Summary
ニワトリ胚網膜細胞培養物は、感光体の生物学の研究のための貴重なツールを構成しています。私たちは文化の前に網膜のプラスミドエレクトロポOVOの元に基づいて、効率的な遺伝子導入技術を開発しました。この技術はかなりこのシステムの実現可能な遺伝子操作を行う、現在利用可能なプロトコルを介してトランスフェクション効率を向上させます。
Abstract
ニワトリ胚の網膜由来錐体光受容体に富む文化が網膜神経細胞、特に光受容体の生物学を研究し、世界中の研究者のための不可欠なツールとなっています。それらは容易に薬剤開発のためのハイスループット技術に適合させることができるように、このシステムのアプリケーションは、基本的な研究を越え。しかし、これらの培養物における網膜の光受容体の遺伝子操作は、システムの有用性に重要な制限を装った、非常に困難であることが判明しています。我々は最近開発され、現在利用可能な他のプロトコル1に比べて5倍これらの培養物における網膜細胞のトランスフェクションの速度を増加させるプラスミドのエレクトロポレーション技術OVOの元を検証しています。この方法では、ニワトリ胚の眼は、段階27で摘出され、RPEを除去し、そして網膜のカップは、プラスミド含有溶液中に配置されており、容易に構築お客を用いてエレクトロポレーション電極を作りました。網膜は、次に解離し、標準的な手順を用いて培養されます。この技術は、一般的に感光体集団の25％において導入遺伝子の発現を達成する、プラスミドドリブンRNAi技術の使用を介して、例えば、過剰発現の研究に、ならびに遺伝子発現のダウンレギュレーションにも適用することができます。現在の出版物のビデオフォーマットは、一次網膜培養における遺伝子機能の研究を可能にする、分野の研究者にこの技術が簡単にアクセスできるようになります。また、成功した結果と再現性のために、この手順の重要なステップの詳細な説明が含まれています。
Introduction
ニワトリ胚の網膜からの解離細胞培養物は、広く生存2-9、10-12分化、神経突起伸長13、などを含む光受容体細胞生物学のさまざまな側面を研究するために使用されています。このシステムの利点は、ルーベン・アドラーと共同研究者によって1980年代に開発され、彼と他のグループ14-20によって完成は、動物モデル21としてひよこの固有の特性に存在します。でも、胚の段階でニワトリ目の大きなサイズは、培養のための材料を大量に提供します。培養物は、胚日（ED）5使用して実行されたときにまた、 - 6網膜を、55 -この動物における光受容体の約86％であるので、それらの前駆細胞の80％が光受容体14,15,18,22,23として区別し、コーン24は 、これらの培養物は、この細胞型に焦点を当てた研究のために特に適しています。
我々は最近、develoを持っていますPEDは、したがって、遺伝missexpression研究1を容易にすることによって、このシステムの有用性を広げ、これらの培養物中の細胞の高効率プラスミドトランスフェクションを可能にする簡単な方法を特徴とします。この技術の開発は、細胞自律的に遺伝子機能の研究を可能にするために、トランスフェクションの許容レベルを提供する方法の科学文献中の空隙から茎。主な神経細胞培養は25,26をトランスフェクトするために悪名高い困難なので、これは一部にはあります。この目的のために以前に利用可能な最も一般的に使用される技術の一部は、3-5％の順に効率をもたらすようなリポフェクション、またはリン酸カルシウム媒介トランスフェクションなどの化学的トランスフェクション法を含めて、かなりの毒性27-32を発揮することができます 。酵素レポーター系とプラスミドの使用は、信号を増幅することによって悪いトランスフェクション効率の問題を回避することができるにもかかわらず、彼らはしないでください細胞特異的な効果を識別し、その結果、全体の代表ではないかもしれない小さな細胞集団に基づいています。ひよこのもう一つの広く使用されている方法は、RCASウイルス感染は、増殖細胞にのみ適用し、このプライマリ網膜培養系33に適していないです。
現在のプロトコルではニワトリ胚の目はステージ27（ED 5）、網膜色素上皮（RPE）が除去され、網膜のカップは、プラスミドを含む溶液で満たされたエレクトロポレーションチャンバ内に配置さで摘出し、使用してエレクトロポレーションされているカスタムメイド標準的な技術21を使用して網膜の解離と培養した電極、。この手順を最適化した後、我々は、生存および分化の特性を損なうことなく、一貫して、培養中の細胞の総数の22％単独感光集団内の25％のオーダーでのトランスフェクション効率を達成することができました文化1。ここでは、この技術の成功と再現性を確保するために、この手順のすべての重要なステップを概説し、詳細なプロトコルを提供します。
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Protocol
この作業で説明するすべての手順は、ジョンズ・ホプキンス大学の動物実験委員会によって推奨されるガイドラインに従って行いました。
事前に1：楽器の調製、試薬と料理
- 卵の調製：卵のインキュベーターで5日間37.5℃、相対湿度60％で受精白色レグホン鶏の卵をインキュベートします。
注：標準化と胚発生を同期させるための役に立つかもしれ容量ロッキングが、ロッキングインキュベーターは、このプロトコルの結果のために厳密には必要ではないです。 - プラスミド準備：
- 必要に応じてデザインプラスミドは（RNAi技術1,34を使用することによって例えば）遺伝子の過剰発現またはダウンレギュレーションのために構築します。可能な限り、構築物中のレポーター遺伝子を（例えば、EGFP、RFPまたはのLacZなど）が含まれます。
注：例えば、CMVのようないくつかの一般的に使用されるプロモーターは、時間後に沈黙になることができます。 CAGのpromotER（CMVエンハンサーとチキンβ-アクチンプロモーター）関心35-37の遺伝子の効率的な長期的な表現を提供する、非常に良い代替手段です。 - 無菌PBS中1.5μgの/μlの濃度でのプラスミド溶液を準備します。オプション：事前にプラスミド溶液を調製し、それが凍結された使用可能な状態になるまで保管してください。
注：より高いプラスミド濃度が低いプラスミド濃度はトランスフェクション効率1を下げて使用するのに対し、効率の大幅な増加をもたらさありません。
- 必要に応じてデザインプラスミドは（RNAi技術1,34を使用することによって例えば）遺伝子の過剰発現またはダウンレギュレーションのために構築します。可能な限り、構築物中のレポーター遺伝子を（例えば、EGFP、RFPまたはのLacZなど）が含まれます。
- 電極：
- アノードの使用のために厚い金（特定の材料/機器の表を参照）電極をひっくり返し。 70％エタノールで拭いてください。
注：金の断熱材が露出して約0.5mmを残して、電極を傾け、電流の漏れを最小限にすることをお勧めします。材料を絶縁するための情報は、特定の材料の表に記載されています。 - 2.5ミリメートル四方bのうち、カソードを作ります牛フィラメント、（通常はマイクロピペットプラーで使用）幅4.5ミリメートル。鉗子を用いて、正方形のボックスを取り消し、長いストリップにフィラメントをまっすぐ。その後、解剖顕微鏡やガイドとして定規を使って下に、ベースで3 mmの長さの正方形「U」形状にフィラメントを曲げ、反対側のフィラメントの残りの長さ（ 図1で、片側に2ミリメートル高、C - D）。ピンセットを使用して、滅菌するために96％エタノール及び火炎に電極を浸します。そして、電極の長い腕に小さなワニ口クリップで電気リード線を接続します。
- アノードの使用のために厚い金（特定の材料/機器の表を参照）電極をひっくり返し。 70％エタノールで拭いてください。
- エレクトロポレーションチャンバーのセットアップ：
- テープを使用して100ミリメートルペトリ皿に、ダウン滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブの蓋を切断し、それを貼り付け、平らな側がエレクトロポレーションチャンバーを準備する（ 図1E）。
注：仕事と同じような大きさの井戸の形で他の容器と、しかし、マイクロチューブの蓋は簡単にアクセスし、オートクレーブ可能です。よくひよこの目とカソード電極を収容するのに十分な大きさが、プラスミド溶液の廃棄物になるよう大きくないでなければなりません。
- テープを使用して100ミリメートルペトリ皿に、ダウン滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブの蓋を切断し、それを貼り付け、平らな側がエレクトロポレーションチャンバーを準備する（ 図1E）。
2. 例OVOエレクトロポレーション手順
- 楽器の調製
- マイクロ解剖ツール滅菌浸漬することにより、（RPEを除去するための卵の殻を開いて胚をすくうための大きな湾曲モロニー鉗子の2ペア、微先端湾曲デュモンピンセットの2ペアを、ボンの1組は、レンズと硝子体を除去するための鉗子を歯） 96％のエタノールと炎でのヒント。 70％エタノールに浸したワイプを使用してクリーンな解剖スコープ。 37℃の水浴中で滅菌したカルシウム・マグネシウムフリーハンクス液（CMF-HBSS）のボトルを温めます。暖かいCMF-HBSSでフル3/4に100ミリメートルの滅菌ペトリ皿を埋めます。
- 別のきれいな解剖顕微鏡下でエレクトロポレーションチャンバーを配置し、プラスミド溶液の120μlの記入。 、エレクトロポレーション装置に電極を接続すること必ずカスタムメイドの電極は、負極に接続されていると金が正極に電極をひっくり返しました。
- 胚コレクション：
- 70％エタノールで湿らせたワイプで殻を拭いて卵をきれいにしてください。文化に汚染を運ぶ避けるために、プロトコルの残りの部分で滅菌手順を維持します。大きな湾曲モロニー鉗子を使用して、慎重にゆっくりと（空気室以上）卵の丸い先端をタップして、把持とシェル部分を引き出して卵の殻に穴を開けます。
- 鉗子の別のペアを有する膜を除去し、（胚を傷つけないように注意して）卵からそれをすくうことによって胚を収集します。 CMF-HBSSで皿にそれを置きます。
注：2.4.4で指定されたエレクトロポレーションのために網膜カップの所望の数を取得するために必要な数の胚を収集 - 重要なステップ：ハンバーガーとハミルトン38に従って胚をステージ。
注：最適な効率の胚を取得するにはステージ27（ 図2A）でなければなりません。 - モロニー鉗子を使用して、断頭により胚を安楽死させます。
- 網膜カップの入手先：
- 細かいデュモンピンセットを使用して、慎重に目を摘出して、新しいCMF-HBSS皿に移します。
- 視神経乳頭の近くに、各眼の後方部分から開始し、2つの細かいデュモンピンセットを使用して、神経網膜とRPEの間にピンセットの各対の一方の先端を導入し、慎重にRPEが神経を損傷しないように慎重にされて出て解剖します網膜（ 図2B）。
注：RPEを助ける溶液中のCa 2+およびMg 2+の欠如は、より簡単に神経網膜から切り離します。
- エレクトロポレーション：
- 15ボルト、50ミリ秒の持続時間、および950ミリ秒間隔の5平方パルスを提供するためにエレクトロポのパラメータを設定します。場所 'U'は、エレクトロポレーションチャンバー内の負極を形（微量蓋フィルプラスミド含有溶液の120μL）とのED。
- 湾曲デュモンピンセットを使用して（押していない、すくうにより）エレクトロポレーションチャンバーに1網膜のカップを転送し、電極の底面と上向きレンズ（に向けて網膜の後方部分で、「U」形状の電極内に配置図2D）。
- それは次のレンズに、目の前の部分に触れると、エレクトロポレーターのフットペダルは、電気パルスを提供するように使用して陽極を配置します。
- CMF-HBSSで新しいペトリ皿にエレクトロポレーションした網膜カップを移し、残りの網膜カップのそれぞれにエレクトロポレーション手順を繰り返します。
注：6網膜杯までは、トランスフェクション効率の著しい低下なしに同一のプラスミド溶液をエレクトロポレーションすることができます。 - ボン歯鉗子でそれらを握り、ゆっくりとトンを介して引っ張ることにより、各エレクトロポ網膜カップのレンズと硝子体を削除します湾曲デュモンピンセットの裏で所定の位置に目を保持しながら、彼は口を瞳孔。
- 標準的な手順を以下のエレクトロポ網膜細胞の解離と文化に進んでください。
注：ひよこ網膜細胞の解離と文化に関する詳細なプロトコルの場合ベルガラとカント・ソレル、2012、追加のファイル4〜21を参照して、このプロトコルでは、細胞は、ポリオルニチンでコーティングした6ウェルプレートまたは35に低密度で播種します。 -mm皿（6×10 5細胞 / 35 mmの直径ウェルまたはディッシュ）。使用した培地は、ペニシリン/グルタミン、10％ウシ胎児血清（FCS）および100μg/ mlのリノール酸-BSA 199培地です。培養物を5％CO 2の加湿37℃インキュベーター中で維持されています。この手順を使用して、5 - 6×10 6個の細胞は、典型的には、各ステージ27エレクトロ目ごとに得ることができます。
注：理想的には、せいぜい3時間は、胚の収集および細胞播種の間を通過する必要があり、良好な細胞生存を確保するためにストレスを最小限に抑えます。この時点で、細胞は、良好な形態学的および分子分化を達成していると生存率はまだ高いので観察し、さらなる分析のための典型的なタイミングは、文化の中で4日後です。
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Representative Results
ここでは、その後の解離細胞培養のための除核ひよこ網膜カップへのプラスミドのトランスフェクションのための単純なプロトコルを提示します。トランスフェクションは、カスタムの電極（ - 2、図1）を作成することが容易に使用してエレクトロポレーションにより達成されます。このプロトコルで説明するパラメータ（平均22％で）20％の間と27の範囲のトランスフェクション効率を得られるように最適化された（ 図3D）。上記の理由のために、これらの結果は、培養の4日後に定量化される、ということに注意してください。この文脈において、トランスフェクション効率は、全細胞集団内で導入遺伝子を発現する細胞の割合を指します。唯一の感光体集団が考慮されている場合は、トランスフェクション効率は、25％の平均（ 図3D）に増加します。培養物のこれらのタイプは、主に光受容体を研究するために使用されているので、これは重要な特徴です。
electroporatされた細胞培養この技術を用いて編その非エレクトロポDIC照明下でその形態での対応、細胞生存特性、及びそのようなvisininなどの分子マーカーの発現（光受容体の広く使用されているマーカー）およびPax6の1と区別できません。
電極の1メイキング図。 （A - D）陰極は正方形'U'状に鉗子を用いて最初にまっすぐにされた正方形のボックスフィラメント（A）、（B）、次いで屈曲から作られている（C - D）。アノードは厚い金電極（D）を傾けています。露出した先端の唯一の0.5ミリメートルを残して、アノード電極の周囲に絶縁に注意してください。（E）エレクトロポレーションの設定。挿入図は、四角で囲まれた領域の高倍率を示しています。PG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
エレクトロポレーションのための網膜カップの図2の準備。ハンバーガーとハミルトン胚の段階で、（A）ニワトリ胚27（B）、RPEを慎重に鋭いデ ュモンピンセットを用いて、除核された目から削除されます。（C）右側の網膜カップは、RPEを欠いとエレクトロポレーションのための準備ができている。（D ）カソード電極は、プラスミド溶液を充填した1.5 mlのマイクロ遠心チューブのふたから作られたエレクトロポレーションチャンバ内に配置されています。網膜のカップを慎重に上を向いてカソード電極に伝 達され、アノード電極は、レンズの横、上に配置される。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
後の培養細胞における導入遺伝子発現の図3.効率エレクトロポレーション（A - C）。網膜カップが解離し、4日間培養し、GFP発現プラスミドでエレクトロポレーションしました。蛍光顕微鏡写真は、DAPI染色された核（A）とGFPを発現する網膜細胞（B）を示します 。抗Visinin抗体染色は、光受容体細胞（C）を同定するために行った。（D）グラフエレクトロポ卵元によって達成トランスフェクション効率を示す、総細胞集団（DAPI陽性）の中で、または光受容体間のGFP発現細胞の割合として表されます特に人口（正Visinin）。結果は、5つの独立した実験の平均±SEMを表します。でスケールバー
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Discussion
このプロトコルの成功のための最も重要なステップは、胚の適切な段階を選択することです。以前の出版物では、胚の段階の範囲は、一般に、インキュベーションまたは胚日の日（ED）によって定義され、これらの培養のために与えられています。したがって、通常、EDに6胚をED 5を使用して同等の結果をもたらすと仮定されます。しかし、我々は、上記のように、ステージ27（ED 5）に、トランスフェクション効率は、全細胞集団の約22％になることを見出しました。まだ効率は28胚（ED 5.5）のステージを使用している場合、ステージ29（ED 6）1で12％と16％に低下します。その他の重要なステップは、プロセス全体を通じて、無菌状態を維持することを含み;解剖とエレクトロポレーションの間に、網膜の損傷を避けるために必要な手先の器用さを獲得。および細胞のプレーティング時に胚採取の時間から長いギャップを回避します。
良いトランスフェクションefficienを確保するためのもう一つの重要な考慮事項CIESプラスミド含有溶液の濃度である：推奨1.5μgの/μlのは、我々は効率の低下をもたらさなかったこと試験した最低濃度です。網膜のカップは、その溶液中に浸されていることを考慮すると、この濃度は、プラスミド材料の高い量に変換されます。 （例えばマイクロチューブの蓋のように）目を収容する最小サイズウェルを使用すると、この問題を最小限に抑えることができます。加えて、いくつかの眼は同一の溶液を用いてエレクトロポレーションすることができます。連続して同じプラスミド溶液中で6網膜杯まで電気穿孔するとき、我々は効率の低下を見ていない、さらには、おそらく実行することができるが、我々は、その後、効率の違いを証明することはできません。
以前に公開されたプロトコルは、典型的には、培養物のこのタイプの遺伝子導入の効率が低いことを提供している、したがって、彼らはしばしば、細胞L上の酵素反応の生成物を測定する技術に頼らなければなりませんでした感度を高めるためにysate。このようなアプローチは、細胞型の識別のために、常に、より大きな細胞集団の挙動を反映しないことがあり、観察された結果の原因である細胞の数が少ないに頼るので許可しないという欠点があります。低効率の問題を回避する別の方法は、従来の目の除核と培養し、 インビボでの遺伝子導入を行うことです。これは実行可能なアプローチであるが、プラスミドのエレクトロポレーションおよびRCASウイルス感染（ニワトリにおける共通の遺伝子導入ベクター）の両方は、典型的には、以前の発達段階で実行される必要があるので、通常は時間差を生成する、唯一の特定の実験パラダイムを適用することができますトランスフェクションと文化。そのタイムラグの間、細胞は細胞外微小環境だけでなく、細胞内因子の両方の影響にさらされているので、これはEXPの解釈に重要な意味を持つ、重要な検討事項でありますerimental結果。これとは対照的に、エレクトロポレーション法OVOの元で達成遺伝子導入効率の大幅な増加は、細胞固有の方法で遺伝子機能の研究を可能にします。自動化ハイスループット細胞分析1に関連して使用される場合にさらに、この高いトランスフェクション率の利点をさらに高めることができます。
この技術の開発の初期段階で、我々は異なる条件1で達成エレクトロポレーションの効率を評価するために、24時間培養でエレクトロRPE-欠いアイカップを維持しました。我々は時間の長い期間のための文化彼らにしようとしなかったが、我々の経験は、本明細書に記載のプロトコルが提供された適切な長期的な移植片培養条件が使用され、網膜器官外植片に頼るの研究にも適用可能であることを示しています。
最後に、目の適用を拡大することが可能です他の動物モデルへのエレクトロポレーションアプローチ卵の元です 。このプロトコルを使用して、生後1日目または4でのマウスの眼の経験のトランスフェクションの例では外植片培養における質的に良い結果をもたらしたが、解離細胞培養を試みたときに、トランスフェクション効率は、他の技術と同様の6％、の順でした。したがって、これは、この動物モデルのための他のプロトコルへの単純な代替手段とすることができるが、高効率が要求される場合には、特定のシステムのために最適化される必要があります。注目すべきは、上述したように、エレクトロポレーション時の胚の段階では、ニワトリで得られた高効率な結果への鍵だったので、他のモデルに技術を適用する場合、このパラメータは慎重に検討する必要があります。
結論として、エレクトロポレーション技術OVO EXは、nを提供し、 インビボ研究を補完するための強力なツールとしてin vitroでの網膜システムの適用性を拡張することができます網膜研究のためのEW可能。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco - Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1x2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width |
References
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