The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.
Anastasis (יווני עבור "עולה לחיים") מתייחס להתאוששות של תאים מתים. לפני תאים אלה להתאושש, הם עברו דרך מחסומים חשובים של אפופטוזיס, כוללים פיצול של המיטוכונדריה, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום לcytosol, הפעלה של caspases, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, פיצול גרעיני, blebbing קרום פלזמה, התכווצות תא, חשיפת תא שטח של phosphatidylserine, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. Anastasis יכול להתרחש כאשר גירויים אפופטוטיים יוסרו לפני המוות, ובכך מאפשרים לתאים למות כדי להפוך אפופטוזיס ומנגנוני מוות פוטנציאלי אחרים. לכן, Anastasis מופיע לערב תהליכי ריפוי פיסיולוגיים שיכול גם לקיים תאים פגומים בצורה בלתי הולמת. הפונקציות והמנגנונים של Anastasis עדיין אינן ברורות, הקשו בחלקו על ידי הכלים מוגבלים לאיתור אירועי עבר לאחר ההתאוששות של תאים בריאים לכאורה. אסטרטגיות כדי לזהות anastasis יאפשר מחקרים של המנגנונים הפיסיולוגיים, סכנות של תאים מתים בפתולוגיה מחלה, ורפויים פוטנציאליים לווסת Anastasis. כאן אנו מתארים אסטרטגיות יעילות באמצעות מיקרוסקופ תא חי וbiosensor caspase יונקים לזיהוי ומעקב Anastasis בתאי יונקים.
אפופטוזיס (יווני "נופל למוות") הנחה הוא בדרך כלל להיות תהליך חד-כיווני המסתיים בתא התאבדות 1-7. הפרעה גנטית של תוצאות גני פרו-מוות בהישרדותם של תאים נוספים שאחרת היה מתים בכל בעלי חיים, כוללים תאים שכבר יזמו את 8,9 מסלול אפופטוזיס. באופן דומה, מניפולציות גנטיות מאפשרות לתאי יונקים בריאים באופן מלאכותי להציג "לאכול אותי" אותות או שיאבדו את הדביקות למטריצת החוץ תאית שלהם כדי להינצל ממוות על ידי phagocytosis כל תא או entosis, בהתאמה 10,11. עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי ללא תאי מניפולציה גנטית נורמלים בריאים יונקים ושורות תאים יכולים גם להתאושש מהמוקדמים של אפופטוזיס 12-15 שלבים. שימוש בכלים כדי לעקוב אחר תאים בודדים, יש לנו הפגנו נוסף התאוששות מהשלבים מאוחרים של אפופטוזיס 12,13, לאחר התאים עברו מחסומים חשובים שאופייניly לסמן את "נקודת אל-חזור" 2-6. מחסומים אלה של אפופטוזיס שלב מאוחר כוללים שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C, הפעלה של caspases, פיצול גרעיני, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. אנחנו אימצנו מילה יוונית מתחם "Anastasis", שפירושו "עולה לחיים", כדי לתאר את המהפך הזה של אפופטוזיס על סף מות תא 2-6.
אלא אם כן את תהליך גסיסה-ההתאוששות כולו נצפה על ידי הדמיה תא חי, הוא מאתגר להבחין בין תאים שעברו Anastasis מהתאים שמעולם לא חוו אירועים אפופטוטיים. עשרות שנים של עבודה חשפו כי תכונות מורפולוגיות של התאבדות תאים על ידי אפופטוזיס מונעות על ידי אירועים ביוכימיים ומולקולריים אבולוציונית שמורה 16-19. אירועים אלה לקדם הרס עצמי של תאים כדי לווסת תהליכים התפתחותיים וhomoeostatic באורגניזמים חד תאיים ורבים תאיים על ידי ביטול פגום או דתאי angerous 16-19. בעוד תאים אפופטוטיים ניתן להבחין בקלות על ידי גילויים מורפולוגיים, ביוכימי ומולקולריים אחידים של אפופטוזיס 1,5,6,16,20, כרגע אין סמן ידוע ספציפי לAnastasis 12,13. חשוב לציין, תאים שעברו Anastasis נראים תאים נורמלים בריאים, ותאים שפשוט להתחיל היפוך אפופטוזיס מופיע תאים מתים אפופטוטיים כ12,13. לפיכך, יש צורך בכלים חדשים לקבוע בודאות כי תא ששרד נתון חווה בעבר תהליכים אפופטוטיים פעילים.
אפופטוזיס מקובל להניח כמפל בלתי הפיך, כי זה הוא תהליך הרס מהיר ומסיבי. למרות שזה יכול לקחת דקות לימים לכמה תאים ליזום אפופטוזיס, פעם המיטוכונדריה שיחררה גורמי apoptogenic כגון ציטוכרום C לתוך cytosol 21,22, ניתן להפעיל caspases תוך 5 דקות 23,24, ואחריו cytoplasmic ועיבוי גרעיני בתוך 10 דקות 25-27, ותא מוות זמן קצר לאחר מכן 25-27. caspases הופעל לתזמר אפופטוזיס על ידי ביקוע וinactivating רכיבים מבניים ותפקודיים מפתח לצורך ההריסה הסלולרית 2,28, כגון מעכבי endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases גם להפעיל גורמים פרו-אפופטוטיים, כגון BID חבר BCL-2 משפחה, אשר translocates למיטוכונדריה כדי לקדם את שחרורו של המיטוכונדריה של ציטוכרום C 31,32. פעילות caspase גם תוצאות חשיפת תא שטח של phosphatidylserine כאות "לאכול אותי" לקידום בליעה למות תאים על ידי מקרופאגים או תאי שכנים דרך phagocytosis 33. יתר על כן, אירועים אפופטוטיים להבהיר המיטוכונדריה מתפקדת, שיבוש ביו-אנרגיה תאית ו34,35,36 חילוף חומרים. כך, התאוששות מהרס כזה נראה באופן אינטואיטיבי סבירה.
בניגוד למקורי מצפהations, תאים יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים אפילו בשלב מאוחר. על ידי ברציפות ניטור הגורל למות תאים בתרבית, צפינו הפיכות של אפופטוזיס בשלב מאוחר בטווח של תאים ראשוניים ושורות תאים 12,13. הסרת גירוי המוות אפשרה התאוששות מהתכונות הגלויות של אפופטוזיס, כגון פיצול המיטוכונדריה, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, blebbing קרום פלזמה, חשיפה של phosphatidylserine פני תא, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום, הפעלת caspase, פיצול גרעיני, התכווצות תא, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. תצפיות אלה מעלות שאלות לא פתורות לגבי פונקציות, השלכות, והמנגנונים של Anastasis. כדי לענות על שאלות אלה, תנאי הוא לזהות באופן אמין תאים שעברו Anastasis. כאן אנו מתארים שיטות מיקרוסקופיה חיות וbiosensor caspase לגילוי תאים שהתהפכו אפופטוזיס שלב מאוחר וה בעברen שרד.
Anastasis מתייחס לתופעה שבה תאים שהופעלו מסלול המוות של תאים לאחר מכן להפוך את תהליך הגסיסה ולשרוד. הנה, יש לנו הראינו שהדמית תא חי יכולה לשמש כדי לאשר שאותם תאים בודדים למעשה יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים בשלב מאוחר, ולאחר מכן להמשיך ולשרוד ולהתרבות. הפר?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכומר ד"ר ראלף Bohlmann וכומר ד"ר ג'יימס Voelz למציעים את המילה "Anastasis" כדי לתאר את ההיפוך של אפופטוזיס; דאגלס ר 'ירוק לתאים הלה ביציבות להביע ציטוכרום C -GFP; Charles M. רודין ואריק א גרדנר לH446 תאים; הת'ר כבש לסיוע בציור קריקטורה בווידאו; איי הואי Yeo לדיון חשוב של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי אדוארד Youde זיכרון מלגת סר (HLT), מלגת ד"ר וולטר Szeto הזיכרון (HLT), מענק פולברייט 007-2,009 (HLT), מלגת מדעי חיים קרן המחקר (HLT), NIH מעניק NS037402 (JMH) וNS083373 (JMH), וועדת מענקי אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF). הו Lam טאנג הוא קרן עמית Shurl וקיי קורצ'י של מדעי החיים קרן המחקר.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | / | |
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |