The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.
القيامة (اليونانية ل "ارتفاع في الحياة") يشير إلى انتعاش الخلايا الميتة. قبل هذه الخلايا على التعافي، وأنها مرت عبر نقاط التفتيش مهمة من موت الخلايا المبرمج، بما في ذلك تجزئة الميتوكوندريا، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج في العصارة الخلوية، وتفعيل caspases، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والتجزؤ النووي، blebbing غشاء البلازما، وانكماش الخلايا، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وتشكيل هيئات أفكارك. يمكن أن يحدث القيامة عندما تتم إزالة المثيرات أفكارك قبل الموت، مما يسمح الخلايا الميتة لعكس موت الخلايا المبرمج وآليات الموت يحتمل الأخرى. لذلك، يظهر القيامة لإشراك عمليات الشفاء الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن الحفاظ على الخلايا التالفة بشكل غير لائق. وظائف وآليات القيامة لا تزال غير واضحة، عرقل في جزء من أدوات محدودة للكشف عن الأحداث الماضية بعد التعافي من خلايا سليمة ظاهريا. استراتيجيات للكشف عن anastaوجهاز الأمن والمخابرات تمكين دراسات الآليات الفسيولوجية، والمخاطر الخلايا أوندد في علم الأمراض المرض، والعلاجات المحتملة لتعديل القيامة. هنا، نحن تصف استراتيجيات فعالة باستخدام المجهر الخلايا الحية وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس الثدييات لتحديد وتتبع القيامة في خلايا الثدييات.
موت الخلايا المبرمج (اليونانية ل "يسقط إلى الموت") يفترض عموما أن يكون عملية ذات اتجاه واحد تنتهي في خلية انتحارية 1-7. اضطراب وراثي للجينات النتائج المؤيدة للوفاة في بقاء الخلايا الإضافية التي من شأنها أن يموت على خلاف ذلك في الحيوانات كلها، بما في ذلك الخلايا التي بدأت بالفعل 8،9 مسار موت الخلايا المبرمج. وبالمثل، التلاعب الجيني تسمح خلايا الثدييات الصحية التي تعرض بشكل مصطنع "أكل لي" إشارات أو التي تفقد الإلتصاق إلى مصفوفة من خارج الخلية إلى الهروب الموت البلعمة خلية كاملة أو entosis، على التوالي 10،11. ومع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أنه من دون التلاعب الجيني خلايا الثدييات صحية طبيعية وخطوط الخلايا يمكن أيضا استرداد من المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج 12-15. استخدام أدوات لتتبع الخلايا الفردية، ولقد أثبتت مزيد من التعافي من المراحل المتأخرة من موت الخلايا المبرمج 12،13، بعد مرور خلايا نقاط التفتيش الهامة التي نموذجيةلاي بمناسبة "نقطة اللاعودة" 2-6. وتشمل هذه الحواجز من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج، وتفعيل caspases، والتجزؤ النووي، وتشكيل هيئات أفكارك. اعتمدنا كلمة مركبة اليونانية "القيامة"، وهو ما يعني "ارتفاع في الحياة"، لوصف هذا عكس موت الخلايا المبرمج على شفا موت الخلية 2-6.
إلا إذا لوحظ عملية استرداد الموت بأكملها من خلال تصوير الخلايا الحية، فإنه يمثل تحديا للتمييز الخلايا التي خضعت القيامة من الخلايا التي لم يشهد الأحداث أفكارك. وقد كشفت عقود من العمل أن السمات المورفولوجية للانتحار الخلية عن طريق الخلايا هي التي تحرك الأحداث البيوكيميائية والجزيئية الحفظ تطويريا 16-19. هذه الأحداث تعزز التدمير الذاتي للخلايا لتنظيم العمليات التنموية وhomoeostatic في الكائنات وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا من خلال القضاء على تلف أو دخلايا angerous 16-19. في حين أن الخلايا أفكارك يمكن تمييزها بسهولة من المظاهر الشكلية، والكيمياء الحيوية والجزيئية موحدة للموت الخلايا المبرمج 1،5،6،16،20، حاليا لا يوجد أي علامة معروفة محددة لالقيامة 12،13. الأهم من ذلك، تظهر الخلايا التي خضعت القيامة لتكون الخلايا السليمة العادية، والخلايا التي تبدأ فقط عكس موت الخلايا المبرمج تظهر الخلايا أفكارك كما الموت 12،13. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات جديدة لإبرام مع اليقين أن خلية على قيد الحياة نظرا قد شهدت في السابق عمليات أفكارك النشطة.
ويفترض موت الخلايا المبرمج عموما باعتباره سلسلة لا رجعة فيها لأنها عملية التدمير السريعة والواسعة النطاق. في حين ان الامر قد يستغرق دقائق إلى أيام لبعض الخلايا لبدء موت الخلايا المبرمج، بمجرد الإفراج الميتوكوندريا عوامل apoptogenic مثل السيتوكروم ج في العصارة الخلوية 21،22، يمكن تنشيط caspases خلال 5 دقائق 23،24، تليها حشوية والتكثيف النووي في غضون 10 دقيقة 25-27، وموت الخلايا بعد ذلك بوقت قصير 25-27. caspases تنشيط الانسجام موت الخلايا المبرمج من قبل الشق وتعطيل المكونات الهيكلية والوظيفية الرئيسية لغرض هدم الخلوي 2،28، مثل مثبطات نوكلياز داخلية DFF45 / ICAD 29،30. أيضا تفعيل Caspases العوامل المؤيدة لأفكارك، مثل BID عضو BCL-2 الأسرة، التي translocates إلى الميتوكوندريا لتعزيز الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج 31،32. النتائج النشاط كاسباس أيضا في التعرض سطح الخلية من فسفاتيديل بأنه "أكل لي" إشارة لتعزيز ابتلاع الموت الخلايا الضامة أو الخلايا المجاورة من خلال 33 البلعمة. وعلاوة على ذلك، والأحداث أفكارك تجعل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا، وتعطيل الطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 34،35،36. وهكذا، يبدو من غير المحتمل بشكل حدسي الشفاء من هذا التدمير.
وعلى عكس الأصلي نتوقعations، يمكن للخلايا عكس عملية موت الخلايا أفكارك حتى في مرحلة متأخرة. من خلال المراقبة المستمرة مصير الموت الخلايا في الثقافة، لاحظنا عكس من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج في مجموعة من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا 12،13. إزالة الحوافز الموت سمحت التعافي من الميزات العلنية من موت الخلايا المبرمج، مثل تجزئة الميتوكوندريا، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والبلازما blebbing الغشاء، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج، وتفعيل كاسباس، والتجزؤ النووي، انكماش الخلية، وتشكيل هيئات أفكارك. هذه الملاحظات تثير علامات الاستفهام بشأن الوظائف، والعواقب، وآليات القيامة. لمعالجة هذه المسائل، وهو شرط أساسي هو تحديد موثوق الخلايا التي خضعت القيامة. هنا، نحن تصف أساليب الفحص المجهري المباشر وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس للكشف عن الخلايا التي قد عكس في السابق أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج والعشريننجا أون.
القيامة يشير إلى ظاهرة حيث الخلايا التي تم تنشيطها مسار موت الخلايا بعد ذلك عكس عملية الموت والبقاء على قيد الحياة. هنا، لقد أثبتنا أن تصوير الخلايا الحية يمكن أن تستخدم للتأكد من أن الخلايا الفردية نفسها في الواقع يمكن عكس أفكارك عملية موت الخلايا في مرحلة متأخرة، و…
The authors have nothing to disclose.
نشكر القس الدكتور رالف Bohlmann والقس الدكتور جيمس Voelz لاقتراح كلمة "القيامة" لوصف عكس موت الخلايا المبرمج. دوغلاس R. الأخضر للخلايا هيلا معربا عن ستابلي السيتوكروم ج -GFP. تشارلز M. رودين واريك E. غاردنر لH446 خلايا. هيذر لامب للمساعدة في الرسوم المتحركة الرسم في الفيديو؛ يي هوى يو لمناقشة قيمة هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل زمالة السير إدوارد Youde التذكارية (HLT)، ومنح الدراسية الدكتور والتر Szeto التذكارية (HLT)، منحة فولبرايت 007-2009 (HLT)، زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (HLT)، NIH منح NS037402 (JMH) وNS083373 (JMH)، ولجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة). هو لام تانغ هو مؤسسة زميل Shurl وكاي كورتشي لمؤسسة بحوث علوم الحياة.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | / | |
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |