El ensayo de formación de colonias en agar blando
Summary
The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.
Abstract
Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.
Introduction
El ensayo de formación de colonias en agar blando es una técnica ampliamente utilizada para evaluar la transformación celular in vitro. Históricamente, se utilizó otro ensayo, el ensayo clonogénico, descrito por Puck et al. En 1956 para evaluar la capacidad de las células para formar colonias 1. En esta técnica, las células se dispersaron en una placa de cultivo y se cultivaron en la presencia de células alimentadoras '' o medio acondicionado para proporcionar factores de crecimiento necesarios. La limitación de esta técnica es que sólo se proporciona información con respecto a la formación de colonias. Las células normales se impide el crecimiento independiente de anclaje, debido a un tipo particular de muerte apoptótica, denominado anoikis 2. Sin embargo, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse sin unirse a un sustrato. Para sacar provecho de este concepto, los investigadores desarrollaron el ensayo de formación de colonias en agar blando. El ensayo de formación de colonias en agar blando desde entonces ha sido modificada, en años más recientes, para abordar specific necesidades. Una variación consiste en la incorporación de colorante fluorométrico para permitir de alto rendimiento recuento de colonias. Otra variación implica el uso de solución especializada agar para permitir la recuperación de células viables después de la formación de colonias cuando se necesitan muestras de proteínas o de ADN.
En el ensayo de formación de colonias en agar blando tradicional, las células se cultivan en una capa de agar blando mezclado con medio de cultivo celular que descansa sobre otra capa de agar blando, también mezclado con medio de cultivo celular, pero que contiene una mayor concentración de agar. Esto evita que las células se adhieran a la placa de cultivo, sin embargo, permite que las células transformadas para formar colonias visibles. El fundamento de esta técnica es que las células normales dependen de contacto célula a la matriz extracelular para ser capaz de crecer y dividirse. Por el contrario, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse independientemente de su entorno. Por lo tanto, las células capaces de formar colonias de una manera independiente de anclaje fueron considered a transformar y cancerígeno. El objetivo general de este método es medir esta capacidad en las células de una manera semi-cuantitativa y rigurosa.
La vía de señalización Wnt es esencial en la embriogénesis y, a menudo reguladas des en la tumorigénesis 3-6. Hay múltiples vías asociadas con la señalización de Wnt. La vía canónica implica la señalización y la regulación de la transcripción de genes Wnt aguas abajo a través de sus efectos sobre el coactivador transcripcional de beta-catenina. Wnts también la señal a través de varias vías no canónicos, por ejemplo, la vía de la polaridad celular planar, que regula los elementos involucrados en la estructura del citoesqueleto 7, y de la vía Wnt-calcio, que regula la liberación de calcio desde el retículo endoplásmico 8. Ligandos Wnt ejercen su actividad a través de unirse a receptores Frizzled. Aunque varios Wnt han demostrado ser upregulated en el cáncer de pulmón, Wnt7a ha demostrado ser regulada en el no-Smalcáncer de pulmón l de células a través de la metilación del promotor 9. Wnt7a une Fzd9 y actúa como un supresor de tumor a través de una vía no canónica. Restauración de Wnt-7a y Fzd-9 inhibe el crecimiento de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células 10. Los efectos de la Wnt7a / Fzd9 están mediadas a través de la activación de ERK-5, que a su vez, activa los receptores γ proliferador de peroxisoma activados (PPAR) 11,12. Aquí, mostramos que la sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 se traduce en la supresión del crecimiento independiente de anclaje de una línea celular de carcinoma de pulmón murino. CMT167 células murinas se derivaron de un carcinoma de pulmón en ratones C57BL / LCRF 13 y fueron transfectadas establemente con Wnt7a y Fzd9. La sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 fueron confirmados por PCR cuantitativa (Q-PCR) y la funcionalidad de Wnt7a y Fzd9 sobreexpresión fue confirmada a través de la activación de aguas abajo de PPAR.
Protocol
Representative Results
Discussion
En confirmación vitro de la función supresora de tumor de las proteínas de señalización es difícil. Uno de los ensayos más rigurosos disponibles para investigar esta propiedad es el ensayo de formación de colonias en agar blando. Aquí, hemos ilustrado el ensayo de formación de colonias en agar suave utilizando una línea celular de carcinoma de pulmón murino de forma estable y que sobreexpresan Wnt7a Fzd9 comparación con su padres línea celular CMT167.
Hay vari…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2X cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1X cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2X cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2X medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 degree C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15mL Conical Tubes | |||
| 50mL Conical Tubes | |||
| 250mL Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5mL Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
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