Detta protokoll utgör en effektiv och tillförlitlig metod för att transfektera humana THP-1 makrofager med siRNA eller plasmid-DNA genom elektroporering med hög transfektionseffektivitet bibehållen hög cell vitalitet och full makrofag förmåga till differentiering och polarisering.
Makrofager, som nyckelspelare i det medfödda immunsvaret, är i fokus för forskningen behandlar vävnad homeostas eller olika patologier. Transfektion med siRNA och plasmid-DNA är ett effektivt verktyg för att studera deras funktion, men transfektion av makrofager är ingen bagatell. Även om många olika metoder för transfektion av eukaryota celler finns tillgängliga, bara ett fåtal ger tillförlitlig och effektiv transfektion av makrofager, men minskad cell vitalitet och allvarligt förändrad cellbeteende som minskad förmåga till differentiering eller polarisering ofta observeras. Därför kan en transfektion protokoll krävs som är i stånd att överföra siRNA och plasmid-DNA in i makrofager utan att orsaka allvarliga biverkningar sålunda möjliggör undersökning av effekten av siRNA eller plasmid i samband med den normala cellbeteende. Protokollet presenteras här tillhandahåller en metod för att tillförlitligt och effektivt transfektera humana THP-1 makrofager och monocytes med hög cell vitalitet, hög transfektionseffektivitet och minimala effekter på cellens beteende. Detta synsätt bygger på Nucleofection och protokollet har optimerats för att upprätthålla maximal kapacitet för cellaktivering efter transfektion. Protokollet är tillräcklig för adherenta celler efter avlossning liksom celler i suspension, och kan användas för små till tal medelprov. Sålunda är den metod som presenteras användbar för undersökning av genreglerande effekter under makrofagdifferentiering och polarisation. Förutom att presentera resultat som kännetecknar makrofager transfekterade enligt detta protokoll i jämförelse med ett alternativt kemiskt metod effekterna av cellkulturmedium urvalet efter transfektion på cellens beteende diskuteras. De presenterade uppgifterna visar vikten av att bekräfta valet för olika experimentella inställningar.
Bland de cellulära komponenterna i det humana immunsystemet, makrofager är av stor betydelse för den medfödda immunresponsen. Deras uppgifter är olika; de är inblandade i fagocytos av patogener och nekrotiskt material, spelar de en viktig roll i vävnad homeostas och producera och utsöndra ett stort antal cytokiner för att reglera och orkestrera immunsvaret 1. Därför makrofager är integrerat inblandade i många fysiologiska processer och patofysiologiska förhållanden. På grund av mångfalden av sina uppgifter, makrofager är en mycket heterogen och mångfacetterad celltyp. Detta uppnås genom olika polarisation; beroende på yttre stimuli makrofager kan utvecklas till olika fenotyper 2. Makrofager 'variabilitet och påverkan på immunsvaret gör dem ett mycket intressant forskningsobjekt. För att belysa deras komplexa metabola och reglerande funktioner, lämplig makrofager in vitro-modeller är required som korrekt återspeglar makrofag heterogenitet och variabilitet.
Transfektion av celler med plasmid DNA-vektorer eller små störande RNA (siRNA) för att ändra cellens genuttryck har blivit en allmänt använd och kraftfullt verktyg inom cellbiologi för att undersöka både genreglering och geners funktion. För närvarande finns det ett stort urval av olika verktyg som finns för transfektion av eukaryota celler. Dessa verktyg inkluderar tillämpningen av virala vektorer, mekaniska metoder (såsom gen vapen), kemiska metoder (som är beroende av polymerer eller lipider som kan bilda komplex med nukleinsyror), och elektroporering av celler 3. Alla dessa metoder har sina fördelar och nackdelar och välja bäst lämpade från detta breda spektrum för en specifik celltyp och tillämpning kan vara en svår och tidskrävande process.
Makrofager är notoriskt svåra att transfektera som nästan alla väletablerade överfction metoder drastiskt minska makrofager "livskraft eller störa deras beteende, dvs differentiering särskilt polarisering. Därför presenterar vi här en effektiv, icke-viral protokoll för att transfektera humana THP-1 makrofager som använder elektrobaserade Nucleofector teknik, vilket är en optimerad elektroporering tillvägagångssätt som kräver minskade mängder DNA. Nucleofection är väl lämpad för känsliga celler såsom monocyter och makrofager. Detta protokoll är en anpassning av tidigare publicerade versioner 4,5.
I korthet är forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) användes för att differentiera humana THP-1-monocyter i 48 h i prematura makrofager före transfektion med siRNA eller plasmid-DNA. För transfektion de predifferentiated makrofagerna lösgörs enzymatiskt genom Accutase I-behandling. Transfektionen utförs med användning av en Nucleofector 2b anordning för elektroporering av cellerna. Efter transfektion, skiljerentiation fortsätts under ytterligare 24 till 48 h efter behov. Slutligen är mogna transfekterade makrofager inkuberades med olika typer av föreningar för funktionella studier.
Detta tillvägagångssätt möjliggör för transfektion av cellinjer, såsom humana THP-1-monocyter och makrofager, och har med framgång tillämpats tidigare 6-10. I motsats till de flesta kemiska transfektion metoder, våra modifierade Nucleofection proceduren med prematura makrofager ger höga transfektionseffektiviteter i kombination med felfri cellviabilitet, utan att behöva använda virala vektorer eller lägga till ytterligare bärarföreningar med okända biverkningar. Dessutom makrofagerna behåller sina möjligheter till differentiering och polarisering vilket möjliggör obehindrat funktionella undersökningar efter transfektion 11.
Vidare cellodlingsmediet appliceras efter Nucleofection starkt påverkar funktionella studier följande transfection; i synnerhet, kan makrofagerna förmåga till polarisation påverkas beroende på den applicerade odlingsmediet. Här fyra olika typer av cellodlingsmedia (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 och mus T Cell Nucleofector medium) testades under deaktiverande förhållanden med hjälp av interleukin (IL) 10 Använda THP-1 makrofager, konstaterade vi att cell lyhördhet för IL10 är starkast när Mus T Cell Nucleofector medium används i jämförelse med den andra odlingsmedier som nämns ovan. Dessa resultat visar att lämplig optimering av samtliga cellodlingsförhållanden är avgörande för framgångsrik transfektion und efterföljande funktionella studier eftersom de kan avsevärt förbättra experimentella resultat.
Eftersom makrofager är inblandade i olika mänskliga sjukdomar, är mycket forskning inriktad på att belysa makrofag beteende samt reglerande mekanismer som påverkar makrofager eller i sin tur kontrolleras av makrofager. Därför är detta protokoll av relevans imånga olika forskningsområden.
Det protokoll som beskrivs här utgör ett tillförlitligt och effektivt sätt att transfektera THP-1 makrofager som vanligtvis ganska svårt att transfektera. Transfektion kan åstadkommas med transfektionseffektiviteter av ovan 90% för siRNA utan signifikant minskning av cell vitalitet. Effektivitetsvinster för plasmider kan vara mindre på grund av deras storlek, men transfektionseffektiviteter på cirka 70% kan oftast uppnås. Effektiviteten av siRNA-förmedlad knockdown kan nå 80 till 90% beroende på den applicerade siRNA. En stor fördel med detta protokoll är att det inte interfererar med celldifferentiering. Efter transfektion cellerna reagerar fortfarande normalt differentiering agenten PMA (Figur 1A till 1B och figur 4) 12. Dessutom cellulär polarisering av cytokin stimuli såsom IL10 eller LPS / IFNy påverkas inte 12, även om detta beror också mycket på det valda för odling efter transfektion ett mediums som visas i figur 4.
Det finns flera alternativ inom det förfarande som kan modifieras för att anpassa protokollet till specifika krav. Såsom visas i fig 4 cellerna reagerar olika på samma IL10 stimulans beroende på odlingsmedium valt efter transfektion. Detta tyder på att medel kompositionen har en stark påverkan på cellulär beteende. Eftersom effekten ut av mediet kan skilja sig för olika experimentella stimuli, är det möjligt att den optimala mediet kan ändras och därför finns det ett behov av att kontrollera lämpligheten av medium för olika experiment självständigt. Men RPMI-1640-medium, vilket är standard medium som används för odling av THP-1-celler, har visat sig vara olämpliga för odling efter transfektion som en betydande förlust i cell vitalitet observerades. Vidare kan även tillämpas protokollet till THP-1-monocyter utan föregående PMA-inducerad differentiering, dettauppenbarligen tar bort behovet av cellen lossnar under förfarandet, men alla återstående steg inte behöver justeras. THP-1-monocyter kan differentieras efteråt om det behövs.
De mest kritiska delarna av protokollet är för det första lossnar och för det andra den tid som krävs för transfektion. Den lösgör måste utföras så försiktigt som möjligt, för att upprätthålla hög cellviabilitet. Därför rekommenderar vi förhållandevis mild enzymatiska lossnar från Accutase jag över ganska aggressiva metoder såsom trypsinization. Ytterligare lösgör metoder såsom behandling med Lidocain eller skrapa befanns vara ganska skadligt och bör inte användas. I det fall att 30 min av Accutase I behandlingen inte skulle vara tillräcklig för att lösgöra alla celler på rätt sätt det är oftast ett tecken på felaktigt lagrad eller förfallit Accutase I lösning eller av för många frys-tö cykler. Vi har fått goda resultat genom att lagra små portioner av Accutase I vid -20 °C för att minska antalet frysnings-upptiningscykler. Men när det inte finns tillräckligt lösgör antingen ersätta Accutase I med färsk Accutase eller öka inkubationstid på upp till 1 timme. Dessutom försiktigt packas eller sköljning av kolven eller plattan kan hjälpa lossnar. När det krävs tid för transfektion exponeringstiden för cellerna till ren Nucleofector lösning har fått stor påverkan på cellöverlevnad och därför bör vara så kort som möjligt. Det bästa sättet att uppnå detta är att utföra varje transfektion i taget (steg från 2,10 till 2,15) och inte flera transfektioner parallellt.
Om knockdown effektiviteten är låg, detta oftast inte orsakas av låg transfektionseffektivitet, men detta kan lätt kontrolleras med hjälp av flödescytometri eller fluorescensmikroskopi och fluorescerande siRNA eller GFP kodande plasmid. Mestadels orsaken är ett ineffektivt siRNA eller plasmid-DNA. Under dessa omständigheter bör man överväga att öka mängden siRNA (upp till 2-3 mikrogram) ellerplasmid-DNA (upp till 1-2 mikrogram) eller använda ett annat siRNA eller expressionsvektor om det finns. Alternativt kan tillfredsställande resultat även uppnås genom användning av en pool av flera olika siRNA riktade mot samma mål. Dessutom kan tidsförloppet experiment att krävas för att noggrant fastställa tiden för maximal effekt, som vanligtvis uppnås efter 24 till 72 h efter transfektion.
Bortsett från transfektion genom elektroporation det finns ytterligare väletablerade tekniker för transfektion av däggdjursceller. Ofta tillämpade system är kemiska transfektionsmedel som kan bilda komplex med den last nukleinsyran och därefter underlätta transport in i cellerna. De vanligast använda reagensen är antingen baserade på olika lipid arter eller kan väljas från ett antal katjoniska polymerer 3. För båda närmar sig ett mångsidigt utbud är kommersiellt tillgänglig. Dessa transfektionsreagens erbjuder fördelen att de vanligen ärlätt att använda, inte kräver mycket tid, och arbeta med vidhäftande celler också, vilket tar bort behovet av avskildhet. Olyckligtvis makrofager är ganska svåra att transfektera med dessa metoder, eftersom de inte prolifererar signifikant in vitro och besitter försvarsmekanismer riktas mot främmande cytosoliska DNA 13-15. Således kemiska transfektion metoder ofta leda till en kraftig minskning av cellernas livskraft. Men som visas i figur 2 finns det kemiska transfektionsmedel som framgångsrikt kan överföra siRNA in i makrofager, men som flödescytometrisk (Figur 2A) och fluorescerande mikroskopisk (Figur 2B) analyser indikerar att de misslyckas med att uppnå samma homogen fördelning av siRNA i cellerna som erhålles genom Nucleofection. Faktum är att de flödescytometriska data indikerar att två olika populationer av transfekterade celler uppträder, för det första en population med liknande fluorescens som cellerna efter Nucleofectiden upptäcks och för det andra finns det en befolkning med mer intensiv fluorescens. Definitiv bekräftelse krävs fortfarande men vi antar att den första befolkningen i fluorescensmikroskopi identiska med de celler som uppvisar en homogen fördelning av fluorescerande siRNA i cytosolen, medan den andra populationen sannolikt motsvarar cellerna med mycket ljusa agglomerat. De flödescytometriska data som visas i figur 2A visar att Nucleofection resulterar i mindre siRNA per cell än alternativet lipofektion tillvägagångssätt. Men data i figur 3 visar att även den jämförelsevis liten mängd av siRNA införlivas genom Nucleofection är redan tillräcklig för 80 till 90% knockdown av målgenen. Därför extra belopp på siRNA införlivas genom den andra populationen efter kemisk transfektion är mycket troligt överskott och är därför mer sannolikt att orsaka oönskade biverkningar än att ytterligare öka VÄLDIGANDE effektivitet. Bortsett från attbildning av intracellulära agglomerat redan oönskad i sig eftersom dessa siRNA-molekyler sannolikt inte funktionella eller åtminstone mindre effektiva än fria siRNA-molekyler och kan orsaka off target effekter. Dessutom är den sanna naturen av dessa agglomerat ännu inte klart. Det är möjligt att dessa ljuspunkter representerar endosomer indikerar att siRNA var internaliseras av cellerna men därefter släppa från endosomer misslyckades och siRNA förblir instängd och därmed ineffektiva. Alternativt fläckarna kan vara agglomerat, som bildas intracellulärt. Funktionella utvärderingar av kemiska transfektion pågår, kan därför inte gjort några definitiva uttalanden om knockdown effektivitet ännu, ändå att det finns två distinkta populationer redan ogynnsam eftersom detta innebär att alla resultat beskriver medelvärdet för båda populationerna, det betyder alltså inte motsvarar antingen av befolkningarna. Därför Nucleofection är överlägsen strategi.
<p class = "jove_content"> Trots det finns också begränsningar för transfektionsförfarandet beskrivs här. Sedan måste cellerna vara i suspension under Nucleofection vidhäftande cellerna behöver lösgöras, som presenterar en ytterligare stressfaktor till cellerna. Dessutom hela protokollet är ganska tidskrävande. Eftersom transfections inte kan utföras samtidigt, men måste utföras snabbt för att undvika cellskador, är antalet prov begränsat till cirka 8-10 per experiment. Således är detta protokoll inte lämpad för hög kapacitet projekt. För hög genomströmning applikationer olika Nucleofector system finns tillgängliga. För det första är 4D-Nucleofector system som erbjuder en 16 väl strip-format. För ännu större genomströmning, det är de 96 väl Shuttle systemet och 384 väl HT Nucleofector systemet. Men eftersom dessa nyare system arbetar med ledande polymerelektroder istället för aluminium och därför elektriska förhållanden, det vill säga program och compossition av Nucleofector lösning, har ändrats i enlighet med, det måste bestämmas om våra protokoll kan överföras till dessa system.Men trots dessa begränsningar protokollet presenteras här ger efter en pålitlig och effektiv transfektion av THP-1-celler, som är överlägsen alla andra icke-virala metoder. Detta protokoll möjliggör undersökning av effekterna av förändrade genuttryck i THP-1-celler, som i alla andra aspekter differentierar och polariserar normalt och på så sätt visa så lite biverkningar av transfektion som möjligt.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för Lonza Group Ltd för att sponsra denna publikation genom att täcka kostnader för offentliggörande. Vi tackar Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung och Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur för ekonomiskt stöd till SL.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
siRNA / plasmid | |||
Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |