Introduction
מחקרים גנטיים באורגניזמים חיים משתמשים לעתים קרובות עובר העוף כמודל כי בelectroporation אובו מייצג דרך מהירה וזולה לtransfect מבנים עובריים באופן חלקי in vivo עם הבונה DNA 1-5. וקטורי ביטוי bicistronic שמקודדים תמליל אחד המכיל כתב ניאון יחד עם הגן של עניין, כגון pCIG 6 או 7 pMES, לאפשר אימות מהירה של איכות transfection באזור שתחת סטראו לפני העיבוד עובר לניתוח במורד הזרם.
עם התקדמות ברצף ה- DNA, ניתן כיום להשיג פרופילי ביטוי transcriptome כל דיגיטליים מדגימות RNA באמצעות RNA-Seq 8,9. לכן, במקום בשיטות זמן רב המאפשרות ניתוח של רק כמה מוצרי גן במקביל, כגון הכלאה באתר, אימונוהיסטוכימיה וqPCR, הכנה של ספריות cDNA לרצף תפוקה גבוהה יכול לספק מידע של כל transcriptome. תצפית של תופעות הניסיוניות ברמות הביטוי של כל גן עשויה בתורו לספק תובנות רבות עוצמה על המסלולים שונים על ידי המבנה המשמש. זה קל במיוחד אם הרכבה הגנומי לאורגניזם המשמש נגיש, ובכך עובר האפרוח שוב הוא מודל מתאים.
אם למשתמש יש גישה למרכז רצף הגנום אמין, הבעיה העיקרית היא קבלת דגימות RNA באיכות גבוהה. עבודה זו מדגימה שיטה לקבלת דגימות RNA מצינורות transfected עצביים מתאימים לרנ"א-Seq, כמו גם הצעדים במורד הזרם בניתוח סיליקון ושל מערכי נתונים וכתוצאה מכך. לאחר electroporation בHH12-13 אחרי 48 דגירה שעה, חצאים חוט השדרה גזע transfected נותחו בללא תנאי ribonuclease, lysed באופן מיידי ועוד מוגן מפני השפלה ידי הקפאה נמוכה במיוחד עד לטיהור RNA וpreparat הספרייהיון.
השרת הציבורי גלקסי 10 מספק גישה למשאבים פנויים לניתוח נתונים רצף תפוקה גבוהה. כמות השטח המוצעת למשתמשים רשומים מספיק לניסויים קטנים, ובכך מבטלת את הצורך בתשתית החישובית מקומית. ניתוח נתוני RNA-Seq כולל סינון, יישור וכימות / השוואה של ביטוי גנים. למרות שיש הנחיות כלליות לניתוח נתונים RNA-Seq, פרמטרים לסינון יהיו תלויים במידה רבה באיכות של רצף וצריכים להיקבע לאחר ניתוח בקרת האיכות של הנתונים הגולמיים.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים להשגה ולהשוות פרופילי RNA-Seq מחוט שדרת עוף עוברי transfected in vivo. כתוצאה מכך נציג, השוואה של מערכי נתונים שהתקבלו משתי דגימות שליטה עצמאיות transfected עם וקטור ריק הראתה כי השיטה ניתנת לשחזור וצריכה לאפשר זיהוי של Expres באופן דיפרנציאליתמלילי SED בדגימות ניסוי. לכן, יישום של שיטה זו יש הפוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את מספר התגליות לאחר ניסוי אחד בודד ובכך לספק קבוצה גדולה של נתונים לחקירה שלאחר מכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Electroporate Construct עניינים בצינורות העצבי של HH12-13 עוף עוברים באוב
השתמש בכתב ניאון, רצוי בתמליל bicistronic או התמזג החלבון של עניין עם פפטיד 2a הנגיפי intercalating 11, כדי לאפשר זיהוי מהיר של אנשים עם רמות מספקות של transfection. הערה: זמן דגירה אופייני בשלב זה הוא כ 48 שעות ב37.8 מעלות צלזיוס.
- פתח חלון קטן בביצים לאחר הסרת 3 מיליליטר של אלבומין עם מזרק מצמידים x 1 1/2 מחט 18 G. כדי לשפר את ההדמיה עובר, להזריק כמות קטנה של הדיו ההודי מדולל 01:50 בפתרון של רינגר סטרילית מתחת לעובר 1-4.
- לאחר שכיסה את העובר עם הפתרון של רינגר סטרילית, להזריק פתרון 10 מ"מ טריס HCl, pH 8.2 ו 0.1% מזון צבע (F, D & C) המכיל 2.5 מיקרוגרם / μl DNA באמצעות הקצה האחורי של הצינור העצבי עד שהיא ממלאתעד לאזור המוח האחורי. לelectroporate, אלקטרודות עמדת פלטינה (0.5 מ"מ קוטר) מופרדות על ידי 4 מ"מ 1 לאורך אזור האגף ולספק 5 פולסים של 50 מילים-שני ו -20 V עם מרווח של ביניהם 4 100 אלפיות שניים.
- לאחר electroporation, דגירה עוברי מניפולציות במשך 48 שעות יותר עד שהם מגיעים HH23 במה ולזהות אנשים המציגים רמה גבוהה של transfection באזור האגף תחת סטראו ניאון.
הערה: משך הדגירה לאחר electroporation תלויה במטרת הניסוי. פלסמידים electroporated יכולים להפיק רמות ביטוי משמעותיות לאחר שעה 2 2. לכן, אם העניין הוא בגנים בגיל מוקדם יכולה להיות מופחתת תקופת הדגירה לאחר electroporation.
2. קציר transfected בהצלחה עוברים ולנתח את החצאים כבל Electroporated השדרה
הערה: הליך זה נמשך 2-3 שעות לכל 10 עוברים ותשואות 1-2 רנ"א הכל מיקרוגרם לכל עובר. הנתיחה של צינורות עצביים דורשת תנועות עדינות וחלק אימונים עשויים להיות נחוצים לפני החלת את דגימות ניסוי.
- לטהר כלים לנתיחה מתכתיים עם פתרון טיהור RNase או על ידי אפייה ב -150 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות 12 ולהכין PBS DEPC שטופל. השתמש plasticware RNase ללא בלבד החדש המאושר.
הערה: לאחר קציר, זה חשוב לעקוב אחר טיפול סטנדרטי למניעת זיהום RNase במהלך נתיחה. - קציר עובר באמצעות מספריים לנתח קנס וכפית אוסף הסתננה. שמור את העוברים בPBS DEPC שטופל קר בצלחת פטרי 100 מ"מ.
- עם פינצטה בסדר, לחתוך את אזור כולו האגף (בין הגבול האחורי של ניצן הגפה הקדמי והגבול הקדמי של ניצן הגפה האחורית) ולהעביר סעיף זה לצלחת חדשה המכילה PBS DEPC שטופל קר.
- השתמש בשתי מחטי זכוכית עדינות ללנקב בשלוש שונהמצביע בכל צד דורסולטרלי של העובר בין הצינור העצבי והמזודרם הפרקסיאלית.
- להציג את שתי מחטי הזכוכית בניקוב המרכזי ולנוע באיטיות אחד מהם משם לאורך הציר הקדמי-אחורית בצינור העצבי. חזור על פעולה זו לנקבים שלא הגיעו על ידי התנועות הראשונות. הסר את המזודרם הפרקסיאלית המנותק עם פינצטה בסדר.
- הפעל את העובר לצדדים, להכניס את הטיפים של פינצטה בין הצינור העצבי וnotochord ולהחליק אותם בכיוונים מנוגדים לאורך הציר הקדמי-אחורי כדי להפריד בין שני המבנים.
הערה: זה אמור גם להסיר את רוב המזודרם עדיין מחוברים לצינור העצבי. - אם יש צורך, להסיר כל חתיכות גדולות יותר של רקמת mesodermic שנותרו מחוברים על ידי משיכת עם פינצטה תוך החזקה קלה בצינור העצבי עם זוג נוסף של פינצטה. בסיום, בעדינות להעביר את הצינור העצבי למנה נוספת המכיל PBS DEPC שטופל קר באמצעותפיפטה פסטר זכוכית RNase ללא מצמידים את משאבת פיפטה ידנית ולשמור על קרח עד שכל הצינורות הם גזורים.
- מחלקים את הצינורות העצביים לשני חצאים. לשם כך, הכנס את הקצה החד של זוג סגור של פינצטה בלום ולפתוח את גג הצלחת על ידי הזזת את פינצטה דרכו. אחרי זה, להפריד את החצאים על ידי חיתוך צלחת הרצפה עם הטיפים פינצטה.
- electroporated מיין מחצאים-electroporated שאינם תחת בהיקף ניאון לנתח ולהעביר צינור 1.5 מיליליטר מלא PBS DEPC שטופל קר כקרח. במידת צורך, קפיצי microtubes בעדינות כדי לשחרר את כל רקמה הצמודה לקירות הפלסטיק ולקדם שקיעה של הצינורות.
- ספין בבמשך 3 שניות 100 XG ולהסיר לאט לאט ככל PBS ככל האפשר עם micropipette 1 מיליליטר. עושה זאת תוך מסתכל על מקור אור שזורח דרך microtube כדי לפקח אם כל חומר עוברי נשאב לקצה פיפטה; אם זה קורה, לפרוק לאט ולחזור על centrifugation.
- להוסיף 70 μl של פתרון תמוגה להפקת RNA לכל חצי צינור עצבי והזיז את הצינור לערבב תוכן. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ומערבולת במרץ. חזור על הדגירה 5 דקות וvortexing עוד פעמיים. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- לאסוף לפחות שמונה חצאים צינור עצביים לדגימה כדי להבטיח תשואה נאותה לשלב הבא. בריכת מדגמים קטנים יותר אם מספר מפגשי electroporation / נתיחה נדרשים לצבור מספר מספיק של צינורות עצביים. אחסן דגימות מספיקות לכפילויות או triplicates עבור כל תנאי.
3. לטהר RNA והכן ספריות לרצף Illumina
- הסר דגימות מאחסון -80 ° C ומניח על קרח במשך 15-30 דקות. קורות חיים הפשרה בטמפרטורת חדר עד להשלמה.
- מערבולת היטב ומשאירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. מערבולת שוב וצנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 1 דקות כדי גלולה חומר מסיס.
- מעביר את supernatant לצינור חדשולהמשיך למיצוי RNA לפי כוללת הוראות שימוש ערכת בידוד RNA. Elute בהיקף המינימאלי המומלץ להגדיל את הריכוז.
הערה: טיפול DNase לאחר הניקוי מומלץ על מנת למנוע אפשרות של זיהום רצפי הדנ"א הגנומי במערכי נתוני RNA-Seq. - גרור את הצינור לערבב תוכן ולהסיר 5 μl לניתוח בקרת איכות. חנות המדגם שנותר ב -80 ° C עד הכנת ספרייה; דגימות אלה צריכים להיות מופשרים רק פעם אחת, כדי למנוע השפלה RNA.
- הפעל RNA המטוהר במכשיר Bioanalyzer באמצעות ערכת Nano RNA 6000; ערך רין חייב להיות לפחות מעל 7 כדי להמשיך.
- צור ספריות באמצעות ערכת RNA-Seq תואמת Illumina הכנת ספרייה וזמנית עד 4 ספריות בנתיב אחד של מכשיר HiSeq להגדיר לייצר 100 נ"ב אחד קורא. במידת האפשר, כולל את כל הדגימות באותו הטווח למזער חפצים טכניים פוטנציאליים.
הערה: זה אמור להניב עד 50 מיליון rEADS לדגימה, וזה יותר ממספיק כדי להשיג כיסוי עבור רוב הגנים 13.
4. שקלו את מערכי נתוני RNA-Seq בשרת Galaxy הציבורי 10.
הערה: שטח אחסון שרת מוגבל וניסויים השוואת דגימות רבות עשויים לדרוש מחיקה של קבצי ביניים שנוצרו בשלבי הסינון.
- צור חשבון משתמש בשרת הציבורי גלקסי (https://usegalaxy.org) ו- FTP להעלות מערכי נתונים Illumina בפורמט fastq.
- הכן קבצים שהועלו עם כלי FastqGroomer 14 תחת NGS: תפריט QC ומניפולציה; אם ציוני האיכות כבר מקודדים בPhred + 33 (סנגר), דלג על שלב זה, פשוט על ידי שינוי סוג הקובץ לfastqsanger תחת התכונות לכל בסיס הנתונים.
