Denne protokollen gir en effektiv og pålitelig metode for å transfektere humane THP-1 makrofager med siRNA eller plasmid DNA med elektroporering med høy transfeksjon effektivitet og samtidig opprettholde høy celle vitalitet og full makrofag kapasiteten for differensiering og polarisering.
Makrofager, som sentrale aktører i det medfødte immunrespons, er i fokus for forskningen arbeider med vev homeostase eller ulike patologier. Transfeksjon med plasmid DNA siRNA og er et effektivt verktøy for å studere deres funksjon, men transfeksjon av makrofager ikke er en triviell sak. Selv om mange ulike tilnærminger for transfeksjon av eukaryote celler er tilgjengelig, bare få gi pålitelig og effektiv transfeksjon av makrofager, men redusert celle vitalitet og sterkt endret celle atferd som redusert evne for differensiering eller polarisering observeres ofte. Derfor kreves en transfeksjon protokoll som er i stand til å overføre siRNA og plasmid-DNA inn i makrofager uten å forårsake alvorlige bivirkninger og dermed tillater undersøkelse av effekten av siRNA eller plasmid i sammenheng med normal celleadferd. Protokollen som presenteres her tilveiebringer en fremgangsmåte for pålitelig og effektiv måte å transfektere humane THP-1 makrofager og monocytes med høy celle vitalitet, transfeksjon med høy effektivitet og minimale effekter på celle atferd. Denne tilnærmingen er basert på nucleofection og protokollen har blitt optimalisert for å opprettholde maksimal kapasitet for celleaktivering etter transfeksjon. Protokollen er tilstrekkelig for adherente celler etter løsgjøring, så vel som celler i suspensjon, og kan benyttes for små til middels eksempelnumrene. Således er fremgangsmåten presentert nyttig for å undersøke gen regulerende effekter i løpet av makrofag differensiering og polarisering. Bortsett fra å presentere resultater som karakteriserer transfekterte makrofager i henhold til denne protokollen i forhold til en alternativ kjemisk fremgangsmåte, er virkningen av cellekulturmedium utvalg etter transfeksjon av celle oppførsel også diskutert. De presenterte data indikerer viktigheten av å validere utvalg for ulike eksperimentelle innstillinger.
Blant de cellulære komponenter av immunsystemet hos mennesker, makrofager er av stor betydning for den medfødte immunrespons. Deres oppgaver er mangfoldige; de er involvert i fagocytose av patogener og nekrotisk materiale, spiller de en viktig rolle i vev homeostase og produsere og utskille et stort antall cytokiner for å regulere og organisere immunrespons 1. Derfor makrofager er integrert involvert i mange fysiologiske prosesser og patofysiologiske forhold. På grunn av mangfoldet av sine oppgaver, makrofager er en svært heterogen og mangefasettert celletype. Dette oppnås ved forskjellige polarisasjoner; avhengig av ytre stimuli makrofager kan utvikle seg til ulike fenotyper to. Makrofager 'variabilitet og innvirkning på immunforsvaret gjør dem til en meget interessant forskning emnet. For å belyse deres komplekse metabolske og regulatoriske funksjoner, passende makrofag in vitro-modeller er required som et riktig bilde makrofag heterogenitet og variasjon.
Transfeksjon av celler med plasmid DNA vektorer eller små interfererende RNA (sirnas) for å endre celle genuttrykk har blitt en mye brukt og kraftig verktøy i cellebiologi for å undersøke både genregulering og gen-funksjon. Foreløpig er det et stort utvalg av ulike verktøy for transfeksjon av eukaryote celler. Disse verktøyene inkluderer anvendelsen av virale vektorer, mekaniske metoder (for eksempel genet guns), kjemiske metoder (som er avhengige av polymerer eller lipider som kan danne komplekser med nukleinsyrer), og elektroporering av celler 3. Alle disse metodene har sine fordeler og ulemper, og velge den som passer best fra denne bredt utvalg for en bestemt celletype og søknad kan være en vanskelig og tidkrevende prosess.
Makrofager er notorisk vanskelig å transfektere som nesten alle veletablert overfÃDette skjer tilnærminger drastisk redusere makrofager 'levedyktighet eller forstyrre deres oppførsel, dvs. differensiering og spesielt polarisasjon. Derfor presenteres her en effektiv, ikke-viral-protokollen for å transfektere humane THP-1 makrofager ved hjelp av elektroporering baserte Nucleofector teknologi, noe som representerer en optimalisert electroporation tilnærming krever reduserte mengder av DNA. Nucleofection er godt egnet for følsomme celler som monocytter og makrofager. Denne protokollen er en tilpasning av tidligere publiserte versjoner 4,5.
I korte trekk, blir forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) som brukes til å skille humane THP-1 monocytter i 48 timer i premature makrofager før transfeksjon med siRNA eller plasmid DNA. For transfeksjon de predifferentiated makrofager er frittliggende enzymatisk ved behandling Accutase jeg. Den transfeksjon utføres ved hjelp av en Nucleofector 2b anordning for elektroporering av cellene. Etter transfeksjon, avvikerentiation blir fortsatt i ytterligere 24 til 48 timer etter behov. Endelig er modne transfekterte makrofager inkubert med forskjellige typer av forbindelser for funksjonelle studier.
Denne fremgangsmåten gjør det mulig for transfeksjon av cellelinjer så som humane THP-1 monocytter og makrofager, og har blitt brukt i det siste 6-10. I motsetning til de fleste kjemiske transfeksjon nærmer seg, den modifiserte nucleofection prosedyren ved hjelp av makrofager premature gir høye transfeksjon effektivitet i kombinasjon med usvekket celleviabilitet, uten behov for å bruke virale vektorer eller legge til ytterligere forbindelser med bærer ukjente bivirkninger. I tillegg, makrofagene beholder sin fulle potensialet for differensiering samt polarisasjon og dermed tillater uhindret funksjonelle undersøkelser etter transfeksjon 11.
Videre er cellekulturmedium anvendes etter nucleofection påvirker sterkt funksjonelle studier følgende transfection; spesielt, kan makrofagene 'kapasitet for polarisering påvirkes avhengig av det anvendte kulturmediet. Her fire forskjellige typer cellekultur media (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 og mus T Cell Nucleofector medium) ble testet under deaktivering forhold ved hjelp av interleukin (IL) 10. Bruke THP-1 makrofager, observerte vi at cellenes respons på IL10 er sterkest når Mus T celle Nucleofector mediet brukes i forhold til det annet vekstmedium som er nevnt ovenfor. Disse resultater viser at passende optimalisering av alle cellekulturbetingelser er viktig for vellykket transfeksjon und følgende funksjonelle studier, da disse kan betydelig forbedre eksperimentelle resultater.
Som makrofager er involvert i ulike menneskelige sykdommer, er mye forskning fokusert på å belyse makrofag atferd samt reguleringsmekanismer påvirker makrofager eller i sin tur kontrollert av makrofager. Derfor er denne protokollen av relevans imange forskjellige forskningsområdene.
Den protokoll som er beskrevet her gir en pålitelig og effektiv måte å transfektere THP-1 makrofager som vanligvis er ganske vanskelig å transfektere. Transfeksjon kan oppnås med transfeksjon effektivitet på mer enn 90% for siRNA uten betydelig reduksjon av celle vitalitet. Effektivitet for plasmider kan være mindre på grunn av deres størrelse, men transfeksjon effektivitet på omkring 70% kan vanligvis oppnås. Effektiviteten av siRNA-mediert knockdown kan nå 80 til 90% avhengig av den anvendte siRNA. En stor fordel med denne protokollen er at den ikke forstyrrer celledifferensiering. Etter transfeksjon cellene fremdeles reagere normalt til differensieringsmiddel PMA (figur 1A til 1B og Figur 4) 12. I tillegg cellular polarisering av cytokin stimuli som IL10 eller LPS / IFNγ er upåvirket 12, men dette avhenger også sterkt av valgt for dyrking etter transfeksjon et mediums vist i figur 4.
Det finnes flere alternativer innenfor prosedyre som kan endres for å tilpasse protokollen til bestemte krav. Som vist i figur 4 at cellene reagerer forskjellig på samme IL10 stimulus avhengig kulturmediet velges etter transfeksjon. Dette indikerer at det medium blandingen har sterk innflytelse på cellulære oppførselen. Ettersom effekten pålagt av mediet kan variere for forskjellige eksperimentelle stimuli, er det mulig at den optimale mediet kan endre seg, og derfor er det et behov for å bekrefte egnetheten av mediet for forskjellige eksperimenter uavhengig av hverandre. Men RPMI-1640-medium, som er standardmedium som brukes for dyrking av THP-1-celler, har vist seg å være dårlig egnet for dyrking etter transfeksjon som et betydelig tap i cellen vitalitet ble observert. Videre protokollen kan også bli brukt til THP-1 monocytter uten PMA-indusert differensiering av dette,åpenbart fjerner behovet for celleløsningen under fremgangsmåten, men alle de gjenværende trinn behøver ikke å justeres. THP-1 monocytter kan skilles etterpå om nødvendig.
De mest kritiske deler av protokollen er det første løsgjøring og for det andre den tid som kreves for transfeksjon. Den løsgjøring må utføres så forsiktig som mulig, for å opprettholde høy cellelevedyktighet. Derfor anbefaler vi den forholdsvis mild enzymatisk avløsning ved Accutase jeg over ganske aggressive metoder som trypsinization. Ytterligere avløsning metoder slik som behandling med lidocain eller skraping ble funnet å være ganske skadelig og bør ikke brukes. I det tilfellet at 30 min behandling Accutase jeg ikke skulle være tilstrekkelig til å løsne alle cellene riktig dette er vanligvis en indikasjon på feil lagres eller utløpt Accutase I løsning eller i for mange fryse-tine-sykluser. Vi har oppnådd gode resultater ved lagring av små alikvoter av Accutase I ved -20 °C for å redusere antallet av fryse-tine-sykluser. Men når det er for lite avløsning enten erstatte Accutase jeg med frisk Accutase eller øke inkubasjonstid opptil 1 time. I tillegg milde tapping eller skylling av kolben eller plate kan bistå avløsning. Når det gjelder den nødvendige tid for transfeksjon eksponeringstiden av cellene til ren Nucleofector løsningen har fått stor betydning for celleoverlevelse og dermed bør være så kort som mulig. Den beste måten å oppnå dette på er å utføre hver transfeksjon om gangen (trinn 02.10 til 02.15) og ikke flere transfections parallelt.
Hvis knockdown effektivitet er lav, dette vanligvis ikke er forårsaket av lav transfeksjon effektivitet, men dette kan enkelt verifiseres ved hjelp av flowcytometri eller fluorescens mikroskopi og fluorescensmerkede siRNA eller en GFP koding plasmid. Mostly årsaken er en ineffektiv siRNA eller plasmid DNA. Under disse forhold bør det tas i betraktning for å øke mengden av siRNA (opptil 2-3 ug) ellerplasmid DNA (opp til 1-2 ug) eller bruke et annet siRNA eller ekspresjonsvektor hvis tilgjengelig. Alternativt, kan tilfredsstillende resultater også oppnås ved hjelp av en dam av flere forskjellige sirnas rettet mot det samme mål. Videre kan tidsforløpet eksperimenter være nødvendig å nøyaktig bestemme perioden med maksimal effekt, som vanligvis er nådd etter 24 til 72 timer etter transfeksjon.
Bortsett fra transfeksjon ved elektroporering Det er videre vel etablerte teknikker for transfeksjon i pattedyrceller. Ofte anvendte systemer er kjemiske transfeksjon midler som kan danne komplekser med lasten nukleinsyre og deretter letter transporten inn i cellene. De mest brukte reagenser er enten basert på forskjellige lipid art, eller kan velges fra en rekke kationiske polymerer tre. For begge nærmer seg en mangfoldig utvalg er kommersielt tilgjengelig. Disse transfeksjon reagenser har den fordel at de er vanligvisenkel å bruke, ikke krever mye tid, og arbeide med heftende celler i tillegg, og dermed fjerne behovet for løsrivelse. Dessverre, makrofager er ganske vanskelig å transfektere med disse metodene som de ikke sprer betydelig in vitro og har forsvarsmekanismer rettet mot fremmed DNA cytosoliske 13-15. Således kjemisk transfeksjon tilnærminger ofte resultere i en alvorlig reduksjon av cellenes levedyktighet. Imidlertid, som vist i figur 2 er det kjemiske transfeksjon midler som med hell kan overføre siRNA til makrofager, men som strømningscytometrisk (figur 2A), og fluorescerende mikroskopiske (figur 2B)-analyser indikerer at de ikke klarer å oppnå den samme homogen fordeling av siRNA i cellene som innhentet av nucleofection. Faktisk indikerer flowcytometrisk data som to forskjellige populasjoner av transfekterte celler oppstår, for det første en befolkning med tilsvarende fluorescens som cellene etter Nucleofectiden blir detektert, og for det andre er det en populasjon med mer intens fluorescens. Endelig bekreftelse er fortsatt nødvendig, men vi antar at den første populasjon er i fluorescens mikroskopi identisk med de celler som viser en homogen fordeling av fluorescerende siRNA i cytosol, mens den andre populasjonen sannsynlig svarer til cellene med meget sterke agglomerater. De flowcytometrisk data vist i Figur 2A viser at nucleofection resulterer i mindre siRNA per celle enn alternativet lipofection tilnærming. Men dataene i figur 3 viser at selv den forholdsvis lille mengde av siRNA innlemmet ved nucleofection allerede er tilstrekkelig for 80 til 90% knockdown av målgenet. Derfor er den ytterligere mengde siRNA inkorporert ved den andre populasjonen etter transfeksjon kjemisk er svært sannsynlig overskudd, og er således mer sannsynlig å forårsake uønskede bivirkninger enn for ytterligere økning knockdown effektivitet. Bortsett fra atdannelsen av intracellulære agglomerater er allerede uønsket i seg selv siden de siRNA-molekyler er sannsynlig ikke funksjonell eller i det minste mindre effektiv enn gratis siRNA-molekyler og kan føre utenfor mål effekter. Videre den sanne natur av disse agglomerater er ennå ikke klart. Det er mulig at disse lyspunkter representerer endosomes indikerer at siRNA ble internalisert av cellene, men senere slipp fra endosomes mislyktes og siRNA forblir fanget og derfor ineffektiv. Alternativt flekkene kan være agglomerater som er dannet intracellulært. Funksjonelle vurderinger av kjemiske transfeksjon venter derfor ingen definitive uttalelser om knockdown effektivitet kan gjøres ennå, likevel eksistensen av to atskilte populasjoner er allerede ugunstig da dette betyr at alle resultatene beskriver gjennomsnittet av begge bestander, betyr derfor ikke tilsvare en av populasjonene. Derfor nucleofection er den overlegne tilnærming.
<p class = "jove_content"> Likevel er det også begrensninger i transfeksjon prosedyren skissert her. Siden cellene har til å være i suspensjon i nucleofection adherente celler trenger å tas av, som presenterer en ytterligere stressfaktor til cellene. Videre hele protokollen er ganske tidkrevende. Siden transfections ikke kan utføres samtidig, men må utføres hurtig for å unngå celleskade, er det antall prøver begrenset til omtrent 8 – 10 per eksperiment. Dermed er denne protokollen ikke egnet for høy gjennomstrømning screening prosjekter. For programmer med høy gjennomstrømning forskjellige Nucleofector systemer er tilgjengelig. For det første er det 4D-Nucleofector system som tilbyr en 16 godt stripe format. For enda større gjennomstrømming, er det 96 også Shuttle systemet og 384 også HT Nucleofector system. Men som disse nyere systemene fungerer med ledende polymer elektroder i stedet for aluminium og derfor elektriske forhold, det vil si programmer og konkurranserition av Nucleofector løsning, har endret seg tilsvarende, det må bestemmes om vår protokoll kan overføres til disse systemene.Men til tross for disse begrensninger protokollen som presenteres her ikke gi en pålitelig og effektiv transfeksjon av THP-1-celler som er overlegne i forhold til alle andre ikke-virale metoder. Denne protokollen muliggjør undersøkelse av effekten av endret genekspresjon i THP-1-celler, som i alle andre henseender skiller og polariserer normalt og dermed vise seg som små bivirkninger av transfeksjon som mulig.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Lonza Group Ltd for å sponse denne publikasjonen ved å dekke publiseringskostnadene. Vi takker Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, og Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur for økonomisk støtte til SL.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
siRNA / plasmid | |||
Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |