इस प्रोटोकॉल उच्च सेल जीवन शक्ति और भेदभाव और ध्रुवीकरण के लिए पूर्ण बृहतभक्षककोशिका क्षमता को बनाए रखते हुए उच्च अभिकर्मक दक्षता के साथ electroporation द्वारा siRNA या प्लाज्मिड डीएनए के साथ मानव THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करता है.
मैक्रोफेज, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रमुख खिलाड़ी के रूप में, ऊतक homeostasis या विभिन्न विकृतियों के साथ काम कर अनुसंधान के फोकस पर हैं. SiRNA और प्लास्मिड डीएनए के साथ अभिकर्मक उनके कार्य के अध्ययन के लिए एक कुशल उपकरण है, लेकिन मैक्रोफेज की अभिकर्मक एक छोटी सी बात नहीं है. यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए कई अलग अलग दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, केवल कुछ मैक्रोफेज के विश्वसनीय और कुशल अभिकर्मक, लेकिन कम सेल जीवन शक्ति और अक्सर मनाया जाता है भेदभाव या ध्रुवीकरण के लिए कम क्षमता की तरह गंभीर रूप से बदल सेल व्यवहार अनुमति देते हैं. इसलिए एक अभिकर्मक प्रोटोकॉल इस प्रकार सामान्य कोशिका व्यवहार के संदर्भ में siRNA के प्रभाव या प्लाज्मिड की जांच की अनुमति गंभीर दुष्प्रभाव के कारण के बिना मैक्रोफेज में siRNA और प्लास्मिड डीएनए स्थानांतरित करने में सक्षम है कि आवश्यक है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मज़बूती से और कुशलता से मानव THP-1 मैक्रोफेज और मो transfecting के लिए एक तरीका प्रदान करता हैउच्च सेल जीवन शक्ति, उच्च अभिकर्मक दक्षता, और सेल व्यवहार पर कम से कम प्रभाव के साथ nocytes. यह दृष्टिकोण nucleofection पर आधारित है और प्रोटोकॉल अभिकर्मक के बाद सेल सक्रियण के लिए अधिकतम क्षमता बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया गया है. प्रोटोकॉल निलंबन में सेना की टुकड़ी के साथ ही कोशिकाओं के बाद पक्षपाती कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है, और मध्यम नमूना संख्या के लिए छोटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, प्रस्तुत विधि बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और ध्रुवीकरण के दौरान जीन विनियामक प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी है. इसके अलावा एक विकल्प रासायनिक विधि की तुलना में इस प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट मैक्रोफेज निस्र्पक नतीजे पेश से, सेल व्यवहार पर अभिकर्मक के बाद सेल संस्कृति के माध्यम चयन का प्रभाव भी चर्चा की है. प्रस्तुत आंकड़ों विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए चयन मान्य के महत्व को इंगित करते हैं.
मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर घटकों के अलावा, मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए बहुत महत्व के हैं. उनके कार्यों विविध रहे हैं; वे रोगजनकों और परिगलित सामग्री की phagocytosis में शामिल कर रहे हैं, वे ऊतक homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और विनियमित करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 आर्केस्ट्रा साइटोकिन्स की एक बड़ी संख्या का उत्पादन और छिपाना. इसलिए मैक्रोफेज अभिन्न कई शारीरिक प्रक्रियाओं और pathophysiological शर्तों में शामिल हैं. कारण उनके कार्यों की विविधता के लिए, मैक्रोफेज एक बहुत ही विषम और बहुमुखी सेल प्रकार के होते हैं. यह अलग polarizations द्वारा हासिल की है; बाहरी उत्तेजनाओं मैक्रोफेज के आधार पर अलग phenotypes 2 में विकसित कर सकते हैं. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर मैक्रोफेज 'परिवर्तनशीलता और प्रभाव के लिए उन्हें एक बहुत ही दिलचस्प शोध विषय बना. इन विट्रो मॉडल में उनके जटिल चयापचय और विनियामक कार्यों, उचित बृहतभक्षककोशिका स्पष्ट करने के लिए आदेश में अनुरोध कर रहे हैंuired सही ढंग से मैक्रोफेज विविधता और परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित करता है.
सेलुलर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के क्रम में प्लास्मिड डीएनए वैक्टर या छोटे दखल RNAs (siRNAs) के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक जीन विनियमन और जीन समारोह दोनों की जांच के लिए कोशिका जीव विज्ञान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और शक्तिशाली उपकरण बन गया है. वर्तमान में कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए उपलब्ध विभिन्न उपकरणों का एक बड़ा चयन है. ये उपकरण कोशिकाओं 3 के वायरल वैक्टर, (जैसे जीन बंदूकों के रूप में) यांत्रिक विधियों, (न्यूक्लिक एसिड के साथ परिसरों फार्म कर सकते हैं कि पॉलिमर या लिपिड पर भरोसा है) रासायनिक दृष्टिकोण के आवेदन, और electroporation शामिल हैं. इन तरीकों के सभी के अपने फायदे और नुकसान है और एक विशेष सेल प्रकार और आवेदन के लिए इस व्यापक सरणी से सबसे उपयुक्त का चयन एक कठिन और समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है.
मैक्रोफेज के रूप में लगभग सभी अच्छी तरह से स्थापित transfe transfect के लिए बेहद मुश्किल हो जाता हैction दृष्टिकोण काफी मैक्रोफेज 'व्यवहार्यता को कम करने या उनके व्यवहार, यानी भेदभाव के साथ और विशेष ध्रुवीकरण में हस्तक्षेप. इसलिए, हम यहाँ डीएनए की कम मात्रा की आवश्यकता होती है एक अनुकूलित electroporation के दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जो electroporation आधारित Nucleofector प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए मानव THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक कुशल, गैर वायरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. Nucleofection ऐसे monocytes और मैक्रोफेज के रूप में संवेदनशील कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित संस्करणों 4,5 का एक रूपांतर है.
संक्षेप में, phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) पूर्व siRNA या प्लाज्मिड डीएनए के साथ अभिकर्मक के लिए समय से पहले मैक्रोफेज में 48 घंटे के लिए मानव THP-1 monocytes अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अभिकर्मक के लिए predifferentiated मैक्रोफेज Accutase मैं उपचार द्वारा enzymatically अलग कर रहे हैं. अभिकर्मक कोशिकाओं की electroporation के लिए एक Nucleofector 2B डिवाइस का उपयोग किया जाता है. अभिकर्मक के बाद, अलगआवश्यक रूप entiation एक और 24 से 48 घंटे के लिए जारी रखा है. अंत में, परिपक्व ट्रांसफ़ेक्ट मैक्रोफेज कार्यात्मक अध्ययन के लिए यौगिकों के विभिन्न प्रकार के साथ incubated हैं.
यह दृष्टिकोण इस तरह के मानव THP-1 monocytes और मैक्रोफेज के रूप में सेल लाइनों के अभिकर्मक के लिए अनुमति देता है और सफलतापूर्वक पिछले 6-10 में लागू किया गया है. सबसे रासायनिक अभिकर्मक दृष्टिकोण के विपरीत, समय से पहले मैक्रोफेज का उपयोग हमारे संशोधित nucleofection प्रक्रिया वायरल वैक्टर का उपयोग करें या अज्ञात दुष्प्रभाव के साथ आगे वाहक यौगिकों को जोड़ने की आवश्यकता के बिना, अछूता सेल व्यवहार्यता के साथ संयोजन में उच्च अभिकर्मक क्षमता अर्जित करता है. इसके अलावा, मैक्रोफेज इस प्रकार अभिकर्मक 11 निम्नलिखित बेरोक कार्यात्मक जांच की अनुमति उनके पूर्ण भेदभाव के लिए संभावित रूप में अच्छी तरह से ध्रुवीकरण बरकरार रहती है.
इसके अलावा, nucleofection के बाद लागू सेल संस्कृति के माध्यम जोरदार कार्यात्मक अध्ययन के बाद ट्रॅन को प्रभावित करती हैsfection; विशेष रूप से, ध्रुवीकरण के लिए मैक्रोफेज 'क्षमता लागू संस्कृति के माध्यम के आधार पर प्रभावित किया जा सकता है. सेल संस्कृति मीडिया की यहाँ चार अलग अलग प्रकार (IMDM, एक्स विवो 20, LGM3 और माउस टी सेल Nucleofector मध्यम) इंटरल्यूकिन का उपयोग कर निष्क्रिय परिस्थितियों में परीक्षण किया गया (आईएल) 10 THP-1 मैक्रोफेज का उपयोग करना, हम IL10 को सेल जवाबदेही है कि मनाया माउस टी सेल Nucleofector मध्यम अन्य उपरोक्त संस्कृति मीडिया की तुलना में प्रयोग किया जाता है जब मजबूत. इन परिणामों के इन काफी प्रयोगात्मक परिणामों में सुधार हो सकता है के रूप में सभी सेल संस्कृति शर्तों का उचित अनुकूलन सफल अभिकर्मक und बाद कार्यात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शित करता है.
मैक्रोफेज विभिन्न मानव रोगों में शामिल कर रहे हैं, अधिक से अधिक शोध बृहतभक्षककोशिका व्यवहार के रूप में अच्छी तरह से मैक्रोफेज द्वारा नियंत्रित मैक्रोफेज या बदले में प्रभावित करने नियामक तंत्र elucidating पर ध्यान केंद्रित किया है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में प्रासंगिक हैकई अलग अलग क्षेत्रों में शोध.
यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल आमतौर पर transfect बल्कि मुश्किल हैं जो THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल तरीके से प्रस्तुत करता है. अभिकर्मक सेल जीवन शक्ति का महत्वपूर्ण कमी के बिना siRNA के लिए ऊपर 90% की अभिकर्मक क्षमता के साथ प्राप्त किया जा सकता है. Plasmids के लिए क्षमता आम तौर पर प्राप्त किया जा सकता है लगभग 70% की उनके आकार लेकिन अभिकर्मक क्षमता को कम होने के कारण हो सकता है. siRNA मध्यस्थता पछाड़ना की दक्षता लागू siRNA के आधार पर 80 से 90% तक पहुँच सकते हैं. इस प्रोटोकॉल का एक बड़ा फायदा यह सेल भेदभाव के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं को अभी भी 12 भेदभाव एजेंट पीएमए (1 बी और चित्रा 4 के लिए चित्रा 1 ए) के लिए सामान्य रूप से जवाब. यह भी अभिकर्मक एक के बाद खेती के लिए चयनित माध्यम पर दृढ़ता से निर्भर करता है, हालांकि इस तरह के IL10 या LPS रूप साइटोकाइन उत्तेजनाओं से अतिरिक्त सेलुलर ध्रुवीकरण में / IFNγ, अप्रभावित 12 हैचित्रा 4 में दिखाया गया है.
विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जो प्रक्रिया के भीतर कई विकल्प हैं. चित्रा 4 में दिखाया गया है कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद चयनित संस्कृति के माध्यम के आधार पर एक ही IL10 प्रोत्साहन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया. यह मध्यम रचना सेलुलर व्यवहार पर मजबूत प्रभाव है कि इंगित करता है. विभिन्न प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं के लिए अलग हो सकता है मध्यम द्वारा लगाए प्रभाव के रूप में, यह इष्टतम मध्यम बदल सकता है और इसलिए स्वतंत्र रूप से विभिन्न प्रयोगों के लिए माध्यम की उपयुक्तता को सत्यापित करने की जरूरत है कि संभव है. हालांकि THP-1 कोशिकाओं की खेती के लिए इस्तेमाल डिफ़ॉल्ट माध्यम है जो RPMI 1640 मध्यम,, सेल जीवन शक्ति में एक महत्वपूर्ण नुकसान मनाया गया के रूप में अभिकर्मक के बाद खेती के लिए बीमार अनुकूल साबित हो गया है. इसके अलावा प्रोटोकॉल भी पूर्व पीएमए प्रेरित भेदभाव के बिना THP-1 monocytes के लिए लागू किया जा सकता है, इसजाहिर प्रक्रिया के दौरान सेल टुकड़ी के लिए जरूरत को हटाता है, लेकिन सभी बचे हुए चरणों को समायोजित करने की जरूरत नहीं है. यदि आवश्यक THP-1 monocytes बाद में भेदभाव किया जा सकता है.
प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण तत्व सबसे पहले टुकड़ी और दूसरी अभिकर्मक के लिए आवश्यक समय हैं. टुकड़ी उच्च सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, के रूप में धीरे संभव के रूप में किया जाना चाहिए. इसलिए हम Accutase मैं ऐसी trypsinization के रूप में काफी आक्रामक तरीके से अपेक्षाकृत हल्के एंजाइमी टुकड़ी की सलाह देते हैं. ऐसे Lidocain या स्क्रैप के साथ इलाज के रूप में आगे टुकड़ी तरीकों बल्कि हानिकारक हो पाया गया और नहीं किया जाना चाहिए. Accutase मैं उपचार के 30 मिनट सभी कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं होना चाहिए कि मामले में ठीक से यह आम तौर पर गलत तरीके से संग्रहीत या समाप्त हो गई है Accutase मैं समाधान की या बहुत अधिक फ्रीज पिघलना चक्र का एक संकेत है. हम -20 डिग्री पर Accutase मैं के छोटे aliquots संग्रहीत करके अच्छे परिणाम प्राप्त किया हैसी फ्रीज पिघलना चक्र की संख्या को कम करने के लिए. अपर्याप्त टुकड़ी है हालांकि जब ताजा Accutase साथ Accutase मैं जगह या 1 घंटे के लिए ऊष्मायन समय को बढ़ाने के लिए या तो. इसके अलावा कोमल दोहन में या टुकड़ी सहायता कर सकते हैं कुप्पी या थाली के rinsing. अभिकर्मक के लिए आवश्यक समय के बारे में शुद्ध Nucleofector समाधान करने के लिए कोशिकाओं का जोखिम समय यथासंभव कम किया जाना चाहिए, इस प्रकार सेल अस्तित्व पर उच्च प्रभाव हो गया और किया गया है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए सबसे अच्छा तरीका एक समय समानांतर में (कुछ कदमों 2.10-2.15) और नहीं कई transfections में प्रत्येक अभिकर्मक प्रदर्शन करना है.
पछाड़ना दक्षता कम है, तो यह आम तौर पर कम अभिकर्मक दक्षता के कारण नहीं है, लेकिन यह आसानी से प्रवाह cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग सत्यापित और fluorescently siRNA या एक GFP एन्कोडिंग प्लाज्मिड लेबल किया जा सकता. अधिकतर कारण एक अक्षम siRNA या प्लास्मिड डीएनए है. इन परिस्थितियों में यह (2-3 ग्राम तक) siRNA की राशि बढ़ाने के लिए विचार किया जाना चाहिए याप्लास्मिड डीएनए (अप करने के लिए 1-2 ग्राम) या यदि उपलब्ध हो तो एक अलग siRNA या अभिव्यक्ति वेक्टर उपयोग करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, संतोषजनक परिणाम भी एक ही लक्ष्य के विरुद्ध कई अलग siRNAs की एक पूल का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, समय पाठ्यक्रम प्रयोगों सही रूप में आमतौर पर अभिकर्मक के बाद 24 से 72 घंटे के बाद तक पहुँच जाता है जो अधिक से अधिक प्रभाव, की अवधि निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
इसके अलावा अभिकर्मक से electroporation द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए अच्छी तरह से स्थापित तकनीक आगे रहे हैं. अकसर लागू प्रणाली कार्गो न्यूक्लिक एसिड के साथ परिसरों फार्म और फिर कोशिकाओं में परिवहन सुविधा कर सकते हैं, जो रासायनिक अभिकर्मक एजेंट हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया अभिकर्मकों या तो अलग लिपिड प्रजातियों के आधार पर कर रहे हैं या cationic पॉलिमर 3 के एक नंबर से चुना जा सकता है. दोनों एक विविध चयन दृष्टिकोण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है. ये अभिकर्मक अभिकर्मकों वे आम तौर पर कर रहे हैं कि लाभ की पेशकशइस प्रकार टुकड़ी के लिए आवश्यकता को दूर करने, अधिक समय की आवश्यकता है, और साथ ही साथ पक्षपाती कोशिकाओं के साथ काम नहीं करते, प्रयोग करने में आसान. दुर्भाग्य से, मैक्रोफेज वे इन विट्रो में काफी संख्या में बढ़ना और विदेशी साइटोसोलिक डीएनए 13-15 खिलाफ निर्देशित रक्षा तंत्र के पास नहीं है के रूप में इन तरीकों से transfect बल्कि मुश्किल हैं. इस प्रकार, रासायनिक अभिकर्मक दृष्टिकोण अक्सर सेल व्यवहार्यता की एक गंभीर कमी का परिणाम. वहाँ सफलतापूर्वक मैक्रोफेज में siRNA स्थानांतरित कर सकते हैं, जो रासायनिक अभिकर्मक एजेंट हैं, लेकिन प्रवाह cytometric (2A चित्रा) और फ्लोरोसेंट सूक्ष्म रूप में (चित्रा 2 बी) का विश्लेषण करती है चित्रा 2 में दिखाया गया है हालांकि वे के रूप में कोशिकाओं के रूप में भीतर siRNA के एक ही समरूप वितरण प्राप्त करने में विफल संकेत मिलता है nucleofection द्वारा प्राप्त की. वास्तव में, प्रवाह cytometric डेटा, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की दो अलग अलग आबादी होती है कि Nucleofecti के बाद कोशिकाओं के रूप में इसी तरह की प्रतिदीप्ति के साथ सबसे पहले एक जनसंख्या से संकेत मिलता हैपर पता चला है और दूसरी और अधिक तीव्र प्रतिदीप्ति साथ एक जनसंख्या है. निश्चित पुष्टि अभी भी आवश्यक है, लेकिन हम पहले आबादी दूसरी आबादी की संभावना बहुत उज्ज्वल agglomerates साथ कोशिकाओं से मेल खाती है, जबकि cytosol के भीतर फ्लोरोसेंट siRNA के एक समरूप वितरण दिखा जो उन कोशिकाओं के साथ समान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में है कि लगता है. चित्रा 2A में दिखाया प्रवाह cytometric डेटा सुझाव है कि वैकल्पिक lipofection दृष्टिकोण से सेल प्रति कम siRNA में nucleofection परिणाम है. हालांकि चित्रा 3 में डेटा nucleofection द्वारा शामिल siRNA के भी अपेक्षाकृत छोटी राशि पहले से ही लक्ष्य जीन के 80 से 90% पछाड़ना के लिए पर्याप्त है कि पता चलता है. इसलिए रासायनिक अभिकर्मक के बाद दूसरा आबादी द्वारा शामिल siRNA की अतिरिक्त राशि बहुत संभावना अधिशेष है और आगे बढ़ाने के पछाड़ना दक्षता के लिए अधिक से अवांछित साइड इफेक्ट पैदा करने के लिए इस प्रकार की संभावना है. इसके अलावाउन siRNA अणुओं की संभावना नहीं कार्यात्मक या मुफ्त siRNA अणुओं से कम से कम कम कुशल हैं और लक्ष्य प्रभाव बंद के कारण हो सकता क्योंकि intracellular agglomerates के गठन के पहले से ही अपने आप में अवांछनीय है. इसके अलावा इन agglomerates की वास्तविक प्रकृति को अभी तक स्पष्ट नहीं है. यह इन चमकीले धब्बों siRNA कोशिकाओं द्वारा भली भाँति लेकिन endosomes विफल रही है और siRNA फंस रहे हैं और इसलिए अप्रभावी रहता से बाद में जारी किया गया था यह दर्शाता है कि endosomes का प्रतिनिधित्व करते हैं कि संभव है. वैकल्पिक रूप से स्पॉट intracellularly गठन कर रहे हैं जो agglomerates हो सकता है. रासायनिक अभिकर्मक के कार्यात्मक मूल्यांकन इसलिए पछाड़ना दक्षता पर कोई निश्चित बयान अभी भी दो अलग आबादी के अस्तित्व को इस सब के परिणाम दोनों आबादी का मतलब वर्णन अर्थ यह है कि जैसा कि पहले ही प्रतिकूल है, अभी तक बनाया जा सकता है, लंबित हैं, यह इसलिए के अनुरूप नहीं है या तो आबादी की. कारण है कि nucleofection बेहतर तरीका है.
<p clगधा = "jove_content"> फिर भी यहाँ रेखांकित अभिकर्मक प्रक्रिया के लिए सीमाएं हैं. कोशिकाओं nucleofection पक्षपाती कोशिकाओं कोशिकाओं के लिए एक अतिरिक्त तनाव कारक प्रस्तुत है, जो अलग होने की जरूरत के लिए निलंबन में होना जरूरी है. इसके अलावा पूरे प्रोटोकॉल बल्कि समय लगता है. 10 प्रयोग प्रति – transfections एक साथ प्रदर्शन किया, लेकिन सेल नुकसान से बचने के लिए जल्दी से प्रदर्शन किया जा रहा है नहीं किया जा सकता है, नमूनों की संख्या के बारे में 8 तक सीमित है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल उच्च throughput प्रदर्शन परियोजनाओं के लिए अनुकूल नहीं है. उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए अलग Nucleofector सिस्टम उपलब्ध हैं. सबसे पहले, एक 16 अच्छी तरह से पट्टी स्वरूप प्रदान करता है कि 4D-Nucleofector प्रणाली है. यहां तक कि बड़े throughput के लिए, 96 अच्छी तरह से शटल प्रणाली और 384 अच्छी तरह से एचटी Nucleofector प्रणाली शामिल है. इन नए सिस्टम के बजाय एल्यूमीनियम का प्रवाहकीय बहुलक इलेक्ट्रोड और इसलिए बिजली की स्थिति, यानी कार्यक्रमों और जवाबदेही के साथ काम हालांकि के रूप मेंNucleofector समाधान की ition, यह हमारे प्रोटोकॉल उन सिस्टम के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है अगर निर्धारित करने की आवश्यकता है, तदनुसार बदल दिया है.हालांकि, इन सीमाओं के बावजूद प्रोटोकॉल अन्य सभी गैर वायरल दृष्टिकोण से बेहतर है जो THP-1 कोशिकाओं का एक विश्वसनीय और प्रभावी अभिकर्मक उपज है यहाँ प्रस्तुत किया. इस प्रोटोकॉल अन्य सभी पहलुओं में अंतर और सामान्य रूप से और इस तरह के रूप में संभव अभिकर्मक के रूप में छोटे दुष्प्रभाव दिखाने फूट डालना जो THP-1 कोशिकाओं में बदल जीन अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच के लिए सक्षम बनाता है.
The authors have nothing to disclose.
हम प्रकाशन की लागत को कवर द्वारा इस प्रकाशन को प्रायोजित करने के लिए Lonza समूह लिमिटेड के आभारी हैं. हम SL करने के लिए वित्तीय सहायता के लिए und Kultur Wissenschaft ड्यूश Infarktforschungshilfe, विल्हेम-Vaillant-Stiftung, अर्नेस्ट-सोल्वे-Stiftung, और थुरिंगर Ministerium फर Bildung, धन्यवाद.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
siRNA / plasmid | |||
Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |