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Developmental Biology

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Published: November 2, 2015 doi: 10.3791/52002
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Abstract

Los cultivos de fotorreceptores enriquecido cono derivados de las retinas de embriones de pollo se han convertido en una herramienta indispensable para los investigadores de todo el mundo que estudian la biología de las neuronas de la retina, en particular los fotorreceptores. Las aplicaciones de este sistema van más allá de la investigación básica, ya que se pueden adaptar fácilmente a las tecnologías de alto rendimiento para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, la manipulación genética de fotorreceptores de la retina en estos cultivos ha demostrado ser muy difícil, que presenta una importante limitación a la utilidad del sistema. Recientemente hemos desarrollado y validado un ex ovo técnica de electroporación plásmido que aumenta la tasa de transfección de células de la retina en estos cultivos por cinco veces en comparación con otros protocolos disponibles en la actualidad 1. En este método los ojos de embriones de pollo se enucleados en la etapa 27, se retira el RPE, y la copa de la retina se coloca en una solución que contiene el plásmido y se electroporó usando Custom- de fácil construcciónelectrodos hechos. Las retinas son entonces disocian y se cultivan utilizando procedimientos estándar. Esta técnica se puede aplicar a los estudios de sobreexpresión, así como a la regulación a la baja de la expresión génica, por ejemplo, mediante el uso de la tecnología del RNAi plásmido impulsado, comúnmente la consecución de la expresión del transgén en 25% de la población de los fotorreceptores. El formato de vídeo de la presente publicación hará que esta tecnología de fácil acceso para los investigadores en el campo, lo que permite el estudio de la función de genes en cultivos de retina primarios. También hemos incluido una explicación detallada de los pasos críticos de este procedimiento para un resultado exitoso y reproducibilidad.

Introduction

Cultivos de células disociadas de retinas de embriones de pollo se han utilizado ampliamente para estudiar diversos aspectos de la biología de las células fotorreceptoras, incluyendo su supervivencia 2-9 diferenciación 10-12, el crecimiento de neuritas 13, y más. Las ventajas de este sistema, desarrollado en la década de 1980 por Rubén Adler y colaboradores y perfeccionadas por él y para otros grupos de 14-20, residen en las características intrínsecas de la chica como un modelo animal 21. El gran tamaño del ojo polluelo, incluso en las etapas embrionarias, proporciona grandes cantidades de material para cultivos. Por otra parte, cuando los cultivos se realizan con el día embrionario (ED) 5 - 6 retinas, el 55 - 80% de sus células progenitoras diferenciar como fotorreceptores 14,15,18,22,23, y desde aproximadamente el 86% de los fotorreceptores en este animal son conos 24, estas culturas son especialmente adecuados para estudios centrados en este tipo de células.

Recientemente hemos desaped y caracterizado una técnica sencilla que permite una alta eficiencia plásmido transfección de las células en estos cultivos, ampliando así la utilidad de este sistema, facilitando estudios missexpression genética 1. El desarrollo de esta técnica se deriva de un vacío en la literatura científica de métodos que proporcionen un nivel aceptable de la transfección para permitir el estudio de la función génica en una célula de manera autónoma. Esto es en parte debido a cultivos neuronales primarios son notoriamente difíciles de transfectar 25,26. Algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas previamente disponibles para este propósito incluyen métodos de transfección químicos tales como lipofección o calcio transfección mediada por fosfato, que se traducen en una mayor eficacia en el orden de 3-5% y puede ejercer una toxicidad considerable, 27-32. A pesar de que el uso de plásmidos con un sistema reportero enzimática puede eludir el problema de la pobre eficiencia de la transfección mediante la amplificación de la señal, no lo hacendiscriminar los efectos específicos de la célula, y sus resultados se basan en una población de células pequeñas que pueden no ser representativos del conjunto. Otro método ampliamente utilizado en el pollo, infección por el virus RCAS, sólo es aplicable a las células en proliferación y por lo tanto no es adecuado para este sistema de cultivo primario de la retina 33.

En el protocolo actual ojos de embriones de pollo se enucleados en la etapa 27 (ED 5), se retira el epitelio pigmentado de la retina (RPE), y la copa de la retina se coloca en una cámara de electroporación llena con una solución que contiene el plásmido y electroporación utilizando a medida electrodos, seguido por la disociación de la retina y de cultivo utilizando técnicas estándar 21. Después de la optimización de este procedimiento hemos sido capaces de alcanzar consistentemente las eficacias de transfección en el orden del 22% del número total de células en cultivo y 25% dentro de la población de los fotorreceptores solo, sin comprometer las características de supervivencia y diferenciación de lasculturas 1. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describa todos los pasos importantes de este procedimiento a fin de garantizar el éxito y la reproducibilidad de esta técnica.

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Protocol

Todos los procedimientos descritos en este trabajo se realizaron de acuerdo a las pautas recomendadas por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad Johns Hopkins.

1. Antes de Tiempo: Preparación de Instrumentos, reactivos y Platos

  1. Preparación de los huevos: Incubar huevos de gallina fertilizados White Leghorn a 37,5 ° C y una humedad relativa del 60% durante 5 días en una incubadora de huevos.
    NOTA: Una incubadora con balanceo de la capacidad puede ser útil para la normalización y la sincronización de desarrollo embrionario, pero oscilante no es estrictamente necesario para el resultado de este protocolo.
  2. Preparación de plásmido:
    1. Diseño plásmido constructo para la sobreexpresión de genes o regulación a la baja (por ejemplo, mediante el uso de la tecnología del RNAi 1,34) según sea necesario. Incluya un gen indicador (por ejemplo, EGFP, RFP o LacZ) en la construcción siempre que sea posible.
      NOTA: Algunos promotores de uso común, tales como el CMV, pueden llegar a ser silenciada en el tiempo. El promot CAGer (pollo beta-actina promotor con promotor de CMV) es una muy buena alternativa, proporcionando eficiente expresión a largo plazo del gen de interés 35-37.
    2. Preparar una solución de plásmido a una concentración de 1,5 g / l en PBS estéril. OPCIONAL: Preparar la solución plásmido antes de tiempo y almacenarlo congelado hasta que esté listo para su uso.
      NOTA: Superior concentraciones de plásmido no dan lugar a un aumento significativo en la eficiencia, mientras que el uso de concentraciones más bajas de plásmidos disminuyen la eficiencia de transfección 1.
  3. Electrodos:
    1. Para el uso de ánodos de oro gruesa punta del electrodo (véase la Tabla de Materiales Específicos / Equipo). Limpie con etanol al 70%.
      NOTA: Aislamiento del oro punta de electrodo, dejando aproximadamente 0,5 mm expuestos, es aconsejable minimizar la fuga de la corriente eléctrica. Información para material aislante se puede encontrar en la Tabla de materiales específicos.
    2. Hacer un cátodo de un cuadrado de 2,5 mm bfilamento de buey, de 4,5 mm de ancho (normalmente utilizado en extractores micropipeta). Con la ayuda de unas pinzas, deshacer la caja cuadrada y enderezar filamento en una tira larga. Luego, bajo microscopio de disección y usando una regla como guía, doblar el filamento en una forma cuadrada 'U' 3 mm de largo en la base y 2 mm de alto en un lado, con el otro lado de la longitud restante del filamento (Figura 1 , C - D). Con unas pinzas, sumerja el electrodo en etanol al 96% y la llama para esterilizar. A continuación, conecte un cable eléctrico con una pequeña pinza de conexión para el brazo del electrodo más largo.
  4. Cámara electroporación de configuración:
    1. Preparar la cámara de electroporación mediante la reducción de la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y la colocación de ella, lado plano hacia abajo, a una placa de Petri de 100 mm usando cinta (Figura 1E).
      NOTA: Otros recipiente en forma de un pozo de tamaño similar funcionaría; sin embargo, un tubo de microcentrífuga de tapa es fácilmente accesible y autoclavable. El biendebe ser lo suficientemente para alojar un electrodo de ojo de pollo y el cátodo grande, pero no tan grande como para resultar en una pérdida de solución de plásmido.

