean-up é recomendado, a fim de evitar a contaminação potencial de sequências genômicas de DNA em RNA-Seq conjuntos de dados. - Flick o tubo para misturar o conteúdo e remover 5 mL para análise de controle de qualidade. Armazenar o restante amostra a -80 ° C até à preparação da biblioteca; estas amostras devem ser descongeladas apenas uma vez para evitar a degradação do RNA.
- Executar RNA purificado em um instrumento Bioanalyzer usando o kit RNA 6000 Nano; RIN valor deve ser, pelo menos, acima de 7 para prosseguir.
- Gerar bibliotecas usando um kit de preparação biblioteca RNA-Seq compatível Illumina e multiplexar até quatro bibliotecas em uma pista de um instrumento HiSeq definido para gerar 100 pb única lê. Se possível, inclua todas as amostras no mesmo prazo para minimizar potenciais artefatos técnicos.
NOTA: Este deve produzir até 50 milhões de rEADS por exemplo, que é mais do que suficiente para obter cobertura para a maioria dos genes 13.
4. Compare os conjuntos de dados de RNA-Seq no Servidor Público Galaxy 10.
NOTA: o espaço de armazenamento do servidor é limitado e experimentos comparando muitas amostras podem requerer a exclusão de arquivos intermediários gerados nas etapas de filtragem.
- Criar uma conta de usuário no servidor público Galaxy ( https://usegalaxy.org ) e FTP upload dos conjuntos de dados Illumina em formato fastq.
- Prepare os arquivos enviados com a ferramenta FastqGroomer 14 do NGS: menu de QC e manipulação; se os índices de qualidade já são codificados em Phred + 33 (Sanger), ignore esta etapa, simplesmente mudando o tipo de arquivo para fastqsanger sob os atributos para cada conjunto de dados.
- Analisar a qualidade geral de cada conjunto de dados usando a ferramenta FastQC sob a NGS: QC e manipulação menu.
NOTA: Deve ser dada especial atenção aos gráficos resultantes para o conteúdo sequência de bases por qualidade sequência de bases e por, como estes irão fornecer estimativas para os parâmetros usados para aparar as extremidades da lê. - Aparar lê descartar 3 'com dados de baixa qualidade, utilizando a ferramenta FASTQ Qualidade Trimmer 14 do NGS: menu de QC e manipulação. Definir a ferramenta para processar apenas 3 'para o índice de qualidade inferior a 20.
- Remover seqüências adaptadoras de lê usando a ferramenta Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sob a NGS: menu de QC e manipulação. Definir a ferramenta para descartar leituras com menos do que 45 bp para a esquerda, a sequência de entrada do adaptador usado e escolher a saída de modo a incluir ambas as sequências cortadas e não-cortadas. Além disso, optar por não descartar sequências com bases desconhecidos pois a maioria das bases de baixa qualidade já foram removidos na última etapa. Usando a ferramenta de sequências de guarnição ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ), sob a NGS: QC e menu de manipulação, apare as primeiras bases da lê para remover 5 'viés seqüência detectada por FastQC (normalmente 10).
NOTA: Neste ponto, é uma boa idéia para executar FastQC novamente e comparar com a análise anterior para determinar se a qualidade do conjunto de dados foi melhorada. - Baixe e descompacte o mais recente montagem do genoma da galinha para o navegador genoma UCSC de Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) e fazer o upload de todo o arquivo de formato genoma fasta eo arquivo de formato GTF anotação genes para a história da galáxia utilizando a ferramenta de upload de arquivos no menu Obter dados.
- Mapa lê para cada amostra para o genoma de galinha utilizando o alinhador TopHat2 15 sobos NGS: menu de Análise RNA. Escolha usar um genoma de História (selecione o arquivo fasta carregado no passo 4.7).
- Construir um transcriptoma previsto para cada amostra usando abotoaduras 16 sob as NGS: menu de Análise RNA. Escolha usar anotação de referência como guia (selecione o arquivo GTF carregado no passo 4.7) e ativar as opções de realizar correção de viés (de História, arquivo fasta do passo 4.7) e usar multi-leitura correta.
- Mesclar transcriptomes previstos para todas as amostras usando Cuffmerge 16 sob a NGS: Menu Análise de RNA. Escolha usar anotação de referência (arquivo GTF do passo 4.7) e dados de sequências (de História, arquivo fasta do passo 4.7).
- Compare arquivos BAM gerados por TopHat2 para cada amostra usando Cuffdiff 16 sob a NGS: Menu Análise RNA. Nas transcrições de campo, selecione a metranscriptoma rged gerado pelo Cuffmerge e ativar as opções de realizar correção de viés (de História, arquivo fasta do passo 4.7) e usar multi-leitura correta.
- Ordenar expressão diferencial testar tabelas numericamente ascensão na coluna 13 (valor q) usando o Sort ferramenta sob o menu Filtro e classificar.
NOTA: Genes / transcrições mostrando expressão diferencial significativa entre as condições experimentais serão apresentados os valores de q menores. - Para verificar os resultados visualmente com gráficos de cobertura, primeiro converter arquivos para o formato BAM bedGraph utilizando a ferramenta Criar um BedGraph de cobertura do genoma 17 sob o menu BEDTools. Desativar relatório de regiões sem cobertura, escolha para tratar entradas emendados como intervalos distintos e dimensionar a cobertura por um fator que normaliza profundidade sequenciamento para todos os conjuntos de dados que estão sendo comparados.
- Converter o arquivo para o formato bedGraph resultando figurão usando oferramenta peruca / BedGraph-a-mandachuva ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) no menu Formatos converter. Faça o upload dos arquivos bigwig como faixas personalizadas no navegador UCSC genoma ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) para a montagem galGal4 e procurar um gene de interesse para visualizar a cobertura nos conjuntos de dados.
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Representative Results
Para validar o método descrito, duas amostras de controlo foram gerados a partir de embriões electroporadas com as PMEs de vetores vazios 7 e uma amostra a partir de embriões transfectadas com o mesmo vector contendo a inserção construir SCRT2-ZnF, que codifica os domínios dedo-de-zinco de frango SCRT2 18. As amostras de RNA total produzindo 11-22 g cada foram obtidos a partir de misturas de 8 a 12 embriões. Todas as três amostras teve um valor óptimo RIN em 10 de um controlo de qualidade realizada com o instrumento Bioanalyzer (Figura 1), demonstrando que o RNA de alta qualidade pode ser obtida com este protocolo.
Após sequenciação, o processo de filtragem descrito aumentou a taxa de alinhamento 83-91% de lê-se (dados não mostrados). Como esperado, a comparação dos transcriptomes a partir de duas amostras de controlo não mostrou qualquer diferença clara quando comparadas globalmente num gráfico de dispersão (Figura 2) e o coeficiente de correlação de Pearson foi 0.99. Além disso, o visor de cobertura para todos os três conjuntos de dados ao longo do lugar geométrico que contém a porção da sequência de SCRT2 mostrou um claro aumento do número de leituras mapeadas para esta região na amostra experimental (Figura 3), indicando que a sobre-expressão foi bem sucedida e que as diferenças entre o controlo e amostras experimentais deveriam ser detectáveis com o método descrito aqui.
Figura 1:. RNA controle de qualidade Bioanalyzer electrofogramas mostrando alto nível de integridade para o total de amostras de RNA de dois de controle indicadas pelas 18S e 28S picos de RNA ribossômico. Inserções representam um gel virtual para o prazo.
Figure. 2: Reprodutibilidade dos resultados de quantificação de RNA-Seq dispersão que mostra que a maioria dos genes para RPKM é o mesmo em ambas as amostras de controlo. Praticamente todos os genes que não seguem esse padrão têm valores muito baixos RPKM e, assim, são geralmente ignoradas a partir de comparações transcriptoma.
Figura 3: A visualização das diferenças de uma amostra experimental de exibição do navegador UCSC Genoma do locus SCRT2 no genoma de galinha (galGal4) mostrando um aumento visível na cobertura da região que codifica para o domínio de proteína (SCRT2-ZnF) ectopicamente expressa na. amostra experimental.
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Discussion
Aqui nós fornecemos orientações para a análise dos efeitos após a eletroporação do frango medula espinhal. Embora eletroporação de vetores de DNA é mais freqüentemente usado para superexpressão de um gene de interesse, pode-se também usar construções que codificam negativos dominantes, proteínas quimeric ou precursores de siRNAs para gerar condições de função do gene knock-down 19-21. Na verdade, a comparação de perfis de transcriptoma resultantes de ambos gain- e análise por perda de função pode apontar genes diferencialmente expressos em sentidos opostos em cada condição, tendo assim o potencial de revelar efeitos mais específicos.
Como qualquer método aplicado a jusante para a extracção de ARN, síntese de bibliotecas de ARN-Seq requer uma quantidade mínima inicial de material de partida. Com este protocolo, 8 embriões devem ser suficientes para se obter cerca de 10 ug de RNA total. Começando com um menor número de indivíduos sem comprometer a uma concentração de trabalho adequado é, provavelmente,possível com a utilização de sistemas de extracção de ARN que permitem diluição final em volumes mais pequenos.
Segregação adequada do tubo neural de todo mesoderme deve ser praticado algumas vezes antes de aplicar a amostras importantes, como este é um passo delicado que requer alguma familiaridade. Para evitar a excessiva degradação de ARN durante a fase de esvaziamento, é também importante para completar todo o procedimento para todos os tubos neurais em cerca de 1-2 horas. Mais uma vez, a prática será importante para melhorar o tempo de dissecção. Uma observação importante é que a ligação entre os tecidos da mesoderme é mais forte do que a ligação entre mesoderme e tubo neural, puxando assim as estruturas mesodérmica, especialmente o notocórdio, é mais eficiente do que tentando cortar tecido indesejado. Além disso, os pesquisadores devem se sentir livres para desenvolver sua própria técnica otimizada para as suas próprias condições de dissecação. No entanto, cuidados devem ser tomados para amostras comparadas em um mesmo experimento a ser dissecado de forma semelhante para que level de contaminação com tecidos mesodérmicos é tão homogéneo quanto possível entre as amostras.
Nosso protocolo demonstra a comparação dos perfis do transcriptoma do estágio HH23 frango medulas embrionárias transfectadas na fase HH12-13. No entanto, pequenos ajustes devem permitir a sua aplicação aos embriões colhidos em fases anteriores. Por outro lado, se as fases posteriores são desejados para a análise do resultado final, os vectores bicistrónicos mencionados podem não ser adequados devido a uma redução contínua do número de moléculas por célula, como que prossegue o desenvolvimento. Portanto, especialmente se o ponto final pretendido é conseguido após mais de 72 horas após a transfecção, pode ser necessário o uso de vectores que codificam transposão mediada integração genómica da construção a ser utilizado 22.
Outra questão a ser considerada é a heterogeneidade da eficiência electroporação. O número de células não transfectadas varia de alguns a uma amo considerávelUNT, especialmente os do tubo neural ventral. Uma vez que após a dissecação, todas as células são submetidas a análise de jusante, uma baixa eficiência de electroporação vai reduzir a sensibilidade do ensaio. Uma abordagem para enriquecer a amostra com células electroporadas é a utilização de células activadas por fluorescência (FACS) para reduzir a população de células não-transfectadas a partir da amostra final 23. Se esta abordagem for usada, no entanto, um maior número de embriões será necessário para alcançar o rendimento suficiente para a preparação da biblioteca de ARN-Seq.
Illumina sequenciamento é recomendada, pois é mais amplamente oferecidos por centros de seqüenciamento e análise de dados in silico RNA-Seq é simplificada quando comparado a outras plataformas disponíveis 24. No entanto, outras opções ainda são adequados com modificações na filtragem de dados passos mais adequado para a plataforma escolhida. Diretrizes de análise de dados de RNA-Seq ainda não estão completamente estabelecidos e comparação das realizações frferramentas disponíveis diferentes om, alguns dos quais já estão incluídos no servidor público Galaxy, é altamente recomendável. No entanto, a análise in silico descrita aqui deve ser adequado para a obtenção de bons resultados de comparação a partir de conjuntos de dados de alta qualidade. Tal como em todas as outras áreas da biologia, de alto rendimento de sequenciação aumenta enormemente a quantidade de informação que pode ser obtida a partir de uma única experiência, e o método aqui descrito é uma forma de aplicá-lo para o estudo do desenvolvimento da espinal medula.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
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