Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An<em> Ex-ovo</em> Elettroporazione Approach

Summary

Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.

Abstract

Le culture dei fotorecettori arricchito cono derivati ​​da retine pulcino embrionali sono diventati uno strumento indispensabile per i ricercatori di tutto il mondo che studiano la biologia dei neuroni della retina, in particolare fotorecettori. Le applicazioni di questo sistema vanno oltre la ricerca di base, in quanto possono essere facilmente adattate alle alte tecnologie throughput per lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, la manipolazione genetica dei fotorecettori retinici in queste culture ha dimostrato di essere molto impegnativo, che costituiscono una limitazione importante per l'utilità del sistema. Abbiamo recentemente sviluppato e validato un ex ovo tecnica plasmide elettroporazione che aumenta il tasso di trasfezione di cellule retiniche in queste culture per cinque volte rispetto ad altri protocolli attualmente disponibili ^1. In questo metodo occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27, l'RPE viene rimosso, e la coppa retinica viene posto in una soluzione contenente plasmide e elettroporate utilizzando CUSTOM- facilmente costruitoelettrodi in. Le retine sono poi dissociate e coltivate utilizzando le procedure standard. Questa tecnica può essere applicata a studi overespressione nonché alla downregulation dell'espressione genica, per esempio attraverso l'uso della tecnologia RNAi plasmide-driven, comunemente ottenendo l'espressione del transgene nel 25% della popolazione fotorecettori. Il formato video di questa pubblicazione rendere questa tecnologia facilmente accessibile ai ricercatori del settore, che consente lo studio della funzione dei geni in colture primarie della retina. Abbiamo incluso anche spiegazioni dettagliate sulle fasi critiche di questa procedura per un esito positivo e la riproducibilità.

Introduction

Colture di cellule dissociate da retine pulcino embrionali sono stati ampiamente utilizzati per studiare vari aspetti della biologia cellulare dei fotorecettori, tra cui la loro sopravvivenza ^2-9, differenziazione ^10-12, crescita dei neuriti ^13, e altro ancora. I vantaggi di questo sistema, sviluppato nel 1980 da Ruben Adler e collaboratori e perfezionati dai suoi e altri gruppi ^14-20, risiedono nelle caratteristiche intrinseche del pulcino come un modello animale ^21. Le grandi dimensioni dell'occhio pulcino, anche a stadi embrionali, fornisce una grande quantità di materiali per le culture. Inoltre, quando le culture vengono eseguite utilizzando giorno embrionale (ED) 5 – 6 retine, 55-80% dei loro cellule progenitrici differenziarsi come fotorecettori ^{14,15,18,22,23,} e dal momento che circa il 86% dei fotorecettori in questo animale sono coni ^24, queste culture sono particolarmente adatti per studi che mettono in questo tipo cellulare.

Abbiamo recentemente sviped e caratterizzato una semplice tecnica che consente ad alta efficienza plasmide trasfezione delle cellule in queste culture, ampliando così l'utilità di questo sistema facilitando studi missexpression genetica ^1. Lo sviluppo di questa tecnica derivava da un vuoto nella letteratura scientifica di metodi che fornisca un livello accettabile di trasfezione per consentire lo studio della funzione genica in maniera autonoma cella. Ciò è in parte perché colture neuronali primarie sono notoriamente difficili da trasfettare ^25,26. Alcune delle tecniche più utilizzate in precedenza disponibili per questo scopo inclusi metodi di transfezione chimici quali lipofezione o calcio trasfezione fosfato-mediata, che determinano efficienze dell'ordine del 3-5% e possono esercitare una notevole tossicità ^27-32. Anche se l'uso di plasmidi con un sistema reporter enzimatico può aggirare il problema della scarsa efficienza di trasfezione amplificando il segnale, non lo fannodiscriminare effetti specifici delle cellule, ed i loro risultati sono basati su una piccola popolazione di cellule che potrebbe non essere rappresentativo dell'intero. Un altro metodo ampiamente usato al pulcino, infezione da virus RCA, è applicabile solo alle cellule proliferanti e quindi non adatto a questo sistema di coltura retinico primario ^33.

Nel protocollo corrente occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27 (ED 5), l'epitelio pigmentato retinico (RPE) viene rimosso, e la coppa retinica è posto in una camera di elettroporazione riempita con una soluzione plasmide contenente e elettroporate con misura elettrodi, seguita da dissociazione della retina e della cultura utilizzando tecniche standard ^21. Dopo ottimizzare questa procedura siamo stati in grado di ottenere sempre efficienza di trasfezione dell'ordine del 22% del numero totale di cellule in coltura e 25% nella popolazione fotorecettore sola, senza compromettere le caratteristiche di sopravvivenza e la differenziazione delleculture ^1. Qui forniamo un protocollo dettagliata che illustra tutte le fasi importanti di questa procedura al fine di assicurare il successo e la riproducibilità di questa tecnica.

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo lavoro sono stati eseguiti secondo le linee guida raccomandate dalla cura degli animali e del Comitato uso presso la Johns Hopkins University. 1. Ahead of Time: preparazione di strumenti, reagenti e piatti Preparazione di uova: incubare fecondate uova di gallina bianca Livorno a 37,5 ° C e 60% di umidità relativa per 5 giorni in una incubatrice uovo. NOTA: Un incubatore con capacità di oscillazione può essere utile per la standardi…

Representative Results

Qui vi presentiamo un semplice protocollo per plasmide trasfezione in enucleate pulcino tazze retina per la successiva coltura cellulare dissociata. Trasfezione si ottiene elettroporazione utilizzando facile fare elettrodi personalizzati (Figure 1 – 2). I parametri descritti in questo protocollo sono stati ottimizzati per ottenere efficienze di trasfezione che variano tra il 20 e il 27% (con una media del 22%) (Figura 3D). Si noti che, per le ragioni sopra esposte, questi risultati sono…

Discussion

La fase più critica per il successo di questo protocollo è la selezione della fase appropriata degli embrioni. In pubblicazioni precedenti, una serie di stadi embrionali è dato per queste colture, tipicamente definito dai giorni di incubazione o embrionali giorni (ED); così è di solito presume che l'utilizzo ED 5 a ED 6 embrioni produrrà risultati equivalenti. Tuttavia abbiamo trovato che sulla fase 27 (ED 5), l'efficienza di trasfezione sarà circa il 22% della popolazione cellulare totale, come indicato …

Materials

ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5mm square box filament, 4.5mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco – Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1×2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width