2. Ex Procedimiento electroporación in ovo

  1. Preparación de los instrumentos:
    1. Esterilizar las herramientas de micro-disección (2 pares de grandes pinzas Moloney curvos para la apertura de las cáscaras de huevo y sacando embriones, 2 pares de punta fina curvas pinzas Dumont para la eliminación de RPE, un par de Bonn dentado pinzas para quitar la lente y vítreo) por inmersión de la consejos en etanol al 96% y en llamas. Alcance la disección Limpie con trapos mojados en etanol al 70%. Calentar una botella de solución salina equilibrada estéril calcio-magnesio-libre de Hank (CMF-HBSS) en un baño de agua a 37 ° C. Rellene 100 mm placas de Petri estériles a 3/4 de su capacidad con una cálida CMF-HBSS.
    2. Coloque la cámara de electroporación bajo otro microscopio de disección limpia y llena con 120 l de solución de plásmido. Conectar los electrodos al aparato de electroporación, haciendoSeguro electrodo de medida está conectado al polo negativo y el oro con punta de electrodo al polo positivo.
  2. Embrión Colección:
    1. Limpie los huevos limpiando conchas con toallitas húmedas en etanol al 70%. Mantener procedimiento estéril durante todo el resto del protocolo para evitar llevar la contaminación en los cultivos. El uso de grandes pinzas Moloney curvas abrir cuidadosamente un agujero en la cáscara del huevo golpeando suavemente en la punta redondeada de un huevo (más de la cámara de aire) y luego agarre y sacando trozos de concha.
    2. Con otro par de pinzas quitar las membranas y recoger embriones por sacar con pala fuera del huevo (con cuidado de no dañar el embrión). Colóquelo en un plato con CMF-HBSS.
      NOTA: Recoger la mayor cantidad embriones como sea necesario para obtener el número deseado de vasos de la retina para la electroporación como se especifica en 2.4.4
    3. PASO CRÍTICO: Etapa de los embriones de acuerdo a Hamburger y Hamilton 38.
      NOTA: Para obtener embriones óptimos de eficienciadebe ser en la etapa 27 (Figura 2A).
    4. La eutanasia a los embriones por decapitación utilizando fórceps Moloney.
  3. La obtención de Copas de la retina:
    1. Usando pinzas Dumont finas, enuclear cuidado de los ojos y la transferencia a un nuevo plato CMF-HBSS.
    2. A partir de la parte posterior de cada ojo, cerca de la cabeza del nervio óptico y utilizando dos pinzas Dumont finas, introducir un consejo de cada par de pinzas entre la retina neural y RPE y cuidadosamente diseccionar el EPR ser cauteloso para no dañar el neuronal retina (Figura 2B).
      NOTA: La falta de Ca 2+ y Mg 2+ en la solución ayudará a la RPE desprenda de la retina neural más fácilmente.
  4. Electroporación:
    1. Establecer parámetros de electroporador para entregar 5 pulsos cuadrados de 15 voltios, 50 mseg de duración y 950 intervalo de milisegundos. Place 'U' en forma de electrodo negativo dentro de la cámara de electroporación (microcentrífuga tapa de llenadoed con 120 l de solución que contiene el plásmido).
    2. Usando pinzas Dumont curvas transferir una taza de la retina a la cámara de electroporación (por sacar con pala, no presionar), y lo colocan en el interior del electrodo en forma de 'U', con la parte posterior de la retina hacia la parte inferior del electrodo y la lente hacia arriba ( Figura 2D).
    3. Coloque el ánodo de modo que toque la parte anterior del ojo, al lado de la lente, y el uso de pedal de pie del electroporador entregar los pulsos eléctricos.
    4. Transferencia de la taza de la retina a electroporación a una nueva placa de Petri con CMF-HBSS y repita el procedimiento de electroporación con cada uno de los vasos de la retina restantes.
      NOTA: Hasta 6 tazas de la retina puede ser a electroporación con la misma solución plásmido sin una disminución significativa en la eficiencia de la transfección.
    5. Retire el objetivo y el cuerpo vítreo de cada vaso de la retina a electroporación sujetando con pinzas dentadas de Bonn y tirando suavemente a través de tque por alumno apertura mientras mantiene el ojo en su lugar con el dorso de las pinzas Dumont curvas.
    6. Proceder a la disociación y la cultura de las células de la retina electroporación siguientes procedimientos estándar.
      NOTA: Para un protocolo detallado en la disociación y la cultura de células de la retina de pollo se refieren a Vergara y Canto-Soler, 2012, la disposición 4 21 En este protocolo, las células se sembraron a baja densidad en placas de 6 pocillos polyornithine recubiertos o 35. platos -mm (6 x 10 5 células / 35 mm de diámetro, así o plato). El medio utilizado es medio 199 con penicilina / glutamina, 10% de suero de ternera fetal (FCS), y ácido linoleico-BSA a 100 mg / ml. Los cultivos se mantienen en un humidificado 37 ° C incubadora con 5% de CO 2. Usando este procedimiento, 5 - 6 x 10 6 células típicamente se pueden obtener por cada etapa 27 del ojo a electroporación.
      NOTA: Idealmente, no más de 3 horas debe pasar entre recogida de embriones y de las planchas de células, para garantizar una buena supervivencia celulary minimizar el estrés. Un tiempo típico para la observación y el análisis adicional es después de 4 días de cultivo, ya que en este punto que las células han logrado una buena diferenciación morfológica y molecular y la supervivencia sigue siendo alta.

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Representative Results

Aquí presentamos un protocolo sencillo para el plásmido transfección en vasos de la retina de pollo enucleados para el cultivo celular disociada subsiguiente. La transfección se consigue mediante electroporación utilizando fácil de hacer electrodos personalizados (Figuras 1 - 2). Los parámetros descritos en este protocolo se han optimizado para obtener eficiencias de transfección que oscilan entre el 20 y el 27% (con un promedio de 22%) (Figura 3D). Tenga en cuenta que, por las razones expuestas anteriormente, estos resultados se cuantifican después de 4 días de cultivo. En este contexto, la eficiencia de transfección se refiere al porcentaje de células que expresan el transgén dentro de la población total de células. Si sólo se considera la población de los fotorreceptores, las eficacias de transfección aumentan a un promedio de 25% (Figura 3D). Esta es una característica importante ya que estos tipos de cultivos se utilizan principalmente para estudiar los fotorreceptores.

Los cultivos de células que han sido electroporat ed usando esta técnica son indistinguibles de sus contrapartes no a electroporación en su morfología bajo iluminación DIC, características de supervivencia celular, y la expresión de marcadores moleculares tales como visinin (un marcador ampliamente utilizado de fotorreceptores) y Pax6 1.

Figura 1
Figura 1. Fabricación de los electrodos. (A - D) El cátodo está hecho de un filamento caja cuadrada (A), que primero se enderezó (B) y luego se inclinó con una pinza en una 'T' forma cuadrada (C - D). El ánodo es un electrodo con punta de oro de espesor (D); Observe el aislamiento alrededor del electrodo de ánodo, dejando sólo 0,5 mm de la punta expuesta. De configuración (E) La electroporación. El recuadro muestra un aumento mayor del área de caja.pg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Preparación de la retina Copas de electroporación. (A) El polluelo del embrión en el Hamburger y Hamilton etapa embrionaria 27. (B) El EPR se retira cuidadosamente de los ojos enucleados utilizando pinzas Dumont afilados. (C) La copa de la retina a la derecha carece de RPE y listo para la electroporación. (D. ) El electrodo de cátodo se coloca dentro de una cámara de electroporación hecha de una tapa tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno con solución de plásmido. La copa de la retina se transfiere cuidadosamente en el cátodo hacia arriba, y el electrodo de ánodo se coloca en la parte superior, al lado de la lente. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grandede esta cifra.

Figura 3
Figura 3. Eficiencia de la expresión transgénica en células cultivadas después de la electroporación (A - C). Vasos de la retina se sometieron a electroporación con un plásmido de expresión de GFP, disociado y se cultivaron durante 4 días. Micrografías de fluorescencia muestran DAPI manchado núcleos (A) y células de la retina que expresan GFP (B). Tinción de anticuerpos Anti-Visinin se realizó para identificar células fotorreceptoras (C). (D) Gráfico que ilustra la eficiencia de transfección conseguido por ex ovo electroporación, representado como el porcentaje de células que expresan GFP entre la población total de células (DAPI positivo), o entre el fotorreceptor población en particular (Visinin positivo). Los resultados representan la media ± SEM de 5 experimentos independientes. Barra de escala en (A - C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El paso más crítico para el éxito de este protocolo es la selección de la etapa apropiada de los embriones. En publicaciones anteriores, se da una serie de etapas embrionarias de estas culturas, por lo general definido por los días del día de incubación o embrionarias (ED); por lo que se suele suponer que el uso de ED 5 de ED 6 embriones producirá resultados equivalentes. Sin embargo, hemos encontrado que en el escenario 27 (ED 5), la eficiencia de transfección será de alrededor de 22% de la población total de células, como se ha indicado anteriormente; sin embargo, la eficiencia se reducirá hasta 16% si se utiliza la etapa 28 embriones (ED), y 5,5 a 12% en la etapa 29 (ED) 6 1. Otros pasos críticos incluyen mantener condiciones estériles durante todo el proceso; la adquisición de la destreza manual necesaria para evitar daños en la retina durante la disección y electroporación; y evitar las brechas de largo desde el momento de la recolección de los embriones al momento de la siembra celular.

Otra consideración importante para asegurar una buena efficien transfecciónCIES es la concentración de la solución que contiene el plásmido-: el 1.5 g / l recomendada es la concentración más baja que hemos probado que no resultó en una disminución en la eficiencia. Esta concentración se traduce en una alta cantidad de material de plásmido cuando se considera que las tazas de la retina se bañan en esa solución. Utilizando el tamaño más pequeño, así que se acomoda el ojo (tal como un tubo de microcentrífuga de tapa) puede minimizar este problema. Además, varios ojos se pueden electroporación usando la misma solución; no hemos visto una reducción en la eficiencia cuando electroporación hasta 6 tazas de la retina de forma consecutiva en la misma solución plásmido, y mucho más podría ser realizado, pero no podemos dar fe de la diferencia en la eficiencia a partir de entonces.

Protocolos previamente publicados han proporcionado típicamente baja eficiencia de la transferencia de genes de este tipo de cultura, y por lo tanto a menudo tenía que depender de las técnicas que miden el producto de reacciones enzimáticas en un l celularysate con el fin de aumentar la sensibilidad. Este enfoque tiene la desventaja de no permitir la discriminación de tipo celular y de confiar en un bajo número de células que son responsables por el resultado observado, que no siempre puede ser el reflejo del comportamiento de la población de células grandes. Otra forma de eludir el problema de la baja eficiencia es llevar a cabo la transfección génica in vivo, antes de la enucleación del ojo y la cultura. Este es un enfoque viable, pero por lo general sólo se puede aplicar a los paradigmas experimentales específicos, ya que tanto la electroporación de plásmidos y la infección por virus RCAS (un gen de transducción de vector común en el pollo) por lo general se deben realizar en las etapas anteriores del desarrollo, la creación de un desfase entre transfección y la cultura. Esta es una consideración importante, porque durante ese tiempo de retraso las células se exponen a los efectos de tanto el microambiente extracelular, así como factores intracelulares, que tiene implicaciones significativas en la interpretación de la expresultados erimental. En contraste, el aumento sustancial de la eficiencia de transferencia génica conseguido con el enfoque ex ovo electroporación permite el estudio de la función génica en una celda de manera intrínseca. Por otra parte, la ventaja de esta alta tasa de transfección se puede aumentar más cuando se utiliza en conjunción con el análisis de células de alto rendimiento automatizado 1.

En las etapas iniciales del desarrollo de esta técnica, mantuvimos electroporated copas oculares-RPE carente de cultura durante 24 horas para evaluar la eficiencia de la electroporación logrado con diferentes condiciones 1. Aunque no intentamos cultura ellos por periodos de tiempo más largo, nuestra experiencia indica que el protocolo descrito en este documento también se podría aplicar a los estudios que dependen de explantes organotípicos retina, siempre se utilizan las condiciones adecuadas de cultivo de explante a largo plazo.

Finalmente, sería posible ampliar la aplicabilidad de THes ex ovo enfoque electroporación para otros modelos animales. Por ejemplo, en nuestra experiencia transfección de los ojos del ratón en el día postnatal 1 o 4 utilizando este protocolo dado cualitativamente buenos resultados en cultivos de explantes, pero cuando se intentaron cultivos de células disociadas eficacia de transfección era del orden de 6%, similar a la de otras técnicas. Por lo tanto, esto podría ser una alternativa sencilla a otros protocolos para este modelo animal, pero tendría que ser optimizada para el sistema particular si se requieren altas eficiencias. Es de destacar que, como se ha dicho, estado embrionario en el momento de la electroporación fue clave para el resultado de alta eficiencia obtenida en el pollo, por lo que este parámetro se debe considerar cuidadosamente la hora de aplicar la técnica a otros modelos.

En conclusión, el ex ovo técnica de electroporación puede ampliar la aplicabilidad de los sistemas de la retina in vitro como herramientas poderosas para complementar los estudios in vivo, ofreciendo new posibilidades para la investigación de la retina.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

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References

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Biología del Desarrollo Número 105 la retina los fotorreceptores cultivo de células primarias electroporación transfección del plásmido polluelo
Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación
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Vergara, M. N., Gutierrez, C.,… More

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

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