- לנתח את האיכות הכללית של כל מערך נתונים באמצעות כלי FastQC תחת NGS: QC והמניפולציהנו.
הערה: תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן לגרפיקה לתוכן רצף לאיכות רצף בסיס וכל בסיס וכתוצאה מכך, כמו אלה מספקים הערכות לפרמטרים המשמשים לחיתוך הקצוות קורא. - Trim קורא להשליך 3 'מסתיים עם נתוני איכות נמוכות באמצעות הכלי FASTQ איכות גוזם 14 תחת NGS: תפריט QC ומניפולציה. הגדר את הכלי לעבד רק 3 'מסתיים לציון איכות נמוכה מ -20.
- הסר רצפי מתאם מקורא באמצעות כלי קליפ (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) תחת NGS: תפריט QC ומניפולציה. הגדר את הכלי כדי לבטל קורא עם פחות מ 45 נ"ב עזב, קלט הרצף של המתאם המשמש ולבחור את הפלט לכולל שני רצפים המקוטעים והלא-קטועים. בנוסף, בוחר שלא להשליך רצפי בסיסים ידועים מאחר שרוב הבסיסים באיכות נמוכות כבר הוסרו בשלב האחרון. שימוש ברצפי כלי Trim (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) תחת NGS: QC ותפריט מניפולציה, לקצץ הבסיסים הראשונים של קורא להסרת 5 הטיה 'רצף זוהתה על ידי FastQC (בדרך כלל 10).
הערה: בשלב זה, זה רעיון טוב לרוץ FastQC שוב ולהשוות עם הניתוח הקודם כדי לקבוע אם איכות בסיס הנתונים השתפרה. - הורד ולפרוק ההרכבה הגנום העוף האחרונה עבור דפדפן הגנום UCSC מIllumina iGenomes (http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn) ולהעלות את קובץ כל פורמט FASTA הגנום ואת הקובץ בפורמט GTF ביאור גנים להיסטוריה Galaxy באמצעות העלאת קובץ הכלי תחת תפריט נתונים קבלו.
- מפה קוראת לכל דגימה לגנום העוף באמצעות aligner TopHat2 15 תחתNGS: תפריט RNA ניתוח. בחר להשתמש הגנום מההיסטוריה (בחר את קובץ FASTA נטען בשלב 4.7).
- לבנות transcriptome חזתה עבור כל דגימה באמצעות חפתים 16 תחת NGS: תפריט RNA ניתוח. בחר להשתמש ביאור התייחסות כמדריך (בחר את קובץ GTF נטען בשלב 4.7) והפעל את האפשרויות לבצע תיקון הטיה (מההיסטוריה, קבצי FASTA משלב 4.7) ושימוש נכון לקריאה מרובה.
- מיזוג transcriptomes חזוי לכל הדגימות באמצעות Cuffmerge 16 תחת NGS: תפריט RNA ניתוח. בחר להשתמש ביאור התייחסות (קובץ GTF משלב 4.7) ונתונים רצף (מההיסטוריה, קבצי FASTA משלב 4.7).
- השוואת קבצי BAM נוצרו על ידי TopHat2 עבור כל דגימה באמצעות Cuffdiff 16 תחת NGS: תפריט RNA ניתוח. בתמלילי השדה לבחור ליtranscriptome rged שנוצרה על ידי Cuffmerge ולהפעיל את האפשרויות לבצע תיקון הטיה (מההיסטוריה, קבצי FASTA משלב 4.7) ושימוש נכון לקריאה מרובה.
- מיין ביטוי ההפרש בדיקת טבלאות מספרים עולה בעמודת 13 (ערך q) באמצעות מיון כלי הסינון ומיון בתפריט.
הערה: גנים / תמלילים מראים ביטוי ההפרש משמעותי בין תנאי ניסוי יציג את ערכי q הנמוכים ביותר. - לבדוק את תוצאות בחינה ויזואלית עם גרפים כיסוי, להמיר קבצים הראשונים BAM לפורמט bedGraph שימוש באפשרות יצירת BedGraph כיסוי הגנום 17 תחת תפריט BEDTools. להשבית דיווח של אזורים ללא כיסוי, לבחור לטיפול בערכים איחו כמרווחים שונים ולשנות את גודל הכיסוי על ידי גורם שמנרמל עומק רצף לכל בסיסי הנתונים מושווים.
- להמיר את הקובץ לפורמט bedGraph וכתוצאה מהרם-הראש, שימוש בכלי פאה / BedGraph לרם-הראש (http://www.genome.ucsc.edu/) תחת תפריט פורמטי המרה. העלה את הקבצים את רם-הראש כמסלולים מותאמים אישית בדפדפן הגנומי של האוניברסיטה קליפורניה (http://www.genome.ucsc.edu/) להרכבת galGal4 ולחפש גן של עניין כדי להמחיש את הכיסוי במערכי הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמת את השיטה שתוארה, שתי דגימות בקרה נוצרו מהעוברים electroporated עם pMES הריק הווקטור 7 ודגימה אחת מהעוברים transfected עם אותו הווקטור המכיל את התוסף לבנות SCRT2-ZNF, אשר מקודד תחומים אבץ-אצבע של SCRT2 עוף 18. דגימות מניב RNA סך 11-22 מיקרוגרם כל נלקחו מבריכות של 8 עד 12 עוברים. כל שלוש דגימות הבקיע ערך רין אופטימלי של 10 בבדיקת איכות שבוצעה עם מכשיר Bioanalyzer (איור 1), הוכחה כי ניתן להשיג RNA באיכות גבוהה עם פרוטוקול זה.
לאחר רצף, תהליך הסינון שתואר הגדיל את שיעור היישור 83-91% של קורא (מידע לא מוצג). כצפוי, השוואה של transcriptomes משתי דגימות בקרה לא הראתה הבדל ברור בהשוואה גלובלית בעלילה פיזור (איור 2) ואת מקדם מתאם פירסון היה 0.99. בנוסף, תצוגה של כיסוי לכל שלושה מערכי נתונים לאורך המוקד המכיל את החלק מרצף SCRT2 הראתה עלייה ברורה במספר כניסות ממופים לאזור זה במדגם הניסוי (איור 3), המצביע על כך ביטוי היתר היה מוצלח וכי הבדלים בין שליטה ודגימות ניסוי צריכים להתגלות בשיטה שתוארה כאן.
איור 1:. בקרת איכות RNA Bioanalyzer electropherograms מראה רמה גבוהה של יושרה לדגימות RNA הכוללת שתי שליטה מצויינים על ידי פסגות RNA ריבוזומלי 18S ו28S. ריבועים מייצגים ג'ל וירטואלי לריצה.
Figuמחדש 2:. שחזור של תוצאות כימות RNA-Seq מפזר עלילה מראה RPKM כי עבור רוב הגנים הוא זהה בשתי דגימות הבקרה. כמעט לכל הגנים שלא על פי תבנית זו ערכי RPKM נמוכים מאוד ולכן בדרך כלל הם התעלמו מהשוואות transcriptome.
איור 3: ויזואליזציה של הבדלים במדגם ניסיוני תצוגת הדפדפן הגנומי של אוניברסיטת קליפורניה במוקד SCRT2 בגנום העוף (galGal4) מראה עלייה ניכרה בכיסוי של האזור שמקודד לחלבון תחום (SCRT2-ZnF) הביעה ectopically ב. מדגם ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מספקים הנחיות לניתוח השפעות לאחר electroporation של חוט השדרה העוף. למרות electroporation של וקטורי DNA הוא בתדירות גבוהה יותר המשמש לביטוי יתר של גן של עניין, אפשר גם להשתמש במבנים קידוד שליליים דומיננטי, חלבוני quimeric או מבשרים לsiRNAs ליצור תנאי תפקוד הגן לדפוק למטה 19-21. למעשה, השוואה של פרופילי transcriptome כתוצאה משני gain- וניתוח האובדן של הפונקציה יכולה להצביע על גנים הביעו באופן דיפרנציאלי בדרכים הפוכות בכל מצב, כך שיש הפוטנציאל לחשוף השפעות ספציפיות יותר.
כמו כל שיטה מיושמת במורד הזרם להפקת RNA, סינתזה של ספריות RNA-Seq דורשת סכום ראשוני מינימאלי של חומר מוצא. עם פרוטוקול זה, 8 עוברים צריכים להיות מספיק כדי להניב כ -10 מיקרוגרם של רנ"א הכל. החל עם מספר נמוך יותר של אנשים מבלי להתפשר על ריכוז עבודה נאות הוא כנראהאפשרי עם השימוש במערכות הפקת RNA המאפשרים דילול סופי בכמויות קטנות יותר.
הפרדה נאותה של הצינור העצבי מכל המזודרם צריכה להיות מתורגלת כמה פעמים לפני שהחלה על דגימות חשובות, שכן מדובר בצעד עדין שדורש קצת היכרות. כדי להימנע משפלת RNA מוגזמת במהלך שלב הנתיחה, זה גם חשוב כדי להשלים את ההליך כולו לכל צינורות העצביים בכ 1-2 שעות. שוב, בפועל יהיה חשוב כדי לשפר את זמן נתיחה. תצפית חשובה היא שהקשר בין רקמות המזודרם הוא חזק יותר מהקשר בין המזודרם וצינור עצבי, ובכך מושך מבני mesodermal, במיוחד notochord, הוא יותר יעיל מאשר לנסות לחתוך רקמות לא רצויות. כמו כן, חוקרים צריכים להרגיש חופשיים לפתח את הטכניקה שלהם מותאמת לתנאים לנתיחה שלהם. עם זאת, יש להיזהר בהשוואה לדגימות באותו ניסוי להיות גזור באופן דומה, כך שlevel של זיהום עם רקמות mesodermal הוא אחיד ככל האפשר, בין דגימות.
הפרוטוקול שלנו מדגים את ההשוואה של פרופילי transcriptome מחוט שדרה עוברית עוף HH23 שלב transfected בשלב HH12-13. עם זאת, התאמות קטנות צריכה לאפשר היישום שלה לעוברים שנקטפו בשלבים מוקדמים יותר. מצד השני, אם בשלבים מאוחר יותר הם רצויים עבור ניתוח של התוצאה סופית, וקטורי bicistronic הזכירו אינם מתאימים בשל ירידה מתמשכת במספר מולקולות לכל תא כתמורת פיתוח. לכן, במיוחד אם נקודת הסיום המיועדת מושגת לאחר יותר מ -72 שעות לאחר transfection, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בוקטורי קידוד אינטגרציה הגנומי transposon בתיווך של המבנה בשימוש 22.
נושא נוסף שיש להתחשב בו הוא ההטרוגניות של יעילות electroporation. מספר התאים-transfected הלא נע בין כמה לamo ניכרUNT, בייחוד אלה בצינור העצבי הגחון. שכן לאחר נתיחה כל תאי נתונים לניתוח במורד הזרם, יעילות electroporation נמוכה תפחית את הרגישות של assay. גישה להעשיר את המדגם עם תאי electroporated היא השימוש בתא קרינה המופעל מיון (FACS) כדי להפחית את האוכלוסייה של תאי transfected לא מהמדגם הסופי 23. אם נעשה שימוש בגישה כזו, עם זאת, מספר גדול יותר של עוברים יהיה צורך להשיג תשואה מספיקה להכנת ספריית RNA-Seq.
רצף Illumina מומלץ כזה מוצע לציבור רחב יותר על ידי מרכזי רצף ובניתוח נתונים RNA-Seq סיליקון הוא פשוטים בהשוואה לפלטפורמות זמינות אחרות 24. עם זאת, אפשרויות אחרות עדיין נאותות עם שינויים בסינון מידע על השלבים יותר מתאים לפלטפורמה בה בחרה. הנחיות ניתוח נתונים RNA-Seq עדיין לא הוקמו והשוואה של fr תפוקות לחלוטיןכלים אום שונים זמינים, שחלקם כבר כלולים בשרת הציבורי גלקסי, מומלץ מאוד. עם זאת, הניתוח בסיליקון והמתואר כאן צריך להיות מתאים להשגת תוצאות השוואה טובות ממערכי נתונים באיכות גבוהות. כמו בכל התחומים האחרים בביולוגיה, עליות רצף תפוקה גבוהה מאוד את כמות המידע שניתן לקבל מניסוי אחד, והשיטה המתוארת כאן היא אחת דרכים ליישם אותו למחקר של התפתחות חוט השדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
