Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) запись, при посредничестве тримерных вирусных гликопротеинами оболочки (ENV) является первым шагом инфекционного цикла. Будучи единственным подвергается вирусный антиген, представленный на поверхности вирионов, окр тример вызывает нейтрализации и nonneutralizing антитела. Как таковая, она представляет собой интересный кандидат на дизайн вакцина иммуногена. Тем не менее, испытания вакцинации с Env в растворимых или рекомбинантных форм были получены ответы лишь с минимальным эффективности против самых первичной ВИЧ-1 изолятов 1-3. Тем не менее, частичное эффективность наблюдается в возобновление интереса к ВИЧ-1 Env качестве кандидата иммуногена испытание вакцины RV144 4. Это было подтверждено результатами недавнего исследования, описывающего, что вакцин вызвали анти-Env антитела были достаточно для создания определенную степень защиты от SIV и ВИЧ бросает вызов 5.
После синтезированного в эндоплазматической сети, в glycoprote Envв предшественника, gp160, подвергается различным пост-трансляционных модификаций, которые имеют решающее значение для способности к топливу вирусную процесс сварки. Конверты предшественник должен сложить правильно и юрист тримеров перед расщепляется на его экстра-цитоплазматических gp120 и трансмембранный gp41 субъединиц 6-10, с нековалентных взаимодействий, поддерживая связь gp120-gp41. Инфицированная клетка техника также несет ответственность за сильно гликозилирующих Env, включающий около 50% от общей массы 11,12. В результате сложная структура позволяет окружающая среда, чтобы быть конформационно гибкой 13,14, обеспечивая при этом метастабильность, что, как полагают, позволит Конверты для адаптации и скрыть определенные высоко иммуногенные эпитопы, которые иначе могут быть доступны 15-19, подчеркнув важность, чтобы лучше понять различные конформации отбираются посредством родного Env тримера.
На сегодняшний день, несколько методов были разработаны и успешно используются для изучения Env конформационную глфланцев. Тем не менее, они различаются по их ограничений, которые часто ограничиваются конкретным условиям окр. Например, поверхностный плазмонный резонанс или иммунопреципитации с использованием конформационных специфических моноклональных антител (моноклональные антитела), опираются либо на мономерных растворимых или растворенных молекул Env, которые, как известно, иммуногенетически отличается от их тримерных форм 20,21. Недавние исследования также показывают, что расщепление влияет Env конформации в результате в экспозиции эпитопов в основном, признанных nonneutralizing антитела 14,22,23.
Здесь мы подробно описать метод, который позволяет для быстрого и легкого определения конформации клеточно-выразил Env тримеров 18,24-26. После кратковременной трансфекции в Env в линии клеток человека адгезивного связывания ENV-специфических антител обнаруживается с помощью простой реакции хемилюминесценции. Этот метод также может быть использован для описания конформационной предпочтение конформации-висимостьдент антитела. Таким образом, этот препарат обеспечивает надежную и очень гибкий метод обнаружения.
Этот анализ оптимизирован для обнаружения взаимодействие конкретных моноклональных антител ВИЧ-1 тримерного Env экспрессируется на поверхности клетки. После того, как протокол был создан, он может быть использован в среде с высокой производительностью с низким общим материальных затр…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р Джеймс Робинсон за его щедрый дар A32, 17b, 48d, и C11 МКА. ПГТ 121 был получен посредством Программы NIH СПИДа реагента, Отдел СПИДа, NIAID, NIH (Cat # 12343). Эта работа была поддержана Канада фонда инновационного лидера Программа # 29866, на CIHR операционной # 257792, по FRQS создании Young Scientist предоставить # 24639 к AF и по CRCHUM континуума гранта, а также с помощью CIHR катализатора гранта # 126630 на АФ и MR. AF является получателем FRSQ Chercheur Boursier юниоров 1 стипендий # 24639. М.В. поддержали CIHR Диссертационные исследования Award # 291485.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |