The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.
Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.
Den mjukagar-kolonibildningsanalys är en teknik som används i stor utsträckning för att utvärdera celltransformation in vitro. Historiskt var en annan analys, den klonogena analysen, beskriven av Puck et al., I 1956 användes för att utvärdera förmågan hos celler att bilda kolonier 1. I denna teknik cellerna utspridda på en odlingsplatta och odlades i närvaro av "feeder" celler eller konditionerat medium för att ge nödvändiga tillväxtfaktorer. Begränsningen av denna teknik var att det bara lämnade uppgifter om kolonibildning. Normala celler hindras från förankringsoberoende tillväxt, på grund av en viss typ av apoptotisk död, kallad anoikis 2. Emellertid transformerade cellerna har förmåga att växa och dela sig utan att binda till ett substrat. För att dra nytta av detta koncept, forskare utvecklat den mjuka agar kolonibildningsanalys. Den mjuka agar kolonibildningsanalys har sedan ändrats, på senare år, för att ta itu med specific behov. En variant innebär införlivande av fluorometrisk färgämne för att möjliggöra hög genomströmning koloniräkning. En annan variation innefattar användning av specialiserad agarlösning för att möjliggöra hämtning av viabla celler efter kolonibildning när protein- eller DNA-prover behövs.
I den traditionella mjukagar-kolonibildningsanalys, odlas celler i ett skikt av mjuk agar blandades med cellodlingsmedium som vilar på ett annat skikt av mjuk agar, blandades också med cellodlingsmedium, men innehållande en högre koncentration av agar. Detta förhindrar celler från att vidhäfta till odlingsplattan, men ändå tillåter transformerade celler för bildning av synliga kolonier. Den logiska grunden bakom denna teknik är att normala celler är beroende av cell till extracellulär matris kontakt för att kunna växa och dela sig. Omvänt transformerade cellerna har förmåga att växa och dela sig, oberoende av den omgivande miljön. Därför celler som kan bilda kolonier på ett förankringsoberoende sätt var considered att omvandlas och cancerframkallande. Det övergripande målet med denna metod är att mäta denna förmåga i celler i en semi-kvantitativ och stringent sätt.
Wnt signalväg är kritisk i embryogenes och ofta avregleras i tumörbildning 3-6. Det finns flera vägar i samband med Wnt signalering. Den kanoniska vägen involverar Wnt signalering och reglering av nedströms gentranskription genom dess effekter på den transkription samaktivator beta-catenin. Wnts signalerar även via flera icke-kanoniska vägar, till exempel, den plana cellpolaritet reaktionsvägen, vilken reglerar element som ingår i cytoskelettala struktur 7, och det Wnt-kalcium-vägen, som reglerar frisättningen av kalcium från det endoplasmatiska nätverket 8. Wnt ligander utövar sin aktivitet genom att binda Frizzled receptorer. Även om flera Wnts har visat sig vara uppreglerad vid lungcancer har Wnt7a visats nedregleras i icke-small cell lung cancer genom promotor metylering 9. Wnt7a binder Fzd9 och fungerar som en tumörsuppressor genom en icke-kanoniska vägen. Restaurering av Wnt-7a och FZD-9 hämmar tillväxten av icke-småcellig lungcancer celler 10. Effekterna av Wnt7a / Fzd9 medieras genom aktivering av ERK-5, som i sin tur aktiverar peroxisom proliferator-aktiverad receptor-γ (PPARy) 11,12. Här visar vi att överuttryck av Wnt7a och Fzd9 resulterar i suppression av förankringsoberoende tillväxt av en mus lungcancer cellinje. Murina CMT167 celler härstammar från en lungcancer i C57BL / lcrf möss 13 och var stabilt med Wnt7A och Fzd9. Överuttryck av Wnt7A och Fzd9 bekräftades genom kvantitativ-PCR (Q-PCR) och funktionalitet Wnt7A och Fzd9 uttryck bekräftades genom nedströms aktivering av PPARy.
In vitro bekräftelse av tumör undertryckande funktion signalproteiner är svårt. En av de mest rigorösa analyser tillgängliga för att undersöka denna egenskap är den mjuka agar kolonibildningsanalys. Här har vi illustrerat mjukagar-kolonibildningsanalys med användning av ett murint lungkarcinom-cellinje som stabilt överuttrycker Wnt7a och Fzd9 jämfört med dess föräldra CMT167 cellinje.
Det finns flera viktiga saker att tänka på när det gäller mjuk agar analysen. D…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2X cell culture medium. |
Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1X cell culture medium. |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar. |
Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2X cell culture medium. |
Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2X medium. |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
37 degree C/5% CO2 Incubator | |||
Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
15mL Conical Tubes | |||
50mL Conical Tubes | |||
250mL Erlenmeyer Flasks | |||
Microwave | |||
5mL Serological Pipettes | |||
Pipette Aid | |||
Micropipette | |||
Hemacytometer w/ cover slip | |||
Pipette Tips | |||
Inverted Light Microscope | |||
Centrifuge | |||
Heat-Resistant Gloves | |||
Saran Wrap | |||
Ice Bucket |