Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/51964
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1, 2
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

Abstract

Anastasis (Grieks voor "oplopend tot leven") verwijst naar het herstel van stervende cellen. Voordat deze cellen terug te krijgen, hebben ze gepasseerd belangrijke checkpoints van apoptose, waaronder mitochondriale fragmentatie, release van mitochondriale cytochroom c in het cytosol, de activering van caspases, chromatinecondensatie, DNA-schade, kernfragmentatie, plasmamembraan blebbing, celinkrimping, blootstelling celoppervlak fosfatidylserine en vorming van apoptotische lichamen. Anastasis kan optreden wanneer apoptotische stimuli voor het overlijden worden verwijderd, waardoor stervende cellen apoptose en mogelijk andere dood mechanismen te keren. Daarom lijkt Anastasis om fysiologische genezingsprocessen dat ook zou kunnen ondersteunen beschadigde cellen op ongepaste wijze te betrekken. De functies en mechanismen van Anastasis zijn nog onduidelijk, gehinderd gedeeltelijk door de beperkte hulpmiddelen voor het opsporen van gebeurtenissen uit het verleden na het herstel van de ogenschijnlijk gezonde cellen. Strategieën om Anasta detecterensis zal onderzoeken van de fysiologische mechanismen, de gevaren van ondoden cellen bij de ziekte van pathologie, en mogelijke therapieën mogelijk te Anastasis moduleren. We beschrijven hier effectieve strategieën met levende cel microscopie en zoogdieren caspase biosensor voor het identificeren en volgen anastasis in zoogdiercellen.

Introduction

Apoptose (Grieks voor "vallen tot de dood") wordt over het algemeen aangenomen dat het een one-way proces eindigt in cel zelfmoord 1-7 zijn. Genetische verstoring van pro-dood-genen resulteert in de overleving van extra cellen die anders zouden sterven in gehele dieren, waaronder cellen die reeds de apoptose pathway 8,9 hebben geopend. Ook genetische manipulaties laat gezonde cellen van zoogdieren die op kunstmatige wijze weer te geven "eet me" signalen of die hechting verliezen hun extracellulaire matrix tot de dood door hele cellen fagocytose of entosis respectievelijk 10,11 ontsnappen. Echter, wij en anderen hebben aangetoond dat zonder genetische manipulatie normale gezonde zoogdiercellen en cellijnen kunnen herstellen van de vroege stadia van apoptose 12-15. Gebruik van tools om individuele cellen te volgen, hebben we verder aangetoond herstel van late stadia van apoptose 12,13, na cellen belangrijke checkpoints die typisch zijn verstrekenly markeren de "point of no return" 2-6. Deze checkpoints van laat stadium apoptose omvatten mitochondriale release van cytochroom c, activering van caspases, nucleaire fragmentatie, en de vorming van apoptotische lichamen. Wij keurden een Grieks samengesteld woord "Anastasis", wat betekent "oplopend tot leven", om deze omkering van apoptose beschrijven aan de rand van celdood 2-6.

Tenzij de gehele stervenden-herstelproces wordt waargenomen door live cell imaging, is het een uitdaging om cellen die Anastasis uit cellen die nooit meegemaakt apoptotische gebeurtenissen hebben ondergaan onderscheiden. Decennia van werk is gebleken dat de morfologische kenmerken van de cel zelfmoord door apoptose worden gedreven door evolutionair geconserveerde biochemische en moleculaire gebeurtenissen 16-19. Deze gebeurtenissen bevorderen zelfvernietiging van cellen om ontwikkelings- en homoeostatic processen in eencellige en meercellige organismen te reguleren door het elimineren van beschadigde of dangerous cellen 16-19. Terwijl apoptotische cellen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden door standaard morfologische, biochemische en moleculaire manifestaties van apoptose 1,5,6,16,20, momenteel is er geen bekende marker specifiek Anastasis 12,13. Belangrijk cellen die anastasis hebben ondergaan lijken normale gezonde cellen, en cellen die net beginnen omkeren apoptose verschijnen apoptotische stervende cellen 12,13 zijn. Zo worden nieuwe instrumenten nodig zijn om met zekerheid dat een bepaalde overlevende cel eerder had meegemaakt actieve apoptotische processen.

Apoptose wordt algemeen aangenomen als een onomkeerbare cascade omdat het een snelle en massale vernietigingsproces. Hoewel het enkele minuten zou kunnen nemen om voor sommige cellen om apoptose te starten, zodra mitochondriën apoptotische factoren zoals cytochroom c in het cytosol 21,22 hebben vrijgegeven, kan caspasen worden geactiveerd binnen 5 minuten 23,24, gevolgd door cytoplasmatische ennucleaire condensatie binnen 10 min 25-27, en celdood kort daarna 25-27. Geactiveerde caspasen orkestreren apoptose door splitsing en inactiveren belangrijke structurele en functionele componenten ten behoeve van cellulaire afbraak 2,28, zoals endonuclease inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspasen activeert ook pro-apoptotische factoren, zoals Bcl-2 familielid BID, die translokeert mitochondriën mitochondriale afgifte van cytochroom c 31,32 bevorderen. Caspaseactiviteit resulteert ook in celoppervlak blootstelling van fosfatidylserine als een "eet me" signaal voor het bevorderen van afblazen van stervende cellen door macrofagen of buur cellen via fagocytose 33. Bovendien apoptotische gebeurtenissen maken mitochondriën disfunctioneel, verstoren cellulaire bio-energetica en metabolisme 34,35,36. Zo, het herstel van de vernietiging lijkt intuïtief onwaarschijnlijk.

Anders originele verwachtenties, kunnen cellen de apoptotische celdood proces om te keren, zelfs in een laat stadium. Door het continu bewaken van het lot van de stervende cellen in cultuur, zagen we de omkeerbaarheid van laat stadium apoptose in een reeks van primaire cellen en cellijnen 12,13. Verwijdering van de dood stimulans toegestaan ​​herstel van de openlijke kenmerken van apoptose, zoals mitochondriale fragmentatie, chromatinecondensatie, DNA-schade, plasmamembraan blebbing, celoppervlak blootstelling van fosfatidylserine, vrijkomen van mitochondriale cytochroom c, caspaseactivering, kernfragmentatie, cel krimp, en de vorming van apoptotische lichamen. Deze waarnemingen verhogen onbeantwoorde vragen over de functies, gevolgen en mechanismen van Anastasis. Om deze vragen te beantwoorden, een voorwaarde is om betrouwbaar cellen die Anastasis hebben ondergaan identificeren. Hier beschrijven we live microscopie methoden en een caspase biosensor voor de detectie van cellen die eerder omgekeerd laat stadium apoptose en then overleefde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de Cellen voor live cell imaging

  1. Om het opsporen van morfologische veranderingen te vergemakkelijken, kies hechtende cellen zoals HeLa (humaan cervixcarcinoom) cellen die plat op het substraat wijziging van het plasmamembraan en intracellulaire organellen beter visualiseren.
    Opmerking: Omkering van apoptose waargenomen in verschillende zoogdiercellen 12,13, primaire muizenlever elementen, muis macrofagen, primaire cardiomyocyten van de rat, en ook lijnen zoals humane embryonale nier HEK-293T-cellen, Afrikaanse groene aap renale epitheelcellen COS cel -7-cellen, muis hartspier HL-1-cellen, NIH 3T3 fibroblasten, fret (Mustela putoris furo) hersengebieden CRL1656 cellen, menselijke huidkanker A375 cellen, humane zaadbalkanker CRL1973 cellen, humane kleincellig longcarcinoom H446-cellen, humane leverkanker HepG2-cellen, humane borstkanker MCF7-cellen, humane prostaatkanker PC3-cellen en humane neuroblastoma SH-SY5Y cellen.
  2. Voorwas dekglaasjes van glazen bodem celkweek gerechten met absolute ethanol voor reiniging en sterilisatie.
    Opmerking 1: Het gebruik van glazen bodem gerechten wordt aanbevolen voor hoge kwaliteit differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie en hoge vergroting confocale of epi-fluorescentie microscopie (zie bespreking).
    Opmerking 2: Voor hoge vergrotingen (40X, 60 / 63X of 100X doelstellingen en hoge numerieke openingen 1.3 of 1.4), het gebruik van celkweek gerechten met dunnere glazen bodem (dikte 0,085-,16 mm) zorgt voor een langere werkafstanden voor beeldvorming (zie Protocol 3 ).
  3. Afhankelijk van het celtype kan glazen bodem kweekschalen coating met poly-d-lysine (0,1 mg / ml), collageen (0,01% oplossing in 0,01 M azijnzuur) en / of fibronectine (5 ug / ml) voorafgaand aan zaaien vereisen cellen.
    Opmerking: Optimalisatie van de soort en concentratie bekledingsmiddel is vereist voor verschillende cellijnen. HeLa-cellen kunnen direct hechten op glas zonder coating. Sommige cellen, such als muis hartspier HL-1 cellen, kan niet direct hechten aan glazen oppervlakken, maar vereisen specifieke cultuur en coating protocollen 37.
  4. Zaad ~ 2-3 x 10 5 cellen op 35 mm vooraf gecoate glazen bodem celcultuurschalen en incubeer bij 37 graden Celsius (° C) met 5% CO2 gedurende een dag tot 80% confluentie bereiken.
    Opmerking 1: voor optimale celdichtheid, incubatietijd en kweekomstandigheid kan variëren, afhankelijk van het celtype. Cel confluentie kan de apoptotische respons van cellen (zie protocol 2) beïnvloeden. Bij hoge confluentie, kunnen cellen minder gevoelig dezelfde concentraties van apoptotische stimuli.
    Opmerking 2: Vermijd dan samenvloeiing cellen, zoals hoge celdichtheid morfologische veranderingen van de individuele cellen en hun organellen kunnen verdoezelen.

2. De toepassing en verwijdering van apoptotische cel Stimuli

  1. Kort voor gebruik, voormengsels het apoptose inducerende middel met 37 ° C celkweekmedium. Ethanol (3,6-4,5% Vol / vol) diende als apoptose induceert in deze demonstratie.
    Noot 1: De niet gepubliceerde gegevens tonen dat cellen ook omkeren apoptose die wordt veroorzaakt door andere apoptotische stimuli 12,13, zoals dimethylsulfoxide (DMSO, 8% vol / vol gedurende 24 uur), staurosporine (STS, 0,5 pM voor 1 uur) en taxol (1 uM 12 uur). Optimalisatie van de dosering voor triggering apoptose vereist voor verschillende soorten cellen tot het minimum dosering die de meeste cellen kan leiden in de populatie ondergaan apoptose bewerkstelligen.
    Noot 2: Voormengkamer apoptose-inducerende middelen met celkweekmedium belangrijk ongelijkmatige blootstelling van de cellen aan apoptotische stimuli voorkomen.
  2. Afbeelding een groep gezondheid cellen in de celkweek schaal voordat het apoptose inducerende middel basislijn morfologie stellen.
  3. Verwijder het oorspronkelijke medium uit de cel cultuur schotel en breng daarna 2 ml van voorgemengde apoptose-inducerende middel om de schotel teleiden tot apoptose ondergaan. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 (of andere normale kweekomstandigheden).
  4. Na incubatie observeert de cellen door licht, epi-fluorescentie of confocale microscopie om de progressie van apoptotische functies controleren.
    Noot 1: De cellen ondergaan apoptose morfologische, biochemische en moleculaire kenmerken van apoptose die kan worden gedetecteerd door microscopie en fluorescentie gebaseerde biosensoren weergegeven (zie Protocollen 3 en 4).
    Noot 2: Incubatietijden van cellen met verschillende apoptose inductoren zal variëren afhankelijk van het type cel, aandoeningen (zoals confluentie en voedingstoestand), en de dosis dood stimulus toegepast. Zorgvuldige titratie kan nodig zijn.
  5. Wanneer cellen vertonen kenmerken van apoptose, verwijderen apoptose-inducerend middel door het wassen van de cellen eenmaal met warm (37 ° C, of ​​andere normale kweektemperatuur) vers celkweekmedium.
    Opmerking 1: Als apoptotische cellen losser worden bevestigd opde kweekplaat, is het belangrijk te brengen en te verwijderen medium voorzichtig zodat cellen niet worden weggespoeld.
    Opmerking 2: Leef opgeschort cellen kunnen worden verhaald op de supernatant door zachte centrifugeren (160 g gedurende 1 min) en weer toegevoegd aan de cultuur schotel.
  6. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 2 ml / 35 mm schaaltje vers celkweekmedium in 5% CO2. Alternatief gebruik geconditioneerd medium (celvrij kweekmedium verzameld uit gezonde cellen) verder versterken overleving van apoptotische cellen.
    Opmerking: Wassen en incubatie cellen met vers medium kan de meerderheid van de cellen op ethanol geïnduceerde apoptose te keren na blootstelling aan ethanol 12,13. Echter, herhalen wasstap kan zijn wanneer cellen worden blootgesteld aan andere apoptotische stimuli (zie bespreking).

3. Levende Cell Microscopy

  1. Wij raden het gebruik van een omgekeerde confocale of epi-fluorescentie microscoop met milieu-controle (37 ° C,5% CO2) voor levende cellen microscopie.
    Opmerking: Het is ook mogelijk beeld de cellen met behulp rechtop microscopen met water dompelen doel. Dompel het doel direct in het kweekmedium afbeeldingscellen. Echter, kunnen cellen worden verpletterd door het dompelen objectief tijdens het scherpstellen.
  2. Pre-warm de microscoop (zoals milieu-regelkamer, podium incubator, en objectieve verwarming) ten minste 2 uur voor de beeldvorming.
    Opmerking: Dit laat microscoop componenten thermisch evenwicht te bereiken, zodat de drift van focus en verschuiving van xy vlak kan voorkomen door de thermische uitzetting en contractie van de onderdelen.
  3. Plaats een 35 mm glazen onderste schaal van gekweekte cellen (zie Protocol 1) op het podium van een omgekeerde microscoop en vastleggen celbeelden met een 40x of 63x plan- Apochromat objectief met een numerieke apertuur (NA) 1.3 of 1.4 voor beeldvorming cellen van de bodem van de schaal door dekglaasjes.
    Opmerking: Vermijd het gebruik van meer dan 2 ml medium35 mm glazen onderste schaal, als het gewicht van het medium kromming van de glazen bodem kan veroorzaken, waardoor het moeilijk om de afbeelding een veld van cellen op hetzelfde focal plane.
  4. Handhaaf cellen bij 37 ° C of de overeenkomstige normale temperatuur tijdens de gehele beeldvormingsproces.
    Opmerking: Het proces van apoptose, en waarschijnlijk een omkering van apoptose, afhankelijk van temperatuurgevoelige enzymatische activiteiten. Vandaar dat het handhaven cellen bij 37 ° C (bijvoorbeeld met een microscoop podium top incubator) is gedurende het experiment belangrijk. Verminderde temperatuur zou kunnen vertragen de apoptotische respons en het herstel respons na verwijdering van apoptotische stimulus.
  5. Gebruik een vochtigheid apparaat of leg transparante folie (zie Materialen) op de kweekschaal om water te verminderen door verdamping van het medium.
    Let op: de folie kan de polariteit van licht voor DIC microscopie verstoren. Herstellen polariteit door het aanpassen van de polarisator op het lichtpad.
  6. Handhaaf pH in hetcelkweekmedium (pH 6.8 -7.3) door het incuberen in 5% CO2 met een milieu regelkamer op de microscoop.
    Opmerking: Onderhoud de pH in kweekmedium kan ook verwezenlijkt worden met HEPES buffer, of met commerciële CO 2-onafhankelijke medium (zie Materialen). Optimale omstandigheden kunnen variëren, afhankelijk van het celtype.
  7. Minimaliseren fluorescentie / laser (excitatie lichtintensiteit) blootstelling aan cellen tijdens de beeldvormende proces tot fototoxiciteit voorkomen door het verminderen van de fluorescentie-intensiteit op de laagste die nodig is om beelden van hoge kwaliteit van de cel / subcellulaire structuren of uitgedrukt biosensoren (Details in Protocol 4) te verkrijgen.

4. Strategieën voor het opsporen en volgen Anastasis tijdens en na Apoptotische Evenementen

  1. Plasmamembraan blebbing, cytoplasmatische condensatie, celkrimp en apoptotische lichaam vorming (zie figuren 1A - C, E).
    1. Voeren time-lapse live cell verscrential interferentie contrast (DIC) of fasecontrast microscopie een groep gezondheid cellen volgen en hun celmorfologie (zie Protocol 3 voor levende cel microscopie, en zie bespreking) waarnemen.
      Opmerking 1: Verminder de intensiteit van de lichtbron voor DIC / fase contract beeldvorming tot fototoxiciteit om de cellen te voorkomen.
      Opmerking 2: Als DIC en fasecontrastmicroscopie niet beschikbaar zijn, gebruiken CellTracker naar het cytosol vlek aan de morfologie van levende cellen te schetsen voor confocale of epi-fluorescentie microscopie en monitoring van de morfologie van de cel.
    2. Solliciteer celdood stimulans om cellen te activeren om apoptose te ondergaan (zie protocol 2 voor toepassing en verwijdering van apoptotische stimuli).
    3. Let behandelde cellen morfologische kenmerken van apoptose zoals plasma membraan blebbing, cytoplasmatische condensatie, celkrimp en apoptotische-vorming (Figuren 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Grondig dood stimuli en bevoorrading cellen met vers medium bij de cellen display morfologische kenmerken van apoptose.
      Noot 1: Toepassen celdood stimulus of wijzigt celkweekmedium op de microscoop podium tijdens time-lapse beeldvorming van levende cellen kan worden bereikt door een perfusie celcultuurkamer, of kan direct worden uitgevoerd op de celkweekschaal door voorzichtig pipetteren zonder te raken het gerecht, tijdens de intervallen tussen beeldvorming.
      Opmerking 2: Met nadruk driftcompensatie systemen onscherp van de cellen als gevolg van het verlies van de thermo-evenwicht van de microscoop systeem na het veranderen van de cel kweekmedium (zie bespreking) te vermijden.
    5. Continue time-lapse imaging om het lot van cellen die kenmerken van apoptose weer volgen. Cellen die apoptose achteruit kan schade te herstellen en weer een normale platte morfologie (Figuren 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Mitochondriale fragmentatie, DNA / chromatine condensatie, en nucleaire fragmentatie (zie figuur 1D, 1F, 1G).
    1. Om mitochond visualiserenria, vlek cellen met 50 nM Mitotracker rood / diep rood / groen-fluorescerende kleurstof, en tegelijkertijd vlekken de kern met 10 ug / ml Hoechst 33342 blauwe nucleaire kleurstof in kweekmedium gedurende 20 min bij 37 ° C met 5% CO2.
      Opmerking 1: Verminder de concentratie van kleurstoffen en de duur van de incubatie om de cytotoxiciteit te voorkomen en te verminderen achtergrond fluorescentie wanneer nodig. Optimaliseer de kleuring voorwaarden om een ​​goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen met de minimale hoeveelheid kleurstof en incubatietijd voor kleuring.
      Opmerking 2: Gebruik fluorescerende vlekken voor mitochondriën zoals Mitotracker Red CMXRos, Mitotracker Deep Red FM, of Mitotracker Green FM, dat niet lekken van mitochondriën tijdens apoptose. Dit maakt het visualiseren van mitochondriale morfologie tijdens apoptose en Anastasis. Zie de materialen en apparatuur tabel voor meer informatie over deze vlekken.
    2. Houd gekleurde cellen in het donker te fotobleken voorkomen.
    3. Verwijder overtollige vlek door het wassen van de cellen3 maal met 37 ° C fosfaatbuffer-zoutoplossing (PBS) oplossing of vers celkweekmedium, met 1 min incuberen in vers medium tussen elke wassing en vervolgens verder incuberen in vers medium gedurende 20 min vóór de laatste wassing buitensporige toestaan vlekken om de cellen af ​​te sluiten die niet-specifiek signaal achtergrond voor beeldvorming verminderen.
      Opmerking: Verkort incubatietijd met mobiele medium na kleuring kan resulteren in hoge achtergrond voor de beeldvorming.
    4. Voeren real-time live cell confocale of epi-fluorescentie microscopie om afbeelding gezonde cellen voordat apoptotische inductie wordt toegepast (zie Protocol 3 voor live cell microscopie).
      Opmerking: Gezonde cellen weer buisvormige mitochondriën en ronde kernen in de meeste celtypen (figuren 1D, 1F, 1G).
    5. Leiden tot apoptose ondergaan (zie protocol 2 voor toepassing en verwijdering van apoptotische stimuli aan de cellen).
    6. Doorgaan time-lapse live cell microscopie om veranderingen in de mitochondriale en nucleaire morpholog observerenies onmiddellijk na de dood stimulus wordt toegevoerd aan de cellen. Let cellen kenmerken van apoptose zoals mitochondriale fragmentatie en zwelling, chromatine condensatie en nucleaire fragmentatie in, in tegenstelling tot gezonde cellen die buisvormig mitochondria en rond kernen.
    7. Wanneer de cellen weer te geven kenmerken van apoptose, wassen en leveren cellen met vers medium, en blijven time-lapse imaging om het lot van de cellen te volgen. Cellen die apoptose achteruit te herwinnen normale mitochondriale en nucleaire morfologie (figuren 1D, 1F, 1G).
      Opmerking: Voer DIC microscopie parallel wanneer het mogelijk om extra informatie te verkrijgen voor de toegang tot de stadia van apoptose door het observeren van de veranderingen in de morfologie van de cel in dezelfde groep cellen (zie Protocol 4.1 voor DIC microscopie).
  3. Detectie van mitochondriale release van cytochroom c behulp cellen die stabiel uitdrukken van een cytochroom c-GFP pr fusieotein (zie figuur 2).
    1. Vlek cellen stabiel tot expressie cytochroom c-GFP 23,24 met Mitotracker Rode labelen gepolariseerde cel mitochondriën (Zie stappen 4.2.1 tot en met 4.2.3 voor levende cellen mitochondriën vlekken).
    2. Voeren real-time live cell confocale of epi-fluorescentie microscopie te sporen gezonde cellen (Details in Protocol 3 voor live cell imaging).
      Opmerking: Het cytochroom c GFP signaal voornamelijk gelokaliseerd in de mitochondriën van gezonde cellen (Figuren 2A i, 2B).
    3. Leiden tot apoptose ondergaan (zie protocol 2 voor toepassing en verwijdering van apoptotische stimuli aan de cellen). Doorgaan time-lapse microscopie om translocatie van cytochroom c-GFP observeren vanuit mitochondriën naar het cytosol (figuren 2Aii-iii, 2B).
      Opmerking: Mitochondriale afgifte van cytochroom c in het cytosol is een merker van mitochondriale buitenste membraan permeabilisatie (MOMP)4, een cruciale stap in de mitochondriën-afhankelijke apoptose 21,22
    4. Wanneer de cellen van de cytochroom c-GFP-signaal in het cytoplasma te geven, verwijder de celdood stimulus, en het aanbod cellen met vers medium (zie protocol 2). Doorgaan time-lapse imaging om het lot van cellen met cytosole GFP volgen.
      Opmerking: Cellen die apoptose achteruit te herwinnen normale cel morfologie, en hun cytosole cytochroom c-GFP signaal verminderen vermoedelijk door degradatie of translocatie terug naar mitochondriën (figuren 2Aiv-vii, 2B).
    5. Leg DIC afbeeldingen parallel aan aanvullende informatie te verkrijgen voor de toegang tot de stadia van apoptose door het observeren van veranderingen in de morfologie van de cel in enkele cellen of groep cellen (zie Protocol 4.1 voor DIC microscopie).
  4. Detectie van caspase activiteit met een caspase biosensor (zie figuur 3)
    1. Transfecteren cellen met de caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS voor16 tot 24 uur alvorens ze te onderwerpen aan een apoptotische stimulus 13.
    2. Vlekken op de getransfecteerde culturen met Hoechst 33342 tot celkernen label (zie stap 4.2.1 tot en met 4.2.3 voor live cell nucleaire kleuring).
    3. Voeren real-time live cell confocale of epi-fluorescentie microscopie te sporen gezonde cellen (Details in Protocol 3 voor live cell imaging).
      Opmerking: De NES-DEVD-YFP- NLS biosensor signaal voornamelijk lokaliseert in het cytosol van gezonde cellen als gevolg van zijn nucleaire export signaal (NES) (figuren 3A, 3BI en 3C, zie bespreking).
    4. Leiden tot apoptose ondergaan (zie protocol 2 voor toepassing en verwijdering van apoptotische stimuli aan de cellen). Doorgaan time-lapse microscopie om de nucleaire translocatie van YFP observeren.
      Let op: de activering van caspases splitst de DEVD motief in het caspase biosensor NES-DEVD-YFP- NLS, resulterend in YFP- NLS translocatie van het cytosol naar de kern (figuren 3A, 3Bii-iv, zie bespreking).
      5. Opmerking: Cellen die apoptose reverse weer normale celmorfologie, maar de kern YFP signaal (Figuren 3Bv-x, Cells 1 en 2, en 3D) behouden.
    5. Doorgaan time-lapse beeldvorming om het lot van de cellen die de nucleaire YFP- weer volgen.
      Opmerking: De nucleaire YFP signaal zal gedegradeerd enkele uren worden nadat de cellen apoptose hebben omgedraaid (figuren 3B, vi-x, Cell 1, zie resultaten en discussie) vermoedelijk via de normale cel klaring mechanismen zoals proteasoom degradatie.
    6. Leg DIC afbeeldingen parallel op aanvullende informatie voor toegang fasen van apoptose door het observeren van veranderingen in celmorfologie in afzonderlijke cellen of een groep cellen. (Zie protocol 4.1 voor DIC microscopie).
  5. Celoppervlak blootstelling van fosfatidylserine (zie figuur 4)
    1. Zaad cellen op glkont coverslips tot 80% cel samenvloeiing (zie Protocol 1) te bereiken.
    2. Co-vlek de cellen met rood-fluorescerende Mitotracker en blauw Hoechst 33342 vlek voor mitochondriën en kernen, respectievelijk (zie stap 4.2.1 tot en met 4.2.3 voor levende cellen mitochondriale en nucleaire vlekken).
    3. Trigger cellen om apoptose te ondergaan door een apoptose-inducerend middel (zie protocol 2).
    4. Breng fluorescent gelabelde annexine V (zie Materialen) apoptotische cellen te kleuren 10 min bij 37 ° C voor verwijdering van het apoptose inducerende blootstelling van fosfatidylserine detecteren op het oppervlak van apoptotische cellen.
      Opmerking 1: Gezonde cellen worden niet gekleurd met annexine V omdat fosfatidylserine wordt normaal afgezonderd op de binnenste-folder van de cel plasmamembraan 38. Apoptotische cellen gekleurd met annexine V, die bindt aan fosfatidylserine op celoppervlak (Figuren 4A en 4B).
      Noot 2: Fluorescent gelabelde annexine V kan ook worden toegepast om vlekken apoptotische cellen immediately na verwijdering van de apoptose-inductor, 10 min incubatie.
    5. Verwijder celdood stimulus, was de gekleurde cellen met warm PBS of vers medium eenmaal en daarna voorzien cellen met vers medium gedurende 2 uur bij 37 ° C met 5% CO2 (zie protocol 2).
      Opmerking 1: Cellen die omgekeerd apoptose herwinnen normale morfologie en fluorescent gelabelde annexine V-signaal na het herwinnen van een normale morfologie behouden (Figuren 4A en 4B).
      Opmerking 2: De annexine V-signaal met de tijd af op de herstelde cellen (zie bespreking).
    6. Bevestig cellen op gekozen tijdstippen met 4% paraformaldehyde bevattende 8% sucrose in 1x PBS gedurende 20 min in het donker bij kamertemperatuur, en was de gefixeerde cellen met PBS 3 keer om paraformaldehyde verwijderen voor montage cellen op glasplaatjes dekglaasjes met antifade afdekmedia (Zie Materials) voor confocale of epi-fluorescentie microscopie en observeren annexine V op cellen na verwijdering van apoptose inducerende.
      Opmerking 1: Sucrose in fixatief behoudt celmembraan structuur tijdens fixatie.
      Noot 2: Bewaar de paraformaldehyde oplossing in het donker bij 4 ° C om afbraak te voorkomen.
      Noot 3: Warm up paraformaldehyde oplossing op kamertemperatuur voordat u het op cellen voor bevestiging aan koude schok voor de cellen te voorkomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de omkering van apoptose bestuderen, worden weefselcultuurcellen eerst blootgesteld aan een dood stimulans voor apoptose in gang. Wanneer de cellen vertonen kenmerken van apoptose, wordt vers kweekmedium vervolgens op wegspoelen van de stimulus en incubeer de stervende cellen te herstellen (figuur 1A) mogelijk. Hier, de hamvraag wordt aangepakt, is hoe ver de individuele stervende gekweekte cellen kan evolueren in de richting van apoptose ondergaan Anastasis nog steeds. Deze vraag kan definitief worden beantwoord door continue monitoring met biomarkers naar cel lot met behulp van de hieronder beschreven methoden te volgen.

We hebben eerst onze strategieën beschrijven omkering van apoptose in weefselkweekcellen detecteren met behulp van time-lapse microscopie levende cellen, die nodig is voor het volgen en registreren van de respons van individuele cellen vóór, tijdens en na blootstelling aan een apoptotische stimulus 12,13. Gezonde hechtende cellen uitgespreid op het substraat gehecht (Figuur 1Bi) 12,13, en weergegeven draadvormige mitochondria en rond kernen voorafgaand aan de behandeling (figuren 1Ci, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Na blootstelling aan 3,8-4,5% ethanol in celkweekmedium (vol / vol), DIC of fasecontrast microscopie bleek dat de cellen vertoonden morfologische kenmerken van apoptose, waaronder cytoplasmatische condensatie, plasmamembraan blebbing en celkrimp (figuren 1Bii, 1Cii- iii, en 1Eii-vi) 12,13. Apoptotische-vorming door dezelfde cellen werd gemakkelijk waargenomen door DIC (figuren 1Eii-vi). Fragmentatie van Mitotracker gelabelde mitochondriën (figuren 1Dii-iii 1Fii-vi) 12,13 en de condensatie van Hoechst-gekleurde nucleaire DNA (Figuren 1Dii-iii Fii-iii Gii) 12,13 en fragmentatie van kernen (Figgelen 1Evi en fvi, witte pijlen), werden gelijktijdig gedetecteerd door confocale of epi-fluorescentie microscopie. De cellen die met succes omgedraaid apoptose werden vervolgens geobserveerd om normale morfologie te herwinnen, blijkbaar het repareren van hun schade (figuren 1Biii, C en Div-vi, E en FVII-XII, en GIII) 12,13. Cellen onder deze omstandigheden had ook aangetoond dat het organel beweeglijkheid, cel migratie, en functionele endocytose gebaseerd op de opname van fluorescentie-emitting Quantum Dots en celdeling 13 herwinnen. Interessant sommige cellen die gerespecteerd apoptose weergegeven onregelmatige nucleaire morfologie (figuur 1Fxii), alsook abnormale celdeling en vorming van micronuclei (figuren 1Giv-vii) 13, dat is een biomarker van DNA-schade, chromosoom breuk en hele chromosoomverlies in delende cellen 39, 40. Ontheemden chromosomes of chromosoomfragmenten buiten niet worden opgenomen in de dochtercel kernen omgeven door kernmembraan 39, 40. Aldus kan een gevolg van Anastasis het herbergen van genomen die werden beschadigd tijdens afgebroken apoptose, wat leidt tot het ontstaan ​​van tumoren en kanker progressie. De aanwezigheid van micronuclei is ook gebruikelijk in kankercellen 40,41.

Vrijkomen van mitochondriale cytochroom c is een cruciale stap om te bemiddelen of te versterken, caspase-afhankelijke apoptose 20-22. Met behulp van HeLa-cellen die stabiel tot expressie GFP-gelabeld cytochroom c, we bewaakt de subcellulaire verhuizing van cytochroom c tijdens apoptose en Anastasis door confocale microscopie. Zoals gemeld 23,24, cytochroom c GFP gelokaliseerd mitochondriën voorafgaand aan de behandeling (figuur 2ai en B), maar werd vrijgelaten in het cytosol na overlijden stimulus was aangebracht (Figuren 2Aii,2Aiii en B). Andere karakteristieke morfologie, zoals mitochondriale fragmentatie en plasmamembraan blebbing, werden ook waargenomen in cellen die cytochroom c-GFP (Figuur 2Aiii) had uitgebracht. Deze cellen werden gemeld celdood kort na afgifte van cytochroom c 23-27 ondergaan. Na verwijdering van de dood stimulus waargenomen dat cytosolische cytochroom c GFP niveaus daalden, mitochondriën weer draadvormige structuren, en de plasmamembraan herstelde een normale verschijning (Figuren 2Aiv-vii, en B). Daarom kan apoptotische cellen anastasis ondergaan na mitochondriale afgifte van cytochroom c.

Versterking van de downstream-DEVD klieven caspasen wordt algemeen aangenomen dat het "point of no return" in apoptose 2,5 zijn. Daarom gebruikten we een caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS exprgineel uit een plasmide 13, waardoor het mogelijk overlevende cellen die eerder ondervonden caspase activiteit (figuur 3A) te detecteren. Dit caspase biosensor is een polypeptide met een N-terminale nucleaire uitsluiting signaal (NES), een linker met de caspase-3/7 consensus splitsingsplaats (DEVD) 26,42,43, gevolgd door een geel fluorescent eiwit (YFP) en een C-eindstandige nucleair lokalisatiesignaal (NLS). In gezonde cellen, dit biosensor voornamelijk lokaliseert het cytosol als functie van de NES (figuren 3BI, Ci-IV, en D) 13. Tijdens apoptose geactiveerd caspases klieven DEVD motief, vrijgeven YFP-NLS, die op efficiënte translocatie van het cytosol naar de kern van cellen die gelijktijdig of daarna, weer andere kenmerken van apoptose zoals DNA / chromatine condensatie en aan cellen (Figuren 3B II -iv, en D) 13. Aldus, dese cellen behouden functie nucleaire import volgende caspaseactivering. Na verwijdering van het apoptose inducerende cellen die anastasis tonen morfologische herstel ook na caspase activatie opgetreden (ondergaan figuren 3Bv-x, en D) 13, blijkbaar achteruitrijden laat stadium apoptose. Tijdens het herstel van de normale morfologie, de nucleaire YFP signaal af in intensiteit in sommige cellen wanneer ze beginnen te apoptose te keren na het verwijderen van de dood stimulus (Cijfers 3Bv-x, Cell 1) 13, wat suggereert dat de cellen af te breken de-caspase gekliefd biosensor, eventueel door hetzelfde mechanisme gebruikt om andere caspase gesplitst produkten tijdens en na Anastasis verwijderen.

Anastasis kan ook worden gedetecteerd zonder live cell microscopie. Dit kan worden bereikt door gebruik van fluorescent gelabelde annexine V 38,44, die bindt en merken veruiterlijkte fosfatidylserine (PS) in een vroege stap van apoptose ( (figuur 4B) 13, fosfatidylserine is beperkt tot de binnenste leaflet van de plasmamembraan van gezonde cellen 38. Daarentegen ethanol geïnduceerde apoptotische stervende cellen bloot fosfatidylserine aan het celoppervlak (Figuur 4B) 13 en derhalve kan het fluorescerende annexine V 38,44 gelabeld. Opmerkelijk kan annexine-V gelabelde cellen normale morfologie herwinnen na verwijdering van de dood stimuli, wat suggereert dat primaire cardiomyocyten apoptose (figuur 4B) 13 zijn omgekeerd. Anderen hebben eerder aangebrachte dezelfde strategie die herstel van apoptose kan voorkomen in vivo suggereren. In een in vivo model van voorbijgaande ischemische schade, caspase-afhankelijke annexine V etikettering van cardiomyocyten als konijnen en muizen schijnbaar regeraadpleegd in de internalisering van annexine V door overlevende cellen na voorbijgaande ischemie 45, wat erop wijst dat Anastasis kunnen optreden in levende dieren. Bovendien twee andere onderzoeken gebruikt celsortering tot een fractie van annexine-V gemerkt muis BCL 1 .3B3 B-lymfoomcellen (blootgesteld aan anti-immunoglobuline-antilichamen die apoptose induceren in BCL 1 .3B3) en muizen borstcarcinoom MOD cellen die temperatuur identificeren -gevoelige p53 (dat apoptose na geïncubeerd onder permissieve temperatuur veroorzaakt) bleven verspreiden nadat ze waren teruggekeerd naar normale kweekomstandigheden 14,15. Gezamenlijk suggereren deze studies dat annexine V is nuttig voor het bepalen van het lot van cellen die apoptose hebben omgekeerd zonder levende cellen microscopie. Er zijn echter restricties met deze strategie, zoals annexine V fluorescentie is niet permanent (figuur 4B) 13, blijft detecteerbaar een paar uur na verwijdering van de dood stimulus, zodatdeze methoden niet op lange termijn volgen van cellen die apoptose omgekeerd.

Figuur 1
Figuur 1: Tracking omkering van apoptose door live cell imaging. (Overgenomen met toestemming van Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, voor figuren 1A -. D en G). (A) aanpak om apoptose te induceren en vervolgens laat gekweekte cellen om te herstellen na het wegwassen van de apoptose inducerende. (B) Time-lapse live cell fasecontrastmicroscopie van gezonde primaire muis levercellen (onbehandeld), dezelfde groep cellen die werden behandeld met 4,5% ethanol in kweekmedium (vol / vol) gedurende 5 uur (bewerkt), en vervolgens gewassen en verder geïncubeerd met vers kweekmedium gedurende 24 uur (gewassen). Schaal bar, 100 micrometer. (C) Continue time-lapse live cell epi-fluorescentie microscopie van dezelfde primaire muis levercel voordat ethanol behandeling (i), op de aangegeven tijdstippen na behandeling met 4,5% ethanol in celkweekmedium 2,5 uur (II en III), en na wassen en incubatie met vers medium om herstel mogelijk gedurende 1 uur (iv - vi). Samengevoegde beelden van Mitotracker-gekleurd mitochondriën (rood) en het Hoechst-gekleurde kern (blauw) werden gevisualiseerd door epi-fluorescentie microscopie, en morfologie van de cel door DIC microscopie. Schaal bar, 10 micrometer (D) Samengevoegd fluorescentie alleen (zonder DIC) beelden van paneel C. Onthullen organel morfologie. (E) Continu time-lapse live cell confocale microscopie van het menselijk kleincellig longcarcinoom H446 cellen voordat ethanol behandeling (i) Na behandeling met 3,8% ethanol in celkweekmedium gedurende 2 uur 28 min (ii-vi), en na wassen en incubatie met vers medium tot herstel (VII-XII) mogelijk. Samengevoegde beelden van Mitotracker-gekleurd mitochondriën (rood) en het Hoechst-gekleurde kernen (blauw) werden gevisualiseerd door confocale microscopie, en c ell morfologie door DIC microscopie. Witte pijlen geven een gefragmenteerd kern in apoptotische lichamen (vi). Schaal bar, 10 um. (F) Samengevoegd fluorescentiebeelden alleen (zonder DIC) uit paneel E onthullen organel morfologie. (G) Continu time-lapse live cell epi-fluorescentie microscopie voor monochrome Hoechst-gekleurd nucleaire beeldvorming van een enkele HeLa cel die onnauwkeurig celdeling ondergaat. Voor ethanol behandeling (i) behandeling met 4,3% ethanol in celkweekmedium 5 uur (ii) en na verwijdering ethanol (gewassen iii-vi). Panelen iv onthult abnormale celdelingen. Rode pijlen geven de belangrijkste kernen in de verdeelde cellen (IV vi). Schaal bar, 30 micrometer. Tijden zijn aangeduid als hr: min. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

guur 2 "src =" / files / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Figuur 2: Detectie omkering van apoptose na mitochondriale afgifte van cytochroom c (A) Continue time-lapse live cell confocale microscopie van HeLa-cellen die stabiel tot expressie cytochroom c-GFP (Cyto C GFP) voor (i), tijdens (ii-iii) en na (III-VII) blootstelling aan 3,9% ethanol in celkweekmedium. Samengevoegd confocale beelden van CytoC-GFP (groen), Mitotracker-gekleurd mitochondriën (rood), en Hoechst-gekleurde kernen (blauw) worden gecombineerd met DIC beelden (linker paneel). Samengevoegde versies worden afzonderlijk weergegeven voor CytoC-GFP, gepresenteerd als een heat map van de intensiteit van het signaal (links midden paneel), zwart-wit beeld van CytoC-GFP (middenpaneel), en zwart-wit beeld van de mitochondriën (rechts midden paneel). Samengevoegde afbeeldingen CytoC-GFP en mitochondriën (rechterpaneel). (B) De verandering van de cytosolische cytochroom c-GFP signaalintensiteit van de cellen Cell 1 en Cell 2, zoals aangegeven in het zwart-wit beeld CytoC-GFP bij Panel Ai. Tijden zijn aangeduid als hr: min. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Het detecteren van omkering van apoptose na caspaseactivering (Overgenomen met toestemming van Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, voor figuren 3A - D.). (A) Schematische weergave van de biosensor caspase-fusie-eiwit samengesteld uit een nucleair export signaal (NES) de DEVD caspase splitsingsplaats, geel fluorescerend eiwit (YFP) en nucleair lokalisatiesignaal (NLS). (B) Continue time-lapse levende cell confocale microscopie van HeLa-cellen die de caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS voor (i), tijdens (ii -iv) en na (VX) blootstelling aan 4,3% ethanol in cel kweekmedium. Samengevoegd confocale beelden van de caspase biosensor (groen), Hoechst-gekleurde kernen (blauw) en DIC beelden (linker paneel), een zwart-wit beelden van YFP signaal (middelste paneel), en een heat map met vermelding van de YFP signaalintensiteit (rechter paneel) . (C) Onbehandelde controles in paneel B. (D) gekwantificeerde fluorescentie-intensiteiten van de geactiveerde nucleaire caspase biosensor in afzonderlijke cellen (genummerd 1 en 2 in panel Bi) voor, geanalyseerd tijdens en na blootstelling aan ethanol, en onbehandelde controles (genummerd 3 en 4 in paneel Ci) werden berekend als het percentage YFP in de nucleus (kern / totaal cel YFP signaalintensiteit x 100%). Tijden zijn aangeduid als uur: min. Schaal bar, 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

egen "> Figuur 4
Figuur 4: Het detecteren van omkering van apoptose door fluorescent gelabelde annexine V (Overgenomen met toestemming van Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, voor figuren 4A - B.). (A) Schematische weergave van het annexine V-FITC Anastasis assay gebruikt in paneel B. (B) Neonatale rat primaire cardiale hartspiercellen en werden blootgesteld aan 4,5% ethanol in celkweek medium voor 5 uur, en vervolgens geïncubeerd met annexine V-FITC voor 10 min vóór verwijdering van de ethanol medium. Cellen werden ofwel direct gerepareerd (behandeld), of na opnieuw voeden met vers medium gedurende nog 2 uur herstel vastgesteld (gewassen). Onbehandelde cellen die werden blootgesteld annexine V-FITC dienen als controle (onbehandeld). Mitotracker gekleurde mitochondria (rood), Hoechst-gekleurde kernen (blauw) en annexine V-FITC (groen) werden gevisualiseerd door confocale microscopie en celmorfologie werd gevisualiseerd door DIC microscopie. Scale bar, 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis verwijst naar het verschijnsel waarbij cellen die celdood route geactiveerd vervolgens omgekeerde stervensproces en overleven. Hier hebben we aangetoond dat live cell imaging kan worden gebruikt om te bevestigen dat het dezelfde individuele cellen in feite apoptotische celdood proces om te keren in een laat stadium, en dan verder overleven en reproduceren. De protocollen worden enkele geoptimaliseerde celtypespecifieke behandelingsomstandigheden apoptose induceren en maken een groot deel van de cellen aan de omkering van apoptose onderzocht met verschillende biomerkers voor ijk. Wat technische problemen werden glazen bodem gerechten gebruikt kweek cellen voor beeldvorming 12,13, vanwege de zeer dunne transparante glas tussen cellen en het microscoopobjectief, die lange werkafstand voor hoge kwaliteit confocale en epi-fluorescentie microscopie bij krachtige toelaat, vergemakkelijkt de observatie van klassieke apoptose waaronder mitochondriale fragmentatie, Afgifte van cytochroom c en nucleaire condensatie en fragmentatie. Glas is ook niet van een verstoring van de polariteit van het licht, van hoge kwaliteit DIC microscopie voor de bewaking van membraan blebbing, cel krimp van cellen, en apoptotische lichaam formatie tijdens apoptose mogelijk te maken. DIC microscopie heeft voordelen boven fasecontrastmicroscopie deze morfologische kenmerken van apoptose observeren, zoals DIC verbetert het contrast van ongekleurde en transparante celmonsters, betere detectie van celmorfologieën. Als DIC en fasecontrast microscopie beschikbaar zijn, kan CellTracker worden gebruikt om het cytosol vlek op de morfologie van levende cellen uiteengezet voor confocale of epi-fluorescentie microscopie en toezicht op de celmorfologie.

De toepassing van de juiste doses van de dood stimuli en de strategieën van de verwijdering van de stimuli zijn kritische stappen voor de detectie van Anastasis. We hebben ervoor gekozen om lage concentraties van ethanol te gebruiken als een dood stimulans voor de experimenten described hier omdat een groot percentage van de behandelde cellen gelijkmatig kan apoptose ondergaan en kan herstellen van deze, potentieel mildere, dood stimulus. Toch hebben deze benaderingen kunnen ook met succes worden toegepast met andere dood stimuli, zoals reeds gemeld 12,13. Sommige dood stimuli zijn inherent moeilijker dan andere, zoals staurosporine (STS), een veelgebruikt apoptose inducerende agens. Misschien omdat het bindt zijn substraten met een hoge affiniteit 46-48, herhaalde wassingen essentieel maar kan niet efficiënt STS verwijderd uit de cellen. In dit geval, met lagere concentraties geneesmiddel en kortere geneesmiddel incubatietijd die nog kunnen activeren apoptotische stervensproces kan nuttig om meer cellen om apoptose te keren. Re-voeden cellen met geconditioneerde celcultuurmedium kan ook verbetering van omkering van apoptose beter dan de verse celcultuurmedium. Apoptotische cellen worden meestal losjes verbonden aan de cultuur schotel oppervlak vooral op glas surgezichten, daarom is het van belang de apoptose inducerende zachtjes weg te wassen om te voorkomen dat het losmaken van cellen. Coating glazen schalen met poly-D-lysine, collageen en / of fibronectine kan celhechting toenemen als u bepaalde typen cellen, zoals cardiomyocyten 37, goed hechten op het glas van celcultuurschalen, vooral na blootstelling van cellen aan een dood stimulus.

Het proces van apoptose, en waarschijnlijk een omkering van apoptose, afhankelijk van enzymatische activiteiten die kunnen worden beïnvloed door temperatuur. Vandaar dat het handhaven cellen bij 37 ° C of bij de normale kweekomstandigheid het hele leven beeldvormingsproces belangrijk reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten. Pre-warm microscoop voordat live cell imaging is ook een cruciale stap die het mogelijk maakt de microscoop componenten om thermo-evenwicht te bereiken. Dit kan voorkomen dat de drift van focus en verschuiving van xy vlak door de thermische uitzetting en krimp van decomponenten tijdens live cell imaging. Aanbrengen of verwijderen van de dood stimulus door het veranderen van het medium een ​​kweekschaal met ofwel een pipet of door perfusie in de voorverwarmde microscopiesysteem in time-lapse imaging nog drift nadruk veroorzaakt door veranderingen in temperatuur of volume van het medium. Z-stack acquisitie kunnen helpen afbeeldingscellen de juiste brandvlak, maar het risico van fototoxiciteit verhogen door extra blootstelling van cellen aan fluorescerende lasers. Alternatief gebruik focus driftcompensatie systemen, zoals een infrarood-laser gebaseerde automatische scherpstelling systeem, kunnen cellen op hetzelfde focal plane houden tijdens time-lapse beeldvorming van levende cellen door het handhaven van de afstand tussen de cellen / glas en het doel zonder bijkomende blootstelling van de cellen aan korte golflengte, fototoxisch fluorescentie.

Mitochondriale afgifte van apoptotische eiwitten zoals cytochroom c, en activering van effector caspasen, zoals de stroomafwaartse / effectof caspase-3 en caspase-7, zijn over het algemeen beschouwd als het "point of no return" in de apoptotische celdood proces 2,5,6 zijn. Western blots werden gebruikt om de splitsing (activatie) van caspase-3 en zijn substraten zoals poly (ADP) -ribose polymerase-1 (PARP) en DFF45 / ICAD in de gehele celpopulatie gedurende apoptose inductie en na verwijdering van apoptotische detecteren stimuli, en bleek dat gesplitste caspase-3, ICAD, en PARP getoond in cellen tijdens de blootstelling aan de dood stimuli, maar verdween na de cellen werden opnieuw feed met vers kweekmedium 13. Deze werkwijzen onthullen de algemene conditie celpopulatie, maar de afzonderlijke cellen die uiteindelijk zullen sterven aan die zullen keren apoptose en overleven niet onderscheiden. Biochemische fractionering tot het vrijkomen van mitochondriale cytochroom c analyseren heeft vergelijkbare kanttekeningen. Daarom, om het lot van afzonderlijke cellen na afgifte van cytochroom c en caspase-ac volgenactivatie, twee van de meest bekende kenmerken van apoptose 2,5,6, GFP-gelabeld cytochroom c (Cyto C GFP) en een caspase biosensor, zoals de hier gebruikte NES-DEVD-YFP-NLS, in combinatie met levende cellen microscopie omzeilen deze problemen door het direct observeren morfologische herstel en de translocatie van de Cyto C-GFP biosensor in dezelfde cellen. Deze resultaten geven de omkeerbaarheid van apoptose na mitochondriaal cytochroom c afgifte en caspase activering.

De huidige uitdaging voor het bestuderen Anastasis is het gebrek aan labeling technieken om cellen die anastasis hebben ondergaan op elk punt gedurende hun levensduur, in vivo of in vitro te detecteren. Stabiele expressie van het caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS maakt ook detectie van caspase activiteit als caspasen opnieuw worden geactiveerd in de toekomst, maar niet permanent caspaseactiviteit opnemen terwijl de geactiveerde biosensor wordt afgebroken zonder Sustained caspaseactiviteit 13. Andere eerder gemeld caspase biosensoren, zoals een op FRET gebaseerde biosensoren SCAT (bijv ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 en fluorescerende reporters Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] GFP) 50 en CPV (bijv CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52 kan worden gebruikt om caspase te detecteren in gehele dieren en in gekweekte cellen, maar vergelijkbare beperkingen. Evenzo kan Cyto C GFP niet worden gebruikt om cellen die apoptose omgekeerd lange termijn volgen, deze wordt vrijgegeven uit mitochondriën in het cytosol tijdens apoptose en vervolgens afgebroken. Annexine V etikettering gebruikt om cellen die apoptose omgekeerd volgen, maar de signaal intensiteit neemt af met de tijd, dus niet bruikbaar voor lange termijn volgen van Anastasis 13,45. Continue langdurige in vivo beeldvorming kan worden gebruikt om het lot van dezelfde cellen volgen na blootstelling dood stimuli. Echter, op lange termijn in vivo beeldvorming nog steeds uitdagend to presteren in de meeste levende dieren. Daarom aanvullende benaderingen nodig om Anastasis onderzoek uit te breiden tot geheel dierproeven, en voor het screenen van geneesmiddelen die kunnen bevorderen of remmen anastasis behulp weefselcultuurcellen

In de toekomst zijn nieuwere protocollen en technieken die op lange termijn lot van de cel te volgen die nodig zijn voor het ontwikkelen en testen van de fysiologische, pathologische en therapeutische implicaties van Anastasis. We stelden voor dat Anastasis een algemene overleving van de cel mechanisme zou kunnen zijn om beschadigde cellen die moeilijk te vervangen, zoals volwassen neuronen en hartcellen 13 zijn te redden. Echter, kon Anastasis van apoptotische kankercellen na chemotherapeutische behandelingen leiden tot herstel van de gevaarlijke cellen leidt tot herhaling van resistente tumoren 12,13. Anastasis zou ook een belangrijk mechanisme van het ontstaan ​​van tumoren, zoals sommige cellen weer oncogene transformatie nadat ze omgedraaid apoptose 13. Daarom is het verbeteren van Anastasis kon een nieuw Thera zijnrapeutische strategie voor het remmen van neurodegeneratie en hartfalen, en onderdrukt Anastasis als een nieuwe manier voor het voorkomen of behandelen van kanker. Het ontwikkelen van biosensoren voor omkering van celdood bij de ziekte modelsystemen te volgen zal het begrip van de overleving van de cel mechanismen van de Anastasis, en mogelijke therapieën voor de behandeling hardnekkige ziekten te bevorderen door het moduleren Anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann en Rev. Dr. James Voelz voor het suggereren van het woord "Anastasis" om omkering van apoptose te beschrijven; Douglas R. Groen voor HeLa-cellen die op stabiele wijze cytochroom c-GFP; Charles M. Rudin en Eric E. Gardner voor H446 cellen; Heather Lam voor hulp in cartoon tekening op de video; Yee Hui Yeo voor waardevolle bespreking van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), de Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright beurs 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation fellowship (HLT), NIH verleent NS037402 (JMH) en NS083373 (JMH), en Universitaire Commissie Subsidies van de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang is een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Tags

Cellular Biology Anastasis apoptose apoptotische lichamen caspase celdood krimp celzelfmoord cytochroom c DNA schade genetische veranderingen mitochondrial buitenste membraan permeabilisatie (MOMP) geprogrammeerde celdood omkering van apoptose
Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick,… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter