Developmental Biology

在小鸡视网膜有效的基因转移的原代细胞培养研究： Published: November 2, 2015 doi: 10.3791/52002

DOI

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M. Natalia Vergara¹, Christian Gutierrez¹, M. Valeria Canto-Soler¹

¹Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

鸡胚视网膜细胞培养物是宝贵的工具，用于感光生物学研究。我们已经开发了基于前OVO之前培养的视网膜质粒电高效的基因转移技术。这种技术显着地增加的转染效率比现有的协议，使遗传操作此系统是可行的。

Abstract

从鸡胚视网膜得到的锥感光，丰富文化已经成为不可缺少的工具，为世界各地的研究人员在研究视网膜神经细胞，特别是光感受器的生物。该系统的应用程序超越基本研究，因为它们可以容易地适用于高通量技术药物开发。然而，在这些培养视网膜感光的遗传操作已被证明是非常具有挑战性的，构成一个重要的限制对系统的有效性。我们最近开发并验证一个前卵内的质粒电穿孔技术，由五倍相比其它目前可用的协议^增加1视网膜细胞在这些培养的转染率。在该方法中鸡胚的眼睛摘除在阶段27中，RPE被除去，视网膜杯被放置在含质粒的溶液，并电使用容易地构成定做制作电极。视网膜然后分离和培养用标准程序。这种技术可以通过使用质粒驱动的RNAi技术应用于过表达的研究，以及对基因表达的下调，例如，通常实现的转基因表达在感光体人口的25％。本出版物中的视频格式将使这个技术很容易接触到该领域的研究，从而在原发性视网膜文化基因功能的研究。我们还包括了该过程的圆满成功和可重复性的关键步骤的详细描述。

Introduction

从胚胎鸡的视网膜分离的细胞培养物已被广泛用于研究感光细胞生物学的各个方面，包括其存活^2-9，分化^10-12神经突增生^13，等等。该系统的优点，由鲁本·阿德勒和合作者研制在80年代和由他和其他团体^14-20，完善居住在小鸡作为动物模型^21的固有特性。大尺寸小鸡的眼睛，即使在萌芽阶段，为培养大量的材料。此外，当培养物使用胚胎天（ED）的5进行- 6视网膜，55 - 80％的祖细胞的分化为光感受器^{14,15,18,22,23，}和因为在这种动物的光感受器的大约86％是^圆锥 24，这些培养物特别适用于研究着眼于这种细胞类型。

我们最近开发板的PED和表征一个简单的技术，其允许细胞在这些培养高效质粒转，从而通过促进遗传missexpression研究¹扩大了该系统的有效性。该技术的发展，从在将提供转染的可接受水平以使基因的功能在细胞中自主方式的学习方法的科学文献的空隙梗。这部分是因为初级神经元培养物是非常难以染^25,26。一些以前提供用于此目的的最常用的技术的包括化学转染方法，例如脂质体转染或磷酸钙介导的转染，这导致在3-5％的数量级的效率，并且可以施加相当大的毒性^27-32。即使使用的质粒与一种酶报道系统可以通过放大信号规避差转染效率的问题，也不用鉴别细胞特异性的效应，其结果是基于小细胞群，可能不能代表整个的。在小鸡的另一广泛使用的方法，RCAS病毒感染，只适用于增殖细胞，因此不适合本原发性视网膜培养^系统 33。

在当前协议鸡胚眼睛摘除在阶段27（ED 5），视网膜色素上皮细胞（RPE）被除去，视网膜杯被放置在电穿孔室中填充有含质粒的溶液，使用电穿孔的定做电极，然后使用标准技术²¹视网膜解离和培养。优化该过程之后，我们已经能够始终如一地实现转染效率的培养中的细胞和单独的感光体群体内的25％的总数量的22％的量级上，而不会影响的存活和分化的特性培养^1。在这里，我们提供详细的概述的协议，以确保该技术的成功和重现这个过程的所有的重要步骤。

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Protocol

在这项工作中所描述的所有程序都按照约翰·霍普金斯大学推荐的动物护理和使用委员会的指导方针进行。

1.提前的时间：的仪器，试剂和菜准备

鸡蛋的制备：在鸡蛋孵化器孵化受精卵白来航鸡卵在37.5℃，60％相对湿度为5天。
注：与摇摆的容量可能是标准化和同步胚胎发育有帮助，但摇摆孵化器是不是绝对必要的此协议的结果。
质粒制备：
1. （通过使用RNAi技术^1,34的例如）根据需要设计质粒构建用于基因过表达或下调。包括一个报告基因（如EGFP，RFP或LacZ的）在构建体只要有可能。
  注：某些常用的启动子，如巨细胞病毒，可在时间后变得沉默。该CAG promot尔（鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子）是一个非常好的选择，提供感兴趣^35-37的基因的有效长期表达。
2. 准备以1.5微克/微升无菌PBS的浓度的质粒溶液。可选：提前准备的时间质粒的解决方案，并将其存储冷冻，直到准备使用。
  注：较高的质粒浓度不导致效率显著增加，而使用较低浓度的质粒降低转染效率^1。
电极：
1. 对于阳极使用粗的金尖电极（见表具体材料/设备）。擦拭用70％乙醇。
  注：金的绝缘放倒电极，留下大约0.5mm露出，最好尽量减少电流的泄漏。为绝缘材料的信息可以在表中的特定材料中找到。
2. 使阴极出了一个2.5 mm的二次B牛长丝，4.5毫米（微量车夫正常使用）。用钳子的帮助下，撤销方箱和拉直丝为长条形。然后，解剖显微镜和用尺子作为指导下，弯曲长丝成方形的“U”形长3毫米的碱和2毫米高的一侧，与另一侧的灯丝的剩余长度（图1 ，C - D）。使用镊子，蘸96％的乙醇和火焰的电极进行消毒。然后附加的电引线具有小鳄鱼夹到电极的较长臂。
电穿孔室设置：
1. 通过切割盖的无菌1.5 ml离心管中，并贴上它，平面向下，至100毫米培养皿使用磁带（图1E）准备电穿孔室。
  注意：其他容器中的类似的尺寸会工作的阱的形式;然而，离心管的盖子是方便和高温高压灭菌。该井必须足够大，以容纳一个小鸡眼睛和阴极电极，但没有那么大，以导致浪费质粒溶液。

2. 前OVO电过程

准备仪器：
1. 消毒微解剖工具（2对大弯莫洛尼钳打开蛋壳，并舀出胚胎，2对细尖弯曲杜蒙镊子取出视网膜色素上皮，一对波恩齿镊去除晶状体和玻璃体）通过浸渍在96％的乙醇和燃烧的技巧。使用湿巾浸渍在70％乙醇清洁清扫范围。在37℃水浴预热瓶无菌钙无镁汉克的平衡盐溶液（CMF-HBSS）的。填写百毫米无菌培养皿中，以3/4的温暖CMF-HBSS。
2. 将电室另一块干净的解剖显微镜下，并填写与120微升质粒的解决方案。连接电极电设备，使得确保定制的电极连接到所述负极和金电极放倒到正极。
胚胎收集：
1. 通过擦拭壳湿巾润湿在70％乙醇清洁鸡蛋。保持整个协议的其余部分消毒程序，以避免携带污染物入文化。用大弯钳莫洛尼小心地轻轻拍打上一个鸡蛋的圆形顶部（在气室），然后捏住并拉出壳片打开蛋壳的孔。
2. 与另一双钳取出膜，并舀出来的蛋收集胚胎（注意不要损坏胚胎）。将它与CMF-HBSS菜。
  注意：根据需要在2.4.4指定收集尽可能多的胚胎以获得视网膜杯电穿孔所需数量
3. 关键的一步：根据汉堡和汉密尔顿³⁸阶段的胚胎。
  注：要获得最佳效果的胚胎必须是在阶段27（图2A）。
4. 安乐死使用莫洛尼镊子断头的胚胎。
获取视网膜杯：
1. 用细杜蒙镊子，小心翼翼地剜除眼睛和转移到一个新的CMF-HBSS菜。
2. 从每只眼睛，靠近视神经头的后部开始，并用两个细杜蒙镊子，介绍每个镊子的神经视网膜和视网膜色素上皮和精心之间的一个提示解剖出视网膜色素上皮是谨慎，不损伤神经视网膜（图2B）。
  注意：CA ^{2+和Mg 2+}的溶液中的将帮助RPE缺乏从神经视网膜更容易脱离。
电穿孔：
1. 设置电穿孔的参数，以便在15伏，50毫秒的持续时间，和950毫秒间隔5平方脉冲。将“U”形的负电极内部电室（离心盖填充编与120微升含质粒的溶液）。
2. 使用弯曲的蒙特镊子传送一个视网膜杯电穿孔室（由舀，不按），并将其放置在“U”形电极的内部，与视网膜朝向电极的底部，并朝上透镜后部（ 图2D）。
3. 放置阳极，以便它接触到眼睛的前部，旁边的透镜，以及使用该电穿孔仪的脚踏板递送电脉冲。
4. 传输电视网膜杯到一个新的培养皿CMF-HBSS，重复电过程与其余每个视网膜杯。
  注：最多6视网膜杯可以与电不转染效率显著减少同一质粒的解决方案。
5. 握住他们波恩齿镊和至T轻轻拉删除每个视网膜电杯的镜头和玻璃体他瞳孔开口在保持眼睛代替与弯曲蒙特镊子的背面。
6. 请继续按标准程序将电穿孔的视网膜细胞的分离和培养。
  注：有关鸡视网膜细胞的分离和培养一个详细的协议是指贝尔加拉和坎托-索勒，2012年，附加文件⁴月21日在这个协议中的细胞以低密度的聚鸟氨酸包被6孔板或35。 -mm菜^（6×10 5个细胞/ 35毫米直径的孔或皿）。使用的培养基是用青霉素/谷氨酰胺，10％胎牛血清（FCS），和亚油酸 - 牛血清白蛋白，在100微克/毫升介质199。将培养物保持在增湿的37℃培养箱，用5％ _的 CO 2。使用该方法，5 - ^6×10 6个细胞，通常可以每每个阶段27电穿孔眼获得。
  注：在理想情况下，不超过3小时应该胚胎收集和细胞板之间通过，以保证良好的细胞存活并尽量减少压力。观察和进一步分析一个典型的时间是在培养4天，因为此时细胞已经取得了良好的形态学和分子分化和存活空间还很大。

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Representative Results

在这里，我们提出了一个简单的协议，用于质粒转染到去核的小鸡视网膜杯后续分离的细胞培养。转染通过电穿孔使用容易使自定义的电极（ - 2图1）来实现的。在这个协议中所描述的参数进行了优化，以获得转染效率，范围20％之间和27（平均为22％）（图3D）。注意的是，对于以上所述的理由，这些结果后在培养4天后进行定量。在这种情况下，转染效率是指细胞表达的总细胞群中的转基因的百分比。如果只在感光体人口被认为是，转染效率提高到平均25％（图3D）。这是一个重要特征，因为这些类型的培养物的主要用来研究感光体。

已electroporat细胞培养编使用这种技术是从它们的非电穿孔同行无法区分在根据DIC照明，细胞存活的特点，以及分子标记物如visinin（感光体的一种广泛使用的标记物）和Pax6的¹表达它们的形态。

图1.制作电极。（A - D）的阴极是由出一个方盒子长丝（A）中 ，这是第一次拉直（B），然后弯曲的钳成方形的“U”形（C - D）。阳极是粗的金尖电极（D）;请注意，阳极电极周围的绝缘层，留下只有0.5毫米尖端暴露出来。（E）电穿孔设置的。插图显示方框区域的高倍放大。PG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2.准备视网膜杯的电穿孔。（一）鸡胚在汉堡和汉密尔顿萌芽阶段27.（B）的RPE从摘除眼睛使用锋利的杜蒙镊子小心取出。（C）的视网膜杯右边是缺乏视网膜色素上皮，准备电。（D ）阴极电极定位在电穿孔室中开出了1.5 ml离心管盖填充有质粒溶液内。视网膜杯子小心地转移到朝上阴极和阳极放置在上面，旁边的镜头。请点击此处查看大图这个数字。

图3.效率转基因表达的在培养细胞后电穿孔（A - C）视网膜杯电穿孔用GFP表达质粒，解离和培养4天。荧光显微照片显示DAPI染色的细胞核（A）和GFP表达视网膜细胞（B）。抗Visinin抗体染色，以确定光感受器细胞（C）。（D）的格拉夫表示由前OVO电实现转染效率，表示为绿色荧光蛋白间的总细胞群（DAPI阳性），或感光体之间表达细胞的百分比人口特别是（Visinin正）。结果代表平均值±5个独立实验的SEM。在比例尺（A - C）。请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

此协议的成功的最关键的一步是选择胚胎的适当阶段。在以前的出版物，一个范围胚胎阶段的，给出了这些培养，典型地通过的孵化或胚胎天的天（ED）所定义;因此通常认为使用ED 5至6 ED胚胎将得到相同的结果。然而，我们已经发现，在阶段27（ED 5），转染效率将是大约22％的总细胞群中，如上所述;但效率会如果使用级28胚胎（ED 5.5），并以12％的在阶段29（ED 6）降低到^16％1。其他关键步骤包括保持整个过程的无菌条件;获得必要的手巧，以避免损坏解剖和电在视网膜上;和避免从胚胎收集的细胞电镀时的时间长的空白。

另一个重要的考虑因素，以确保良好的转染efficienCIES是含有质粒的溶液的浓度：推荐的1.5微克/微升的是，我们测试了没有导致效率下降的最低浓度。考虑到视网膜的杯子沐浴在该解决方案时，此浓度转化为大量质粒的材料。用最小尺寸以及将容纳眼（如微量离心管的盖子）可减少这一问题。此外，一些眼睛能使用相同的溶液被电穿孔;在相同的质粒溶液电穿孔多达6视网膜杯连续时我们没有看到在效率的降低，并且更可能可以进行，但我们也不能证明的差在效率其后。

先前公布的协议已经典型地提供对于这种类型的培养的基因转移的效率低，因此，他们常常不得不依靠该测量酶反应的产物对细胞升技术ysate以增加灵敏度。这样的方法还没有允许依靠细胞负责观察到的结果，这可能不总是反射更大的细胞群体的行为的低数量的细胞种类判别及的缺点。另一种方式来规避效率低的问题是执行基因转染体内，前眼眼球摘除和文化。这是一个可行的方法，但它通常可以只应用于具体的实验范例，因为两者的质粒电穿孔和RCAS病毒感染（在小鸡的共同基因转导载体）通常需要在更早发育阶段的执行，产生之间的时间滞后转染和文化。这是一个重要的考虑因素，因为该时间滞后期间，细胞暴露于两种外微环境以及细胞内因素的影响，具有在exp的解释显著影响erimental结果。与此相反，实现了与前OVO电方法的大幅提高基因转移效率允许基因功能的一个细胞内在方式的研究。此外，这种高转染率的优点可以进一步与自动化高通量细胞分析¹一起使用时增加。

在该技术的发展的初始阶段，我们维持电穿孔的RPE缺乏眼杯在培养24小时，评价电穿孔实现了与不同的条件^1的效率。尽管我们并没有试图培养它们的倍更长的时间，我们的经验表明，本文描述的协议也可应用于依靠视网膜器官植的研究中，提供适当的长期植体的培养条件被使用。

最后，有可能扩大第的适用性是前OVO电的方式到其他动物模型。例如在小鼠眼睛使用此协议产后天1或4的我们的经验转染产生了在植体培养定性良好的结果，但是，当解离的细胞培养物试图转染效率为6％，类似于其它技术的顺序。因此，这可能是一个简单的替代其他协议用于此动物模型，但它需要对特定的系统进行优化，如果高效率是必需的。值得注意的是，如上所述，在电的时候萌芽阶段是关键，小鸡得到高效率的结果，因此应用这一技术去其他车型时，该参数应慎重考虑。

总之，前OVO电技术可以扩大体外视网膜系统的适用性作为有力工具体内研究补充，将提供ÑEW可能性视网膜研究。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco - Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width