Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Published: November 2, 2015 doi: 10.3791/52002
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Abstract

De kegel fotoreceptor-verrijkte culturen afkomstig van embryonale kuiken netvlies hebben een onmisbaar instrument voor onderzoekers over de hele wereld het bestuderen van de biologie van retinale neuronen, in het bijzonder fotoreceptoren geworden. De toepassingen van dit systeem verder fundamenteel onderzoek, omdat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan high throughput technieken voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Echter, genetische manipulatie van retinale fotoreceptoren in deze culturen heeft bewezen zeer uitdagend, stellen een belangrijke beperking van de bruikbaarheid van het systeem. We hebben onlangs ontwikkeld en gevalideerd ex ovo plasmide electroporatietechniek dat de snelheid van transfectie van retinale cellen in deze kweken stijgt met vijfvoudige vergelijking met andere momenteel beschikbare protocollen 1. Bij deze methode embryonale kuiken ogen enucleatie in stap 27, de RPE verwijderd en het netvlies beker wordt geplaatst in een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd gebruik gemakkelijk geconstrueerd custom-maakte elektroden. De netvliezen worden vervolgens gedissocieerd en gekweekt met behulp van standaardprocedures. Deze techniek kan worden toegepast op overexpressie studies en de neerwaartse regulatie van genexpressie, bijvoorbeeld via het gebruik van plasmide-aangedreven RNAi technologie, vaak bereiken transgenexpressie in 25% van de fotoreceptor bevolking. De video-indeling van de huidige publicatie zal deze technologie gemakkelijk toegankelijk zijn voor onderzoekers in het veld te maken, waardoor de studie van gen-functie in de primaire retinale culturen. We hebben ook uitgebreide uitleg van de kritische stappen van deze procedure voor een succesvol resultaat en reproduceerbaarheid.

Introduction

Gedissocieerde celkweken uit embryonale kuiken netvlies zijn op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten van fotoreceptorcellen celbiologie, inclusief hun overleving 2-9, differentiatie 10-12, neuriet uitgroei 13 en meer bestuderen. De voordelen van dit systeem, in de jaren 1980 ontwikkeld door Ruben Adler en medewerkers en geperfectioneerd door zijn andere groepen 14-20, bevinden zich in de intrinsieke kenmerken van het kuiken als diermodel 21. De grote omvang van het kuiken oog, zelfs in embryonale stadia, levert grote hoeveelheden materiaal te kweken. Bovendien, wanneer cultures worden uitgevoerd met embryonale dag (ED) 5 - 6 retina, 55 - 80% van de stamcellen differentiëren fotoreceptoren 14,15,18,22,23, en omdat ongeveer 86% van de fotoreceptoren in dit dier kegels 24, deze culturen zijn bijzonder geschikt voor studies gericht op dit celtype.

We hebben onlangs developed en het kenmerk van een eenvoudige techniek die zorgt voor hoge-efficiëntie plasmide transfectie van de cellen in deze kweken, is de bruikbaarheid van dit systeem verbreden door het faciliteren genetische studies missexpression 1. De ontwikkeling van deze techniek kwam voort uit een leegte in de wetenschappelijke literatuur methoden die een aanvaardbaar niveau van transfectie zou bieden om voor de studie van gen in een cel autonoom. Dit is voor een deel omdat de primaire neuronale culturen zijn notoir moeilijk te transfecteren 25,26. Enkele van de meest gebruikte technieken die eerder voor dit doel opgenomen chemische transfectie werkwijzen zoals lipofectie of calcium-fosfaat-gemedieerde transfectie, die leiden tot efficiëntie in de orde van 3-5% en kan aanzienlijke toxiciteit 27-32 uitoefenen. Hoewel het gebruik van plasmiden met een enzymatische reporter systeem het probleem van slechte transfectie-efficiëntie kan omzeilen door het amplificeren van het signaal, ze nietdiscrimineren celspecifieke effecten en de resultaten zijn gebaseerd op een klein celpopulatie die niet representatief zijn voor het geheel kan zijn. Een andere veel gebruikte methode in de chick, RCAS virusinfectie, is alleen van toepassing op delende cellen en dus niet geschikt voor deze primaire retinale kweeksysteem 33.

In het huidige protocol zijn embryonale kuiken ogen enucleatie in stadium 27 (ED 5), het retinale pigmentepitheel (RPE) is verwijderd en de retinale beker wordt geplaatst in een elektroporatie kamer gevuld met een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd met behulp maat elektroden, gevolgd door retinale dissociatie en cultuur met standaardtechnieken 21. Na optimalisatie procedure we in staat om consistent bereiken transfectie-efficiëntie in de orde van 22% van het totale aantal cellen in kweek en 25% binnen de fotoreceptor populatie alleen zijn geweest zonder de overleving en differentiatie kenmerken van de1 kweken. Hier geven we een gedetailleerd protocol waarin alle belangrijke stappen van de procedure teneinde het succes en de reproduceerbaarheid van deze techniek waarborgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures in dit werk beschreven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen zoals aanbevolen door de Animal Care en gebruik Comite aan de Johns Hopkins University.

1. Ahead of Time: Voorbereiding van instrumenten, reagentia en gerechten

  1. Bereiding van Eieren: Incubate Witte Leghorn bevruchte kippeneieren bij 37,5 ° C en 60% relatieve vochtigheid gedurende 5 dagen in een broedmachine.
    OPMERKING: Een incubator met rockende capaciteit kan nuttig zijn voor het standaardiseren en synchroniseren van de embryonale ontwikkeling, maar rockende is niet strikt noodzakelijk is voor de uitkomst van dit protocol.
  2. Plasmide Bereiding:
    1. Ontwerp plasmide construct voor genoverexpressie of neerwaartse regulatie (bijvoorbeeld door middel van RNAi technologie 1,34) indien nodig. Neem een ​​reportergen (zoals EGFP, RFP of LacZ) in het construct waar mogelijk.
      OPMERKING: Sommige algemeen gebruikte promoters zoals CMV, kunnen raken na verloop van tijd het zwijgen opgelegd. De CAG PromotER (kip beta-actine-promotor met CMV-versterker) is een zeer goed alternatief, een efficiënte lange termijn expressie van het gen van belang 35-37.
    2. Bereid een plasmide oplossing bij een concentratie van 1,5 ug / ul in steriele PBS. OPTIE: Bereid plasmide oplossing van tevoren en op te slaan bevroren totdat klaar voor gebruik.
      OPMERKING: Hogere plasmide concentraties niet leiden tot een aanzienlijk efficiënter, terwijl door minder plasmide concentraties lager de transfectie-efficiëntie 1.
  3. Elektroden:
    1. Voor de anode gebruik een dikke gouden tip elektrode (zie Tabel van specifieke materialen / Equipment). Veeg schoon met 70% ethanol.
      OPMERKING: Isolatie van de gouden tip elektrode, waardoor ongeveer 0,5 mm blootgesteld, is het raadzaam om lekkage van de elektrische stroom te minimaliseren. Informatie voor isolerend materiaal kan worden gevonden in tabel van specifieke materialen.
    2. Maak een kathode uit een 2,5 mm vierkante bos gloeidraad, 4,5 mm breed (normaal in micropipet trekkers). Met behulp van een tang, verwijder de doos plein en recht filament in een lange strook. Vervolgens onder dissectie microscoop en met een liniaal als leidraad, buig het filament in een vierkante U-vorm 3 mm aan de basis en 2 mm aan één zijde met de andere zijde de resterende lengte van de draad (Figuur 1 , C - D). Met behulp van een tang, dompel de elektroden in 96% ethanol en vlam te steriliseren. Bevestig dan een elektrische leiding met een kleine alligator clip op de langere arm van de elektrode.
  4. Elektroporatie kamer Setup:
    1. Bereid de elektroporatie kamer door het snijden van de deksel van een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en aanbrenging, platte kant naar beneden, een 100 mm petrischaal met tape (figuur 1E).
      OPMERKING: Andere container in de vorm van een putje van dezelfde grootte zou werken; Maar een microcentrifugebuis deksel is gemakkelijk toegankelijk en autoclaveerbaar. De bronmoet groot genoeg zijn om een ​​kuiken oog en kathode-elektrode te huisvesten, maar niet zo groot zijn dat resulteert in een verspilling van plasmide oplossing.

2. Ex ovo Elektroporatie Procedure

  1. Voorbereiding van instrumenten:
    1. Steriliseren micro-dissectie-instrumenten (2 paar grote gebogen Moloney tang voor het openen van eierschalen en scheppen uit embryo's, 2 paar fine-tip gebogen Dumont pincet voor het verwijderen van RPE, een paar van Bonn getande tang voor het verwijderen van de lens en het glasvocht) door dompelen de tips in 96% ethanol en vlammen. Schoon dissectie scope behulp doekjes gedompeld in 70% ethanol. Warm een ​​fles van steriele Calcium-Magnesium-vrije Hank's gebalanceerde zoutoplossing (CMF-HBSS) in een 37 ° C waterbad. Vul 100 mm steriele petrischaaltjes tot 3/4 vol met warme CMF-HBSS.
    2. Plaats elektroporatie kamer onder andere schone dissectie microscoop en vullen met 120 ul van het plasmide oplossing. Sluit elektroden op elektroporatie apparaat, waardoorervoor maat elektrode is verbonden met de negatieve pool en gouden tip elektrode naar de positieve pool.
  2. Embryo Collection:
    1. Reinig de eieren door vegen schelpen met doekjes bevochtigd in 70% ethanol. Onderhouden steriele procedure in de rest van het protocol om te voorkomen dat het dragen van verontreiniging in de culturen. Met behulp van grote gebogen Moloney pincet een gat in de eischaal zorgvuldig te openen door zachtjes tikken op de afgeronde top van een ei (meer dan de luchtkamer) en dan grijpen en uit te trekken shell stukken.
    2. Met een andere pincet verwijder membranen en het verzamelen van embryo scheppen door het uit het ei (zorg dat u de embryo beschadigen). Plaats het in een schotel met CMF-HBSS.
      OPMERKING: als nodig Verzamel zoveel embryo's om het gewenste aantal retinale cups voor elektroporatie verkrijgen zoals gespecificeerd in 2.4.4
    3. Kritische stap: Stadium de embryo's volgens de Hamburger en Hamilton 38.
      OPMERKING: Om een ​​optimale efficiëntie embryo's te verkrijgenmoet in fase 27 (Figuur 2A).
    4. Euthanaseren de embryo's door onthoofding met Moloney tang.
  3. Het verkrijgen van het netvlies Cups:
    1. Met behulp van fijne Dumont pincet voorzichtig ophelderen van de ogen en over te dragen aan een nieuwe CMF-HBSS gerecht.
    2. Vanaf het achterste gedeelte van elk oog, dicht bij de optische zenuw kop, en met twee fijne Dumont pincet, voeren één uiteinde van elke pincet tussen de neurale retina en RPE en zorgvuldig ontleden de RPE waarbij voorzichtig de neurale niet beschadigen retina (Figuur 2B).
      Opmerking: Het ontbreken van Ca2 + en Mg2 + in de oplossing helpt de RPE losmaken van de neurale retina gemakkelijker.
  4. Elektroporatie:
    1. Parameters instellen electroporator tot 5 vierkante pulsen leveren van 15 volt, 50 ms duur, en 950 msec interval. Place 'U' vormige negatieve elektrode in elektroporatie kamer (microcentrifuge deksel filled met 120 pl plasmide bevattende oplossing).
    2. Gebruik gebogen Dumont pincet overdragen netvlies beker aan de elektroporatie kamer (door scheppen, niet persen) en plaats deze in de U-vormige elektrode, het achterste deel van de retina naar de bodem van de elektrode en de lens naar boven ( Figuur 2D).
    3. Plaats de anode, zodat deze tegen de voorste deel van het oog, naast de lens en met de elektroporator het voetpedaal leveren van de elektrische pulsen.
    4. Overdracht geëlektroporeerd netvlies cup een nieuwe petrischaal met CMF-HBSS en herhaal elektroporatieprocedure met elk van de overblijvende retinale cups.
      OPMERKING: tot 6 retinale kopjes worden geëlektroporeerd met hetzelfde plasmide oplossing zonder een significante afname van transfectie efficiency.
    5. Verwijder de lens en het glasachtig lichaam van elk geëlektroporeerd netvlies beker door aangrijpend ze met Bonn getande pincet en zachtjes te trekken door middel van tHij pupilopening terwijl het oog vast met de achterzijde van de gekromde Dumont pincet.
    6. Overgaan tot de dissociatie en de cultuur van de geëlektroporeerd netvlies cellen volgens standaardprocedures.
      LET OP: Voor een gedetailleerd protocol over de dissociatie en cultuur van chick retinale cellen verwijzen naar Vergara en Canto-Soler 2012, Aanvullende bestandsinformatie 4 21 In dit protocol worden de cellen gezaaid met lage dichtheid op polyornithine gecoate 6-well platen of 35. -mm gerechten (6 x 10 5 cellen / 35 mm diameter en of schaal). Het gebruikte medium is medium 199 met penicilline / glutamine, 10% foetaal kalfsserum (FCS) en linolzuur-BSA bij 100 ug / ml. De kweken worden gehandhaafd in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO 2. Met behulp van deze procedure, 5 - kan 6 x 10 6 cellen meestal verkregen worden per elke fase 27 geëlektroporeerd oog.
      OPMERKING: Idealiter zou niet meer dan 3 uur voorbij tussen het embryo en mobiele plating, om een ​​goede overleving van de cel te garanderenen stress te minimaliseren. Een typische timing voor observatie en verdere analyse na 4 dagen in kweek, omdat op dat moment de cellen goede morfologische en moleculaire differentiatie bereikt hebben en overleving nog steeds hoog.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het plasmide transfectie in ontkernde chick netvlies bekers voor latere gedissocieerde celkweek. Transfectie wordt bereikt door elektroporatie met behulp van eenvoudig om aangepaste elektroden (figuren 1-2) te maken. De in dit protocol beschreven parameters zijn geoptimaliseerd om de transfectie efficiëntie die variëren tussen 20 en 27% (met een gemiddelde van 22%) (Figuur 3D) te verkrijgen. Merk op dat, om de bovengenoemde redenen, deze resultaten worden gekwantificeerd na 4 dagen in kweek. In dit verband transfectie-efficiëntie verwijst naar het percentage van cellen die het transgen in de totale celpopulatie expressie. Als alleen de fotogeleider wordt overwogen, transfectie-efficiëntie te verhogen tot gemiddeld 25% (Figuur 3D). Dit is een belangrijk kenmerk omdat deze soort kweken hoofdzakelijk gebruikt om fotoreceptoren bestuderen.

Celkweken die zijn electroporat ed behulp van deze techniek te onderscheiden van hun niet-geëlektroporeerd tegenhangers in hun morfologie onder DIC verlichting, celoverleving eigenschappen en de expressie van moleculaire markers zoals visinin (een veel gebruikte marker fotoreceptoren) en Pax6 1.

Figuur 1
Figuur 1. Het maken van de elektroden. (A - D) De kathode bestaat uit een vierkante doos filament (A), welke eerste wordt gestrekt (B) en vervolgens gebogen met een pincet in een vierkante U-vorm (C - D). De anode is een dikke gouden tip-elektrode (D); Let op de isolatie rond de anode-elektrode, waardoor er slechts 0,5 mm van de tip blootgesteld. (E) Elektroporatie setup. Inzet toont sterkere vergroting van de boxed gebied.pg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Voorbereiding van de Retina Cups voor Elektroporatie. (A) kippenembryo bij Hamburger en Hamilton embryonale fase 27. (B) De RPE wordt zorgvuldig verwijderd uit de verwijderde ogen met scherpe Dumont pincet. (C) Het netvlies beker aan de rechterkant is verstoken van RPE en klaar voor elektroporatie. (D ) De kathode-elektrode is gepositioneerd binnen een elektroporatie kamer gemaakt van een 1,5 ml microcentrifugebuis deksel gevuld met plasmide oplossing. Het netvlies beker wordt zorgvuldig overgebracht naar de kathode naar boven, en de anode-elektrode wordt geplaatst op de top, naast de lens. Klik hier om een grotere versie te bekijkenvan dit cijfer.

Figuur 3
Figuur 3. Efficiëntie van Transgene expressie in gekweekte cellen na elektroporatie (A - C). Retinale cups werden geëlektroporeerd met een GFP-expressieplasmide, gedissocieerd en gedurende 4 dagen. Fluorescentiemicroscopiegrafieken tonen DAPI gekleurde kernen (A) en GFP tot expressie retinale cellen (B). Anti-Visinin antilichaam kleuring werd uitgevoerd om fotoreceptorcellen identificeren (C). (D) grafiek transfectie-efficiëntie bereikt door ex ovo electroporatie, voorgesteld als het percentage GFP tot expressie brengende cellen in het totale celpopulatie (DAPI positief), of tussen de fotoreceptor bevolking in het bijzonder (Visinin positief). De resultaten stellen het gemiddelde ± SEM van 5 onafhankelijke experimenten. Schaal bar in (A - C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meest kritische stap voor het succes van dit protocol is het selecteren van de juiste fase van het embryo. In eerdere publicaties is een aantal embryonale stadia die voor deze culturen doorgaans bepaald door de tijd van incubatie of embryonale dag (ED); dus is het meestal aangenomen dat het gebruik van ED 5 tot ED 6 embryo's zullen gelijkwaardige resultaten opleveren. We hebben echter gevonden dat het podium 27 (ED 5), wordt transfectie-efficiëntie ongeveer 22% van de totale celpopulatie, zoals hierboven vermeld; Nog efficiëntie zal afnemen tot 16% bij gebruik van stadium 28 embryo (ED 5,5) en tot 12% in stadium 29 (ED 6) 1. Andere kritische stappen omvatten het handhaven van steriele omstandigheden tijdens het hele proces; het verwerven van de noodzakelijke handvaardigheid om beschadiging van het netvlies tijdens dissectie en elektroporatie; en het vermijden van lange hiaten van het winnen van het embryo naar de tijd van de cel plating.

Een andere belangrijke overweging om een ​​goede transfectie efficien zorgenties is de concentratie van het plasmide bevattende oplossing: de aanbevolen 1,5 ug / ul is de laagste concentratie die wij getest die niet resulteren in een afname van efficiëntie. Deze concentratie vertaalt zich in een grote hoeveelheid plasmide materiaal als men bedenkt dat de retinale cups baden in die oplossing. De kleinste en die geschikt voor het oog (zoals een microcentrifugebuis deksel) kan dit probleem minimaliseren. Bovendien kunnen meerdere ogen worden geëlektroporeerd met dezelfde oplossing; We hebben niet gezien een vermindering van de efficiëntie bij electroporating tot 6 retinale kopjes achtereenvolgens in hetzelfde plasmide-oplossing, en kan eventueel worden uitgevoerd maar kunnen we niet getuigen van het verschil in efficiëntie daarna.

Eerder gepubliceerde protocollen zijn typisch voorzien lage efficiëntie van genoverdracht voor dit type cultuur en daardoor vaak moesten vertrouwen op technieken die het product van de enzymatische reacties een cel l metenysate om de gevoeligheid te verhogen. Een dergelijke benadering heeft het nadeel dat geen grotere discriminatie celtype en van te vertrouwen op een gering aantal cellen verantwoordelijk voor de waargenomen resultaten, die niet altijd een afspiegeling is van het gedrag van de grotere cel populatie. Een andere manier om het probleem van lage efficiëntie te omzeilen is om gentransfectie presteren in vivo, voorafgaand aan oog enucleatie en cultuur. Dit is een haalbare benadering maar kan meestal worden toegepast op specifieke experimentele paradigma's, aangezien zowel plasmide elektroporatie en RCAS virusinfectie (gemeenschappelijk gentransductie vector in het kuiken) moeten gewoonlijk in eerdere ontwikkelingsstadia worden uitgevoerd, waardoor een tijdsverschil tussen transfectie en cultuur. Dit is een belangrijke overweging omdat in die tijdspanne de cellen worden blootgesteld aan de effecten van zowel de extracellulaire micro-omgeving en intracellulaire factoren heeft belangrijke implicaties bij de interpretatie van de experimental resultaten. In tegenstelling, de aanzienlijke toename genoverdrachtefficiëntie verkregen met de ex ovo electroporatie benadering maakt voor de studie van gen in een cel-intrinsieke wijze. Bovendien kan het voordeel van deze hoge transfectie verder worden verhoogd in combinatie met een geautomatiseerde high-throughput cell analyse 1.

Tijdens de beginfase van de ontwikkeling van deze techniek, onderhouden we geëlektroporeerd RPE-zonder eye cups in kweek gedurende 24 uur om de efficiëntie van elektroporatie bereikt met verschillende omstandigheden 1 evalueren. Hoewel we niet proberen kweken en gedurende langere tijden, onze ervaring leert dat het hierin beschreven protocol kan ook worden toegepast op studies vertrouwen op netvlies organotypische explantaten, mits geschikte langdurige explantatie kweekomstandigheden gebruikt.

Ten slotte zou het mogelijk zijn om de toepasbaarheid van het e uitbreidenis ex ovo elektroporatie benadering van andere dierlijke modellen. Bijvoorbeeld in onze ervaring transfectie van muis ogen op postnatale dag 1 of 4 met dit protocol leverde kwalitatief goede resultaten explantkweken, maar als los celkweken werden geprobeerd transfectie-efficiëntie was in de orde van 6%, vergelijkbaar met die van andere technieken. Aldus, kan dit een eenvoudig alternatief voor andere protocollen voor dit diermodel zijn, maar het zou moeten worden geoptimaliseerd voor het specifieke systeem of hoog rendement vereist. Opmerkelijk, zoals gezegd, embryonaal stadium ten tijde van elektroporatie is om de hoge efficiency uitkomst verkregen bij het kuiken, zodat deze parameter moet zorgvuldig worden overwogen bij de toepassing van de techniek met andere modellen.

Concluderend kan de ex ovo electroporatie techniek de toepasbaarheid van in vitro retinale systemen uit te breiden als krachtige tools aan te vullen in vivo studies, het aanbieden van nieuwe mogelijkheden voor het netvlies onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
  2. Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
  3. Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
  4. Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
  5. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
  6. Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
  7. Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
  8. Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
  9. Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
  10. Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
  11. Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
  12. Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
  13. Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
  14. Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
  15. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  16. Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
  17. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
  18. Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
  19. Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
  20. Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
  21. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
  22. Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
  23. Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
  24. Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
  25. Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
  26. Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
  27. Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
  28. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
  29. Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
  30. Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
  31. Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
  32. Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
  33. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
  34. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
  35. Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
  36. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  37. You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
  38. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).

Tags

Developmental Biology retina photoreceptor primaire celkweek elektroporatie plasmide transfectie kuiken
Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporatie Aanpak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vergara, M. N., Gutierrez, C.,… More

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter