Summary

El ensayo de formación de colonias en agar blando

Published: October 27, 2014
doi:

Summary

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Abstract

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introduction

El ensayo de formación de colonias en agar blando es una técnica ampliamente utilizada para evaluar la transformación celular in vitro. Históricamente, se utilizó otro ensayo, el ensayo clonogénico, descrito por Puck et al. En 1956 para evaluar la capacidad de las células para formar colonias 1. En esta técnica, las células se dispersaron en una placa de cultivo y se cultivaron en la presencia de células alimentadoras '' o medio acondicionado para proporcionar factores de crecimiento necesarios. La limitación de esta técnica es que sólo se proporciona información con respecto a la formación de colonias. Las células normales se impide el crecimiento independiente de anclaje, debido a un tipo particular de muerte apoptótica, denominado anoikis 2. Sin embargo, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse sin unirse a un sustrato. Para sacar provecho de este concepto, los investigadores desarrollaron el ensayo de formación de colonias en agar blando. El ensayo de formación de colonias en agar blando desde entonces ha sido modificada, en años más recientes, para abordar specific necesidades. Una variación consiste en la incorporación de colorante fluorométrico para permitir de alto rendimiento recuento de colonias. Otra variación implica el uso de solución especializada agar para permitir la recuperación de células viables después de la formación de colonias cuando se necesitan muestras de proteínas o de ADN.

En el ensayo de formación de colonias en agar blando tradicional, las células se cultivan en una capa de agar blando mezclado con medio de cultivo celular que descansa sobre otra capa de agar blando, también mezclado con medio de cultivo celular, pero que contiene una mayor concentración de agar. Esto evita que las células se adhieran a la placa de cultivo, sin embargo, permite que las células transformadas para formar colonias visibles. El fundamento de esta técnica es que las células normales dependen de contacto célula a la matriz extracelular para ser capaz de crecer y dividirse. Por el contrario, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse independientemente de su entorno. Por lo tanto, las células capaces de formar colonias de una manera independiente de anclaje fueron considered a transformar y cancerígeno. El objetivo general de este método es medir esta capacidad en las células de una manera semi-cuantitativa y rigurosa.

La vía de señalización Wnt es esencial en la embriogénesis y, a menudo reguladas des en la tumorigénesis 3-6. Hay múltiples vías asociadas con la señalización de Wnt. La vía canónica implica la señalización y la regulación de la transcripción de genes Wnt aguas abajo a través de sus efectos sobre el coactivador transcripcional de beta-catenina. Wnts también la señal a través de varias vías no canónicos, por ejemplo, la vía de la polaridad celular planar, que regula los elementos involucrados en la estructura del citoesqueleto 7, y de la vía Wnt-calcio, que regula la liberación de calcio desde el retículo endoplásmico 8. Ligandos Wnt ejercen su actividad a través de unirse a receptores Frizzled. Aunque varios Wnt han demostrado ser upregulated en el cáncer de pulmón, Wnt7a ha demostrado ser regulada en el no-Smalcáncer de pulmón l de células a través de la metilación del promotor 9. Wnt7a une Fzd9 y actúa como un supresor de tumor a través de una vía no canónica. Restauración de Wnt-7a y Fzd-9 inhibe el crecimiento de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células 10. Los efectos de la Wnt7a / Fzd9 están mediadas a través de la activación de ERK-5, que a su vez, activa los receptores γ proliferador de peroxisoma activados (PPAR) 11,12. Aquí, mostramos que la sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 se traduce en la supresión del crecimiento independiente de anclaje de una línea celular de carcinoma de pulmón murino. CMT167 células murinas se derivaron de un carcinoma de pulmón en ratones C57BL / LCRF 13 y fueron transfectadas establemente con Wnt7a y Fzd9. La sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 fueron confirmados por PCR cuantitativa (Q-PCR) y la funcionalidad de Wnt7a y Fzd9 sobreexpresión fue confirmada a través de la activación de aguas abajo de PPAR.

Protocol

1. Preparación de Materiales y Reactivos Etiquetar cada pocillo de un cultivo de tejido tratado placa de 6 pocillos adecuada para cada línea celular o condición objeto de la investigación. Preparar medio de cultivo celular 2x disolviendo 1 g de medio en polvo y 0,2 g de bicarbonato de sodio en agua desionizada hasta un volumen final de 50 ml. Pasar este medio a través de un filtro de 0,2 micras para esterilizar. Añadir componentes adicionales necesarios para el cultivo norm…

Representative Results

La expresión de Wnt7a y Fzd9 en CMT167 células es eficaz en la supresión de tumores, como se ilustra por nuestro ensayo de formación de colonias en agar blando. Preliminarmente, se utilizó Q-PCR para demostrar que Wnt7a y Fzd9 ARNm se expresan en niveles bajos en CMT167 células. CMT167 células mostraron bajos niveles de endógeno Wnt7a y Fzd9 cuando se compara con MLE-12 células, un murino línea de células epiteliales de pulmón transformada con SV40 (Figura 1). A continuación, las células t…

Discussion

En confirmación vitro de la función supresora de tumor de las proteínas de señalización es difícil. Uno de los ensayos más rigurosos disponibles para investigar esta propiedad es el ensayo de formación de colonias en agar blando. Aquí, hemos ilustrado el ensayo de formación de colonias en agar suave utilizando una línea celular de carcinoma de pulmón murino de forma estable y que sobreexpresan Wnt7a Fzd9 comparación con su padres línea celular CMT167.

Hay vari…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cancer Cell Line of Interest Sigma-Aldrich 10032302 CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium Gibco 31800-089 Used to prepare 2X cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium Cellgro 10-040-CV Referred to as 1X cell culture medium.
Fetal Bovine Serum HyClone SH30910.03 Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin CellGro 30-002-Cl Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar BD Biosciences 214230 Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar.
Sodium Bicarbonate Fisher BP-328-1 Used in 2X cell culture medium.
Trypsin Cellgro 25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters Fisher 09-761-126 Used to sterile filter 2X medium.
Lipofectamine Reagent Invitrogen 18324-020 Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 degree C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager Bio-Rad Used to take pictures of colonies.  
Quantity One Software Bio-Rad Used to count cell colonies.
15mL Conical Tubes
50mL Conical Tubes
250mL Erlenmeyer Flasks
Microwave
5mL Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket

References

  1. Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
  2. Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
  3. Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
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Cite This Article
Borowicz, S., Van Scoyk, M., Avasarala, S., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Bikkavilli, R. K., Winn, R. A. The Soft Agar Colony Formation Assay. J. Vis. Exp. (92), e51998, doi:10.3791/51998 (2014).

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