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Developmental Biology

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Published: November 2, 2015 doi: 10.3791/52002
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Abstract

Die Kegelphotorezeptor-angereicherten Kulturen von embryonalen Hühnernetzhaut abgeleitet sind zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Forscher auf der ganzen Welt das Studium der Biologie der Netzhautneuronen, insbesondere Photorezeptoren. Die Anwendungen dieses Systems gehen über die Grundlagenforschung, da sie leicht zu Hochdurchsatztechnologien zur Wirkstoffentwicklung angepasst werden. Jedoch genetische Manipulation von retinalen Photorezeptoren in diesen Kulturen hat sich als sehr schwierig, sie eine erhebliche Einschränkung für die Nützlichkeit des Systems. Wir haben vor kurzem entwickelt und validiert eine ex ovo Plasmid Elektroporationstechnik die die Rate der Transfektion von Retinazellen in diesen Kulturen erhöht durch das Fünffache im Vergleich zu anderen gegenwärtig verfügbaren Protokolle 1. Bei diesem Verfahren embryonalen Hühneraugen an Stufe 27 ausgeschält, die RPE wird entfernt, und das Netzhautbecher wird in einem Plasmid-haltigen Lösung gegeben und elektroporiert Verwendung einfach aufgebaut Kundenhergestellten Elektroden. Die Netzhaut werden dann dissoziiert und kultiviert Verwendung von Standardverfahren. Diese Technik kann durch die Verwendung von Plasmid-driven RNAi-Technologie zu Expressionsstudien sowie zu der Herunterregulierung der Genexpression verwendet werden, zum Beispiel, allgemein erzielen die Transgen-Expression in 25% der Photorezeptorpopulation. Das Videoformat der vorliegenden Veröffentlichung wird diese Technologie leicht zugänglich für Forscher auf dem Gebiet zu machen, so dass die Untersuchung von Gen-Funktion in der primären Netzhautkulturen. Wir haben auch detaillierte Erläuterungen der kritischen Schritte dieses Verfahrens für ein erfolgreiches Ergebnis und Reproduzierbarkeit.

Introduction

Dissoziierten Zellkulturen von embryonalen Hühnernetzhaut wurden allgemein verwendet, um verschiedene Aspekte der Photorezeptor Zellbiologie, einschließlich deren Überleben 2-9, Differenzierung 10-12, Neuritenwachstum 13 und mehr zu studieren. Die Vorteile dieses Systems, in den 1980er Jahren von Ruben Adler und Mitarbeiter entwickelt und von seinem und anderen Gruppen 14-20, perfektioniert liegen in den intrinsischen Eigenschaften des Kükens als Tiermodell 21. Die Größe des Hühnerauge, auch bei embryonalen Stadien, bietet große Mengen an Material für Kulturen. Außerdem, wenn Kulturen mit embryonalen Tag (ED) durchgeführt 5 - 6 Retinae, 55 - 80% ihrer Vorläuferzellen zu differenzieren, wie Photorezeptoren, 14,15,18,22,23, und da etwa 86% der Photorezeptoren in diesem Tier sind Kegel 24 sind diese Kulturen besonders geeignet für die Studien, die sich auf dieser Zelltyp.

Wir haben vor kurzem developed und dadurch eine einfache Technik, die für hocheffiziente Plasmid Transfektion der Zellen in diesen Kulturen ermöglicht, wodurch die Erweiterung der Nützlichkeit dieses Systems durch Erleichterung genetische Studien missexpression 1. Die Entwicklung dieser Technik ergab sich aus einem Hohlraum in der wissenschaftlichen Literatur von Methoden, die ein akzeptables Niveau der Transfektion bereitstellen würde, um für die Untersuchung der Gen-Funktion in einer Zelle autonom zu ermöglichen. Dies ist zum Teil, weil primären neuronalen Kulturen sind notorisch schwer zu transfizieren 25,26. Einige der am häufigsten verwendeten Techniken, die zuvor für diesen Zweck zur Verfügung enthalten chemische Transfektionsverfahren wie Lipofektion oder Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, die in Wirkungsgrade in der Grßenordnung von 3-5% führen und kann beträchtliche Toxizität 27-32 auszuüben. Obwohl die Verwendung von Plasmiden mit einem enzymatischen Reporter-Systems kann das Problem der schlechten Transfektionseffizienz durch Verstärken des Signals zu umgehen, sie nichtdiskriminieren zellspezifische Wirkungen, und ihre Ergebnisse werden auf einer kleinen Zellpopulation, die nicht repräsentativ für die gesamte erweisen. Eine andere weit verbreitete Methode in der Küken, RCAS Virus-Infektion, ist nur auf proliferierende Zellen anwendbar und somit nicht für diese primäre Netzhautkultursystem 33 geeignet ist.

Im aktuellen Protokoll embryonalen Hühneraugen werden in Stadium 27 (ED & sub5;), der retinalen Pigmentepithel (RPE) wird entfernt, und das Netzhautbecher in einer Elektroporationsküvette Kammer mit einem Plasmid enthaltenden Lösung gefüllt war enukleiert und Elektroporation mit maßgeschneiderten Elektroden, gefolgt von retinalen Dissoziation und Kultur unter Verwendung von Standardtechniken 21. Nach der Optimierung dieses Verfahrens waren wir, ohne die Überlebensrate und Differenzierungsmerkmale der Lage zu Transfektionseffizienzen erzielen durchweg in der Größenordnung von 22% der Gesamtzahl der Zellen in der Kultur und 25% innerhalb der Photorezeptorpopulation AlleinKulturen 1. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll umreißt alle wichtigen Schritte dieses Verfahrens, um den Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieser Technik zu gewährleisten.

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Protocol

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren wurden nach den von der Animal Care und Verwenden Ausschuss empfahl der Johns Hopkins University Richtlinien durchgeführt.

1. Ahead of Time: Herstellung von Instrumenten, Reagenzien und Geschirr

  1. Herstellung der Eier: Inkubieren befruchteten White Leghorn Hühnereiern bei 37,5 ° C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit für 5 Tage in einem Brutkasten.
    HINWEIS: Ein Inkubator mit Schaukelkapazität kann hilfreich für die Standardisierung und die Synchronisierung der Embryonalentwicklung, aber Schaukel ist für den Ausgang dieses Protokoll unbedingt erforderlich.
  2. Plasmidpräparation:
    1. Design Plasmidkonstrukt zur Gen-Überexpression oder Herunterregulierung (zum Beispiel durch die Verwendung von RNAi-Technik 1,34) je nach Bedarf. Fügen Sie ein Reporter-Gen (wie EGFP, RFP oder LacZ) in dem Konstrukt, wann immer möglich.
      HINWEIS: Einige häufig verwendete Promotoren, wie CMV, kann nach der Zeit zum Schweigen gebracht zu werden. Die CAG promotER (Huhn-beta-Aktin-Promotor CMV-Enhancer) ist eine sehr gute Alternative, eine effiziente langfristige Expression des Gens von Interesse 35-37.
    2. Vorbereitung einer Plasmid-Lösung bei einer Konzentration von 1,5 ug / ul in sterilem PBS. OPTIONAL: Bereiten Plasmid-Lösung vor der Zeit und bewahren Sie sie eingefroren, bis gebrauchsfertig.
      HINWEIS: Höhere Plasmid-Konzentrationen nicht zu einer signifikanten Steigerung der Effizienz führen, wohingegen mit niedrigeren Plasmid-Konzentrationen senken die Transfektionseffizienz 1.
  3. Elektroden:
    1. Für die Anode Verwendung einer dicken Gold gekippt Elektrode (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung). Wischen Sie mit 70% Ethanol.
      HINWEIS: Isolierung des Gold gekippt Elektrode, so dass etwa 0,5 mm ausgesetzt sind, ist es ratsam, um ein Auslaufen des elektrischen Stroms zu minimieren. Informationen für Isoliermaterial kann in Tabelle spezifischer Materialien gefunden werden.
    2. Machen Sie eine Kathode aus einem 2,5 mm Quadrat box Filament, 4,5 mm breit (in der Regel in der Mikropipette Abzieher verwendet). Mit Hilfe einer Pinzette, lösen Sie die quadratische Box und strecken Filaments in einem langen Streifen. Klicken Sie dann unter Dissektionsmikroskop und mit einem Lineal als Führung, biegen Sie das Filament in eine quadratische U-Form 3 mm lang an der Basis und 2 mm hoch auf einer Seite, mit der anderen Seite die verbleibende Länge des Fadens (Abbildung 1 , C - D). Mit einer Pinzette, tauchen Sie die Elektrode in 96% Ethanol und Flamm zu sterilisieren. Bringen Sie dann eine elektrische Leitung mit einer kleinen Krokodilklemme mit dem längeren Arm der Elektrode.
  4. Elektroporationskammer Setup:
    1. Vorbereitung der Elektroporation Kammer durch Schneiden des Deckels einer sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Befestigen darauf flachen Seite nach unten auf eine 100 mm Petrischale mit Klebeband (1E).
      Hinweis: andere Behälter in Form eines gut ähnlicher Größe funktionieren würde; ist jedoch ein Mikrozentrifugenröhrchen Deckel leicht zugänglich und autoklavierbar. Der Brunnenmuss groß genug sein, um ein Küken Auge und Kathodenelektrode Haus, aber nicht so groß sein, daß sie zu einer Verschwendung von Plasmid-Lösung führen.

2. Ex ovo Elektroporation Ordnung

  1. Vorbereitung des Instruments:
    1. Sterilisieren Mikrodissektion Werkzeuge (2 Paar große gebogene Moloney Zange zum Öffnen von Eierschalen und Aushöhlungen Embryonen, 2 Paar Feinspitze gekrümmt Dumont Pinzetten zum Entfernen von RPE, ein Paar Bonn gezahnten Pinzette zur Entfernung von Linse und Glas) durch Eintauchen des Tipps in 96% Ethanol und flammenden. Saubere Dissektion Umfang mit Tüchern in 70% Ethanol getaucht. Warm eine Flasche sterile Calcium-Magnesium-freien Hanks Balanced Salt Solution (CMF-HBSS) in einem 37 ° C Wasserbad. Füllen 100 mm sterile Petrischalen bis zu 3/4 mit warmen CMF-HBSS.
    2. Zeigen Elektroporationskammer unter einem anderen sauberen Dissektionsmikroskop füllen und mit 120 ul von Plasmid-Lösung. Verbinden Elektroden Elektroporationseinrichtung, so dasssicher maßgeschneiderte Elektrode ist mit dem negativen Pol verbunden und Gold gekippt Elektrode an den positiven Pol.
  2. Embryo-Kollektion:
    1. Reinigen Sie die Eier durch Abwischen Muscheln mit Tüchern in 70% Ethanol benetzt. Pflegen sterile Verfahren für den Rest des Protokolls zu vermeiden, tragen Verschmutzung in die Kulturen. Verwenden von großen gekrümmten Moloney Zange ein Loch in der Eierschale vorsichtig öffnen durch leichtes Antippen auf der abgerundeten Spitze von einem Ei (über der Luftkammer) und dann Greifen und Herausziehen Schalenstücke.
    2. Mit einer anderen Pinzette entfernen, Membranen und sammeln Embryos durch Schöpfen sie aus dem Ei (darauf achten, daß der Embryo schädigen). Legen Sie sie in eine Schüssel mit CMF-HBSS.
      HINWEIS: Sammeln Sie so viele Embryonen wie nötig, um die gewünschte Anzahl von Netzhaut-Tassen für Elektroporation zu erhalten, wie in 2.4.4 festgelegt
    3. Entscheidender Schritt: Stufe werden die Embryonen nach Hamburger und Hamilton 38.
      WICHTIG: Um eine optimale Effizienz Embryonen zu erhaltenmuss im Stadium 27 (2A) zu sein.
    4. Euthanize die Embryonen durch Enthauptung mit Moloney Pinzette.
  3. Beziehen Retinal Cups:
    1. Mit feinen Dumont Pinzetten vorsichtig entkernen die Augen und Transfer zu einem neuen CMF-HBSS Gericht.
    2. Ausgehend von dem hinteren Teil jedes Auge, in der Nähe des Sehnervenkopfes und unter Verwendung von zwei feinen Dumont Pinzetten, präsentieren eine Spitze jedes Pinzette zwischen der neuronalen Netzhaut und RPE und sorgfältig sezieren die RPE vorsichtig zu sein, um nicht die Nervenschäden Netzhaut (2B).
      HINWEIS: Der Mangel an Ca 2+ und Mg 2+ in der Lösung wird die RPE Herauslösen aus dem neuronalen Netzhaut leichter.
  4. Elektroporation:
    1. Parameter Elektroporator eingestellt bis 5 Rechteckimpulse von 15 Volt, 50 ms Dauer und 950 ms-Intervall zu liefern. Platz U-förmige negative Elektrode im Inneren Elektroporationskammer (Mikrozentrifugendeckel filled mit 120 ul von Plasmid-enthaltenden Lösung).
    2. Verwendung gekrümmt Dumont Pinzetten Übertragung einer Netzhautbecher an die Elektroporation Kammer (mit einer Schöpfkelle, nicht drücken), und legen Sie sie im Inneren des U-förmigen Elektrode, mit dem hinteren Teil der Netzhaut in Richtung der Unterseite der Elektrode und dem Objektiv nach oben ( 2D).
    3. Legen Sie die Anode, so dass sie den vorderen Teil des Auges berührt, neben dem Objektiv, und mit Hilfe der Elektroporator die Fußpedal den gewünschten elektrischen Impulsen.
    4. Übertragen elektroporiert retinalen Bechers an eine neue Petrischale mit CMF-HBSS und wiederholen Elektroporationsverfahren mit jedem der übrigen Netzhautschalen.
      HINWEIS: Bis zu 6 retinalen Becher können mit dem gleichen Plasmid Lösung ohne signifikante Einbußen der Transfektionseffizienz elektroporiert werden.
    5. Entfernen Sie die Linse und Glaskörper jeder Elektroporation Netzhautbecher durch Greifen sie mit Bonn Zahnzange und leichtes Ziehen durch ter Öffnung Schüler weitergegeben, während das Auge an Ort und Stelle mit der Rückseite der gekrümmten Dumont Pinzetten halten.
    6. Fahren Sie mit der Dissoziation und Kultur der Elektroporation Netzhautzellen nach Standardverfahren.
      HINWEIS: Für eine detaillierte Protokoll auf der Dissoziation und Kultur der Küken Netzhautzellen beziehen sich auf Vergara und Canto-Soler, 2012 Weitere Datei 4 21 In diesem Protokoll werden die Zellen bei geringer Dichte auf Polyornithin beschichteten 6-Well-Platten oder 35 ausgesät. -mm Gerichte (6 x 10 5 Zellen / 35 mm-Durchmesser gut oder Schale). Das verwendete Medium ist Medium 199 mit Penicillin / Glutamin, 10% fötalem Kälberserum (FCS) und Linolsäure-BSA bei 100 & mgr; g / ml. Die Kulturen werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO 2 gehalten. Mit dieser Vorgehensweise 5 - kann 6 x 10 6 Zellen in der Regel pro jeder Stufe 27 elektroporiert Auge erhalten werden.
      HINWEIS: Im Idealfall sollte nicht mehr als 3 Stunden zwischen Embryo-Entnahmeeinheiten und Zellbeschichtung übergeben, um eine gute Zelle Überleben zu sichernund minimieren Stress. Ein typisches Timing für Beobachtung und weiteren Analyse ist nach 4 Tagen in Kultur, da an dieser Stelle die Zellen guten morphologischen und molekularen Differenzierung erreicht und das Überleben ist immer noch hoch.

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Representative Results

Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll für Plasmidtransfektion in entkernte Küken Netzhautbecher für nachfolgende dissoziierten Zellkultur. Transfektion durch Elektroporation unter Verwendung einfach individuelle Elektroden (- 2 Die Zahlen 1) Nutzen erzielt. Die in diesem Protokoll beschriebenen Parameter optimiert wurden Transfektionseffizienzen zwischen 20 und 27% (mit einem Durchschnitt von 22%) (Figur 3D) Bereich zu erhalten. Bemerken, dass bei den oben genannten Gründen werden diese Ergebnisse nach 4 Tagen in Kultur, quantifiziert. In diesem Zusammenhang bezieht sich die Transfektionseffizienz auf den Prozentsatz der Zellen, die das Transgen in der gesamten Zellpopulation auszudrücken. Wenn nur der Photorezeptorpopulation betrachtet wird, zu erhöhen, um die Transfektionseffizienzen durchschnittlich 25% (Figur 3D). Dies ist ein wichtiges Merkmal, da diese Arten von Kulturen werden hauptsächlich verwendet, um Photorezeptoren untersuchen.

Zellkulturen, die electroporat haben ed Verwendung dieser Technik sind in ihrer Morphologie unter DIC Beleuchtung, Zelllebensmerkmale, und die Expression von molekularen Markern wie visinin (ein weitverbreitetes Marker von Photorezeptoren) und Pax6 1 nicht von ihren nicht-elektroporiert Pendants.

Abbildung 1
Abbildung 1. Herstellung der Elektroden. (A - D) Die Kathode wird aus einem quadratischen Kasten Filament (A), die erste richtete wird (B) und dann gebogen mit einer Pinzette in eine quadratische U-Form hergestellt (C - D). Die Anode ist eine dicke Gold gekippt Elektrode (D); Beachten Sie die Isolierung um die Anodenelektrode, so dass nur 0,5 mm von der Spitze ausgesetzt ist. (E) Elektroporation Setup. Einschub zeigt höherer Vergrößerung des eingerahmten Bereich.pg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Herstellung von Retinal Cups für die Elektroporation. (A) Küken-Embryo im Hamburger und Hamilton embryonalen Stadium 27 (B) Die RPE wird sorgfältig von den entkernten Augen mit scharfen Dumont Pinzette entfernt. (C) Das Retina-Cup auf der rechten Seite ist frei von RPE und bereit für die Elektroporation. (D ) Die Kathodenelektrode ist innerhalb eines Elektroporationskammer aus einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Deckel Plasmidlösung gefüllt positioniert. Die Netzhautbecher wird sorgfältig in die Kathode nach oben übertragen, und der Anodenelektrode ist auf der Oberseite platziert, neben dem Objektiv. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendieser Figur.

Figur 3
Figur 3. Effizienz der Transgen-Expression in kultivierten Zellen nach der Elektroporation (A - C). Retinal Becher wurden mit einer GFP-Expressionsplasmid elektroporiert, dissoziiert und für 4 Tage kultiviert. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen, DAPI gefärbt Kerne (A) und GFP-exprimierenden Zellen der Netzhaut (B). Anti Visinin Antikörperfärbung durchgeführt, um Photorezeptoren zu identifizieren (C). (D) graphische Darstellung der Transfektionseffizienz von ex ovo Elektroporation erreicht, als der Prozentsatz von GFP exprimierenden Zellen an der Gesamtzellpopulation (DAPI positiv) oder unter dem Fotorezeptor dargestellt Bevölkerung insbesondere (Visinin positiv). Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SEM von 5 unabhängigen Experimenten. Maßstabsleiste in (A - C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Der kritischste Schritt für den Erfolg dieses Protokolls ist die Auswahl des geeigneten Stadium der Embryonen. In früheren Veröffentlichungen wird ein Bereich von Embryonalstadien für diesen Kulturen gegeben, die typischerweise von den Tagen Inkubation oder embryonale Tage (ED) definiert sind; somit ist es in der Regel davon ausgegangen, dass die Verwendung von ED 5 bis ED 6 Embryonen zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Wir haben jedoch gefunden, dass auf der Bühne 27 (ED & sub5;), wird die Transfektionseffizienz etwa 22% der gesamten Zellpopulation, wie oben angegeben; Noch Effizienz auf 16% abnehmen, wenn mit Stufe 28 Embryos (ED 5,5) und zu 12% in der ersten Stufe 29 (ED 6) 1. Es stehen weitere wichtige Schritte umfassen die Aufrechterhaltung sterilen Bedingungen während des gesamten Prozesses; Erwerb der notwendigen manuellen Geschicklichkeit, um eine Beschädigung der Netzhaut bei der Präparation und Elektroporation; und die Vermeidung von langen Zwischenräume aus der Zeit der Embryo-Entnahmeeinheiten in die Zeit der Zellbeschichtung.

Ein weiterer wichtiger Aspekt, um gute Transfektion efficien sicherzustellen,zen ist die Konzentration der Plasmid-haltige Lösung: Die empfohlene 1,5 ug / ul ist die niedrigste Konzentration, die wir getestet haben, die nicht zu einer Abnahme in der Effizienz zur Folge hat. Diese Konzentration führt zu einer hohen Menge von Plasmid-Material, wenn man bedenkt, dass die Netzhautschalen werden in dieser Lösung getaucht. Mit der kleinsten Größe und die das Auge (wie ein Mikrozentrifugenröhrchen Deckel) untergebracht werden kann dieses Problem minimieren. Darüber hinaus können mehrere Augen unter Verwendung der gleichen Lösung elektroporiert werden; Wir haben keine Verringerung der Wirksamkeit beobachtet, wenn die Elektroporation bis 6 retinalen Becher nacheinander in derselben Plasmidlösung und mehr könnte möglicherweise ausgeführt werden, aber wir können Effizienz nicht zum Unterschied zeugen danach.

Zuvor veröffentlichten Protokollen typischerweise bereitgestellt geringen Effizienz des Gentransfers für diese Art der Kultur, und somit hatten sie oft auf Techniken, die das Produkt der enzymatischen Reaktion auf eine Zelle l messen angewiesenysate, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Ein solcher Ansatz hat den Nachteil, ohne Berücksichtigung von Zelltyp-Diskriminierung und der sich auf eine geringe Anzahl von Zellen, die für die beobachtete Ergebnis, das nicht immer repräsentativ für das Verhalten des größeren Zell-Population sein können, verantwortlich. Ein anderer Weg, um das Problem der geringen Effizienz umgehen, besteht darin Gentransfektion in vivo vor Augen-Enukleation und Kultur durchzuführen. Dies ist ein gangbarer Weg, aber es kann in der Regel nur auf bestimmte experimentelle Paradigmen angewandt werden, da sowohl Plasmid Elektroporation und RCAS Virus-Infektion (eine gemeinsame Gentransduktion Vektor in der Küken) müssen in der Regel in früheren Entwicklungsstadien durchgeführt werden, wodurch eine Zeitverzögerung zwischen Transfektion und Kultur. Dies ist eine wichtige Überlegung, da während dieser Zeitverzögerung werden die Zellen auf die Auswirkungen sowohl des extrazelluläre Mikro sowie intrazelluläre Faktoren ausgesetzt sind, mit erheblichen Auswirkungen auf die Auslegung der experimental Ergebnisse. Im Gegensatz dazu die deutliche Erhöhung der Gentransfereffizienz mit der ex ovo Elektroporation Ansatz erreicht ermöglicht die Untersuchung von Gen-Funktion in einer Zelle-intrinsische Weise. Darüber hinaus kann der Vorteil dieser hohen Transfektionsrate weiter erhöht, wenn in Verbindung mit automatisierten Hochdurchsatz-Zellanalyse 1 verwendet werden.

In der Anfangsphase der Entwicklung dieser Technik hielten wir 24 h elektroporiert RPE-frei Augenmuscheln in der Kultur, die Effizienz der Elektroporation mit unterschiedlichen Bedingungen 1 erreicht zu bewerten. Obwohl wir nicht versuchen, Kultur sie für längere Zeit, zeigt unsere Erfahrung, dass die hier beschriebene Protokoll könnte auch Studien die sich auf der Netzhaut organotypischen Explantate angewendet werden, sofern geeignete langfristige Explantatkultur Bedingungen verwendet werden.

Schließlich wäre es möglich, die Anwendbarkeit der th erweiternist ex ovo Elektroporation Ansatz auf andere Tiermodelle. Beispielsweise in unserer Erfahrung Transfektion von Mäuseaugen am postnatalen Tag 1 oder 4 unter Verwendung dieses Protokolls führten zu qualitativ guten Ergebnissen in Explantatkulturen, aber wenn dissoziierten Zellkulturen wurden versucht Transfektionseffizienz lag in der Größenordnung von 6%, ähnlich wie bei anderen Verfahren. Somit könnte dies eine einfache Alternative zu anderen Protokollen für dieses Tiermodell sein, aber es müssten für das jeweilige System optimiert werden, wenn hohe Wirkungsgrade erforderlich sind. Zu beachten ist, wie oben angegeben, embryonalen Phase zum Zeitpunkt der Elektroporation wurde Schlüssel zu dem hohen Wirkungsgrad Ergebnis in das Küken gewonnen, so sollte dieser Parameter sorgfältig berücksichtigt werden, wenn der Anwendung der Technik auf andere Modelle werden.

Im Ergebnis kann die ex ovo Elektroporation Technik die Anwendbarkeit der in vitro Netzhaut-Systeme zu erweitern, wie leistungsfähige Werkzeuge, um in vivo Studien ergänzen und bietet new Möglichkeiten zur Netzhautforschung.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

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References

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Entwicklungsbiologie Heft 105 Netzhaut Fotorezeptor primäre Zellkultur die Elektroporation Plasmidtransfektion chick
Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz
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Vergara, M. N., Gutierrez, C.,… More

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

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