Abstract
중심체는 게놈 무결성을 유지 또는 세포에서 감각 기능을 용이하게하기 위해 차 섬모를 조립하는 유사 분열 스핀들의 기둥 역할을 작지만 중요한 소기관이다. 단백질의 수준은 다른 위치들에서보다 .cellular 중심체에서 다르게 조절 될 수 있고, 세포주기의 여러 다른 지점에서의 centrosomal 단백질 레벨의 변화는 중심 소체 조립체의 적절한 조절에 중요한 것으로 보인다. 우리는 세포주기의 다른 단계에서와 같은 각종 시약으로 처리 한 후 다른 샘플들로부터 고정 된 세포 중심체에서 단백질의 상대 수준의 변화를 측정하는 정량적 형광 현미경 분석법을 개발 하였다. 이 분석의 원리는 소 영역에서의 단백질에 대응하는 배경 보정 된 형광 강도를 측정에 놓여, 및 선택된 실험 C 하에서 변하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 측정을 정상화 그ondition. BrdU의 펄스와 교란 세포주기를 연구 추격 전략과 함께이 분석을 활용하여, 우리는 정량적으로 특별히 중심체에서 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 가능성이 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체에서 규제되고 우리의 최근의 관찰을 검증했다.
Introduction
중심체는 pericentriolar 물질 (PCM)으로 둘러싸인 중심 소체의 쌍으로 구성되어 있습니다. 포유 동물 세포의 주요 미세 소관 조직 센터 (MTOCs)이기 때문에, 중심체는 분할 세포에서 유사 분열 스핀들의 두 기둥 역할을하고, 따라서 게놈 무결성 1을 유지하는 데 도움이. (G0 단계에서 예) 대기 세포에서, 중심체, 즉 머더 중심 소체의 두 중심 소체 중 하나는 일차 섬모, 세포 표면 (2)로부터 돌출 감각 소기관 조립 기부 본체로 변형된다. 일단 세포가 세포주기를 다시 입력 일차 섬모 분해하여 각 중심 소체 서서히 성숙한 중심 소체 (3)을 형성하는 그것의 신장 기단부 procentriole의 조립을 지시한다. S 단계의 개시시에 중심 소체 9 대칭성을 제공 수레 바퀴 형 구조는 기존의 각 중심 소체의 표면에 형성되고, 각각의베이스 procentriole해질 것이다. Sas6의 t중심 소체 조립체 4-6 수레 바퀴의 중심을 형성하기 위해 채용되는 모자 불가결하다. 다른 centriolar 단백질은 말초 방식으로 7 엄격한 규제, 근위부의 수레 바퀴에 조립된다. 정확하게 중심 소체 중복을 완료 한 후, 세포를 G2 단계 (8)의 단부가 두 기능 중심체를 구축하는 추가 물질 pericentriolar 조립한다. 핵심 centriolar 구성 요소 9-11, 키나제, 포스, 보호자, 비계 구성 요소, 멤브레인 관련 단백질 분해 기계 등 여러 가지 다른 단백질뿐만 아니라 세포주기 12-16의 서로 다른 시간에 중심 소체, 기저 기관 및 PCM과 연결되어 있습니다. 그것은 종종 많은 단백질의 centrosomal 레벨이 일시적으로 centrosomal 타겟팅 메커니즘 및 / 또는 중심체에서 프로 테오 저하에 의해 규제된다는 점에 유의한다. 중요한 것은, 이러한 PLK4, Mps1, Sas6 및 CP110의 여러 단백질의 centrosomal 수준의 변동세포주기 t의 상이한 점은 중심 소체 조립체 5,17-22을 조절하는 것이 중요 할 것처럼,이 열화를 방지 centrosomal Mps1의 경우에 과량의 중심 소체 (19)의 형성을 이끈다. 한편, 여러 가지 단백질의 세포질 분획 centrosomal 풀에 비해 덜 불안정하다. 예를 들어 하향 조절 Centrin 2 (Cetn2)의 매개 된 siRNA는 그 전체 셀 레벨 (23)에서 큰 감소에도 불구 중심 소체에서 단백질의 수준이 적당하게 감소되었다. 오히려 그들의 중심체 특정 기능을 평가할 때 전 세포 단백질 수준을 측정하는 것보다 중심체에서 centrosomal 단백질 수준에서의 변화를 측정하는 것이 중요하다.
본 연구에서 우리는 중심체에서 단백질의 상대적인 수준을 정량화하는 간접 면역 형광 (IIF)를 사용하여 분석을 개발 하였다. 이 분석은 다른 샘플로부터 아르 세포를 분석하는데 특히 개발따라서 동시에 묘화 될 수 없다. 이들 샘플은 상이한 시점에서 수집 된 다른 시약 (즉, 약물 대 제어) 처리 한 세포가 될 수있다 (즉, 체이스 대 펄스) 또는 세포주기의 상이한 위상에있다. 이 분석의 원리는 배경 형광 강도 보정 소 영역에서 단백질에 대응하고, 그 레벨 선택 실험 조건에서 변화하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 값이 정상화 측정에있다. 중심체 생물학의 여러 연구는 최근에 후보 단백질 24 ~ 27의 중심체 고유의 기능을 결정하기 위해, 모두 라이브 또는 고정 세포에서 다양한 정량적 현미경 기술을 활용했다. 이러한 분석과 유사하게, 본 기술은 또한 시험 단백질의 백그라운드 보정 된 형광 강도를 측정한다. 그러나,이 분석에서 내부 표준을 사용하여 정규화 포함될 가능성이 큰 것이라고 알려정확성과 커버 슬립 상에 두 개의 서로 다른 두 개의 서로 다른 시료를 분석의 신뢰도. 또한, 중심체의 단백질 수준을 조사 이외에 약간의 조정으로이 방법은 실험 조건의 다양한 세트 또는 다른 부위에서 세포에 적용될 수있다.
여기서 우리는 다른 세포주기 단계에서 세포를 비교하는 BrdU의 펄스 체이스 전략과 우리의 양적 현미경 분석을 결합한다. 대신에, 다양한 세포주기 시점 공부 비동기식 성장하는 세포를 표준 세포주기 정지 및 해제 방법을 사용하는 S 단계에서 세포를 라벨 BrdU를 배양하고, 표지화 된 세포는 다양한 시간 (전형적으로 4-6 시간) 미국 쫓기는. 표지 된 세포의 대부분은 즉시 펄스 후 S 상에있을 것입니다. 체이스 후, 표지 된 세포는 형태 학적 특성 NUC에 대한 중심체의 이러한 된 직후 위치하여 확인할 수 있습니다 늦게 S, G2, 또는 유사 분열에 될 수 있도록 체이스의 길이는 선택레이, 중심체 사이 거리 등의 염색체 축합 따라서, 추적의 길이를 S, G2 및 특정 세포 유형의 M상의 평균 지속 기간에 의존한다. 이 접근법 등 히드 록시, aphidicolin, nocodazole 같은 세포주기 억제제를 방지하기 때문에, 더욱 중요한 생리 학적 세포주기 분석을 허용한다.
따라서, 우리는 단독 정량적 형광 현미경 분석법 또는 BrdU의 펄스 - 체이스 분석과 조합하여, 정확하게 섭동 세포주기 동안 후보 단백질 centrosomal 수준의 상대적인 변화를 측정하기위한 간단하지만 강력한 방법 인 것은 여기에서 설명한다. 우리는이 어 세이를 이용하여, VDAC3, 우리가 최근 16, 28을 미토콘드리아에 부가 중심체에서 식별 centrosomal 단백질 수준을 측정 하였다. 여기에서 얻어진 결과 VDAC3의 centrosomal 풀 저하에 의해 규제되는 우리의 이전의 관찰을 확인하고 또한 세포주기 dependen에 변화t 방식 (16)은 또한이 방법의 적용 성을 검증.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 세포 배양
- 역전사 효소 (는 hTERT) 불후의 망막 색소 상피 세포 인간 텔로 머라 아제를 사용 (의 hTERT-RPE1하면, RPE1 여기 함).
주 : RPE1 세포 일반적 중심 소체 조립체와 ciliogenesis을 연구하는 데 사용되는 근거리 이배체 인간 형질 전환되지 않은 세포이다. 이 세포들은 규제 세포주기와 조정 정상적인 중심 소체 중복주기를 따르십시오. - 통로 1에서 RPE1 세포의 거의 합류 100mm 세포 배양 접시 : 10 ㎖를 함유하는 신선한 100mm 접시에 원래 배양 5 희석 DME / F-12 (1 : 1) 중 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ml의 페니실린 G 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (전체 매체가 DME / F-12 매체로 함). 5 % CO 2 존재하에 37 ℃에서 세포를 성장한다.
- 물 목욕이나 인큐베이터에서 60 ° C에서 흔들림없이 덮여 유리 비커, O / N에서 1 N 염산 50ml에 12mm 라운드 커버 글라스를 품어.
- AF산 용액을 폐기 터가 가끔 흔들어 15 분간 배양하여 커버 슬립을 증류수 100㎖를 세 번 씻는다. 70 % 에탄올 및 95 % 에탄올 중의 마찬가지로 세탁을 반복.
- 개별적으로 60 분 동안 자외선으로 살균 다음에 생물 안전 캐비닛의 실험실 블로 팅 종이에 그들을 밖으로 확산으로 된 커버를 건조시킵니다.
- 35mm 세포 배양 접시에 2-4 건조 된 커버를 놓습니다. 세포 배양 물에서 25 μg의 PBS / ㎖의 농도로 엔지니어링 중합체 (1 ㎎ / ㎖의 스톡 농도) 등 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 용액을 희석.
- 각 커버 슬립에 희석 된 용액의 80 ~ 100 μl를 놓고 코트에 60 분의 coverslip의 상단 동안 품어. 전체 매체를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 삼배 된 커버를 세척 할 것.
2. 성장 세포와 프로 테아 좀 억제제 치료 세포
- 항로 2 × 10 5 비동기 적으로 성장각 35mm 접시 ING RPE1 세포는 커버 슬립을 함유하는 2 ml의 완전 배지에서 세포를 성장한다. 배양액에게 신선한 미리 예열 완료 매체와 매 24 시간을 교체합니다.
- 시험 단백질의 수준에 centrosomal 테아 좀 억제의 효과를 분석하는 (여기 VDAC3 또는 튜 불린-γ)은 44 시간 동안 두 35mm 접시에서 세포를 성장한다. 완전 배지로 배지를 교체하고, 각각 5 μM 또는 0.05 %의 최종 농도 제어 MG115 또는 용매로서 DMSO를 추가한다. 동시에, 4 시간 동안 세포를 40 μM의 최종 농도로 세포를 BrdU의 추가 배양한다.
- 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송합니다. 각 웰에 500 ㎕의 냉각 메탄올을 추가하고 10 분이 된 커버에 세포를 해결하기 위해 -20 ° C에서 접시를 품어. 즉시 된 커버 500 μL 세척 버퍼로 3 회 세척 (0.5 mM의의 MgCl 2와 0.05 %를 포함하는 1X PBS를 트리톤-X 100).
- 잔류를 수확35mm 접시 원심 분리기 5 분 1,000 XG에 세포에서 세포. 웨스턴 블롯 (단계 6)에 의해 전체 단백질을 분석하기 위해 세포 펠렛을 사용한다.
3. BrdU의 펄스 체이스 분석은 다른 세포주기 단계에서 단백질 수준을 분석하기 위해
- 44 시간 동안 커버 슬립을 함유하는 두 개의 35mm 접시에서 세포 성장, 세포주기의 다른 단계에서의 중심체에서 단백질 (VDAC3 여기서, Sas6 또는 Cep135)의 레벨의 변화를 분석한다. 40 μm의 BrdU의를 포함하는 완전한 매체와 문화 매체를 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 세포를 배양한다.
- 한 접시에서, 단계 2.1.2에서 설명 된 바와 같이 냉각 된 메탄올을 사용하여 세포를 고정하는 24- 웰 플레이트로 커버 슬립을 전송.
- 4 시간의 BrdU의 펄스 후, BrdU를 함유 배지를 제거 PBS로 한번 세포를 세척하고 완전 배지로 한번, 다양한 시간 (전형적으로 추가의 4 시간 동안의 BrdU의 부재 하에서 세포를 새로운 배지를 추가하고 성장할단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 세포를 고정하기 전에 RPE1 세포)에 대한.
주 : RPE1 전지, BrdU의 양성 세포의 대부분은 4 시간 후 체이스 늦은 S 또는 G2 상에있다. 이는 각각의 세포 유형에 대해 독립적으로 결정되어야한다.
4. 면역 염색
- 30 분 동안 (1X PBS로 2 % BSA 및 0.1 % 트리톤-100)을 블로킹 완충액 200 μL의 고정 된 커버에 세포를 배양한다.
- 차 항체가 혼합 된 세포를 품어 가습 실에서 4 ° C에서 버퍼 O / N 차단에 희석 (일반적으로 한 토끼에서 제기하고 다른 마우스에서 제기).
- 가습 실을하려면 빈 1,000 μL 피펫 팁 상자의 아래쪽에 젖은 종이 타월을 넣어. 랙 파라 필름의 표면 상에 스트립을 마련하고, 배양 될 각 커버 슬립에 대해 파라 필름 상에 항체 용액의 액적 (15 ~ 20 μL)을 더럽힐. 항체 용액의 방울에 커버 슬립을 반전 (세포 몰입되도록) 및 close팁 상자의 뚜껑.
- 다시 된 커버 전환하고, 24 웰 접시에 그들을 다시 돌아갑니다. 된 커버를 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 (녹색 형광 염료 복합 항 - 토끼와 붉은 형광 염료 복합 항 - 마우스가 버퍼를 차단에 희석 여기) 150 μL 차 항체 혼합물에서 그들을 품어. 커버 슬립을 세 번 씻으십시오.
참고 : 형광 접합 차 항체 광 감응성. 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호 4.1.3-5.1.2.
- 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이, 10 분 동안 -20 ℃에서 500 ㎕의 냉각 된 메탄올로 다시 염색 RPE1 세포를 고정함으로써 방지 BrdU의 염색을 위해 준비한다. 세 번 된 커버를 세척 할 것.
주 :이 고정은 다음의 단계에서 산 가수 분해 과정에서 관심 단백질 (들)의 일차 및 이차 항체 표지를 고정.- RT에서 30 분 동안 2 N 염산 200 μL에서 세포를 배양한다. 1 M 트리스 (CL)의 300 μL, pH를 8로 중화세포를 세척 완충제로 3 회 세척 좋아.
- 다시 RT에서 30 분 동안 블로킹 완충액 200 μL를 사용하여 세포를 차단.
- 가습 챔버 내에서 37 ° C에서 45 분 동안 (블로킹 완충액에 희석) 래트 항 BrdU의 항체로 세포를 배양한다. , 24 웰 접시에 다시 된 커버를 돌려 그들을 씻어 준 후 실온에서 1 시간 동안 24 잘 접시에 버퍼를 차단 150 μL에 희석 블루 형광 염료 복합 항 쥐 이차 항체 (에 품어.
- 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 유리 현미경 슬라이드에 antifade 시약을 함유하는 용액의 장착 방울 (약 3-6 μL)를 스팟. 셀 측이 장착 솔루션에, 아래로 향하게하여, 커버 슬립을 반전. 부드럽게 부드러운 세정 티슈를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 눌러 물기를 닦아주십시오. 현미경 슬라이드에 그것을 밀봉 커버 슬립의 가장자리를 따라 투명 매니큐어를 적용합니다.
5. 면역 형광 이미지 Acquisition 및 분석
- 상온에서의 BrdU 양성 RPE1 세포의 이미지를 획득 (1.4 개구 수) 100X 계획 아포 오일 침지 목표를 사용합니다.
- 디지털 이미징 할 수있는 카메라에 부착 된 현미경 (장비 참조)에 슬라이드를 넣습니다. 각각의 형광의 경우, 수동으로 실험의 모든 샘플을 검사하여 (일반적으로 300 - 1,000 밀리 초 사이) 적절한 노출 시간을 결정합니다. 셀의 이미지를 획득하기 전에 수동으로 Z 축 (일반적으로 0.2 μm의 스텝 크기)에 따라 적절한 상단과 하단에 초점면을 결정합니다. 디지털 현미경 이미징 소프트웨어 패키지를 이용하여 Z 축을 따라 서로 다른 형광 물질에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 분리 된 커버에 서로 다른 샘플의 이미지를 수집.
- Z 축을 따라 취득한 모든 화상 스택 (아니오 이웃 알고리즘을 사용하지 않고 이러한 경우) 디콘 볼 루션을 수행한다.
- 따라서 각 이미지 스택의 총 강도 투영을 구하는Z 축.
- 중심체가 (두 중심체 사이의 거리가 2㎛ 미만이다) 가까이있는 세포에서 두 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 20 ~ 30 픽셀)를 그리는 선택 영역을 표시합니다.
- 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 일반적으로 24 ~ 35 픽셀)를 그려 큰 사각형의 선택 영역을 표시합니다.
- 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)을 얻었다 (S 작은 박스를 나타내고, L은 큰 상자를 나타낸다).
- . 하웰 등 (29)에 의해 설명 된 공식을 사용하여 각 형광의 배경 보정 형광 강도를 분석 : F = F S - [(F의 L - F S)는 S / (A L를 - S) ×].
- 그 FL의 배경 보정 형광 강도의 비를 계산함으로써 관심 (여기 VDAC3 또는 Sas6)의 단백질의 정규화 형광 강도를 구하는(여기에 γ-tubulin에, Sas6 또는 Cep135) 선택 내부 표준에 사용되는 형광의 그것과 uorophore.
- 중심체가 잘 분리되는 경우 세포 분석의 경우, 두 개의 분리 된 박스의 도면 세트를 각각 별도로 분석 중심체 (두 중심체 사이의 거리가 큰, 2㎛ 이상이다). 각 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 15 ~ 25 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 20 ~ 30 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다.
- 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)를 얻어, 단계 5.3.3에서 설명 된 바와 같이, 각각의 중심체 별도로, 각 형광 물질의 배경 형광 농도 보정을 계산한다.
- 그 셀에서 해당 단백질의 총 centrosomal 레벨을 얻기 위해 두 중심체에서 각 단백질의 배경 형광 농도 보정 수확기.
- 취득내부 표준 물질의 총 centrosomal 강도 총 centrosomal 강도의 비율을 계산하여 관심 단백질 정규화 강도.
- 각 실험 조건에 대해 적어도 15-25 세포를 분석하여 스프레드 시트의 그래프를 플롯.
6. 웨스턴 블로 팅을 사용하여 총 단백질 분석
- 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 % Nonidet P-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함하는 (RIPA) 버퍼 radioimmunoprecipitation 분석에서 세포를 재현 탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션 용균.
- 10 분 동안 10,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하여 펠릿 분획으로부터 해물을 분리 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 키트를 사용하여 각 분해물의 총 단백질 농도를 측정한다.
- 4X SDS-PAGE 로딩 완충액 (50 mM Tris-CL, pH가 6.8, 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 100 mM의 디티 오 트레이 톨, 0.1 % 브롬으로 40 μg의 해물 믹스) 블루 ophenol.
- 10 분 동안 샘플을 비등 200 V.의 정전압으로 SDS-PAGE 변성 12.5 %의 샘플을 실행할
- (냉간에서 1 시간 90 V의 정전압) 웨스턴 블로 팅 기법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 상으로 SDS-PAGE상에서 분리 된 단백질을 전송.
- 1X PBS에서 3 % 무 지방 우유 멤브레인을 차단 한 다음 1 (이 경우 토끼 방지 VDAC3, 토끼 반 γ-tubulin에와 마우스 항-α-tubulin의)에 희석 차 항체의 솔루션을 막을 배양 실온에서 시간.
- 멤브레인을 PBS-T 완충액 3 회 (진탕 각 5 분 인큐베이션) 세척 한 후 (1X PBS 및 0.2 %의 트윈 -20), 근적외선 (IR) 형광 염료 공액 항 - 토끼의 혼합물에 막을 부화 1 시간 동안 (PBS-T에 희석) IR 형광 염료 공액 항 - 마우스 이차 항체.
- 막 세 번 세척 한 후 적외선 F를 사용하여 대역을 분석 막을 검색면역 검출에 적합한 luorescence 촬상 시스템.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리의 최근의 연구 VDAC3, 미토콘드리아 porins 16, 28 중 하나의 새로운 centrosomal 현지화 및 기능을 확인했다. VDAC3 특이 항체를 이용한 RPE1 세포를 포함한 여러 포유 동물 세포의 면역 염색 띄는 centrosomal 염색 비교적 약한 미토콘드리아 염색을 보여 주었다. 우리는 또한 centrosomal VDAC3이 우선적으로 어머니 중심 소체 및 내인성 모두의 centrosomal 풀과 연관된 및 ectopically VDAC3이 저하 (16)에 의해 규제되는 표현되는 것을 보여 주었다. 양적 IIF 분석을 검증하기 위해 우리는 S 상에있는 세포의 중심체 관련 VDAC3 풀의 변화를 조사했다.
여기서, 비동기식 성장 RPE1 세포는 프로 테아 좀 억제제 MG115 또는 4 시간 동안 제어 중 DMSO 용매로 처리 하였다. S 상과 중심체 어셈블리를 겪고에있는 세포에 대한 우리의 분석을 제한하려면, 우리는 BrdU의 뒤 통합 세포를 검사같은 4 시간에 전화하고 (서로의 2 μm의 내 간격)가 모여 중심체했다. 우리는 MG115의 간단한 치료는 BrdU의 혼입 처리 대조군에 비해 (약 58 %)에 영향을주지 않았다고 결론을 모두 제어 및 MG115 처리 (그림 1A)에서 BrdU의 스테인드 세포와 핵의 여러 확률 필드를 검사 (약 56 %) RPE1 세포에서. 우리가 (서로의 2 μm의 내 간격이 γ-tubulin의 병소의 존재로 판단) S 상에 있던 유일한 세포를 비교했다, 우리는 정상화에 대한 잠재적 인 내부 표준으로 γ-tubulin의를 고려했다. BrdU의 양성 세포에서 튜 불린 centrosomal-γ 수준은 프로 테아 좀 억제 다를 경우에 따라서, 우리는 먼저 조사했다. 당연히,이 하나의 셀에서 다른 γ-tubulin의 형광 강도에 상당한 세포 간 변화는, 그리고 우리는이 변화가 가장 전체를 사용할 수로 설정 데이터를 표시 상자와 수염도에서 제시 한 것을 발견했다. 나는N 박스 및 위스커 다이어그램, 상자가 하부 및 상부 분위수를 나타내고, 박스 내의 마커는 각 계열의 중앙값을 나타내고, 위스커 (항상은 아니지만) 종종 특이점이다 최소값과 최대 값을 나타낸다. 그림 1D에서 볼 수 있듯이, centrosomal γ-tubulin의 수준은 따라서이 실험에 대한 내부 표준으로 γ-tubulin의 유효성을 검사, MG115 또는 DMSO 중 치료의 BrdU 양성 세포 사이에 유의 한 차이가 있었다. 튜 불린-γ를 달리 centrosomal VDAC3 대응 배경 보정 된 형광 강도는 대조군 세포 (도 1C)에 비해 MG115 - 처리 된 세포에서 높은 2.5 배 정도였다. 우리는 γ-tubulin의의에 대하여 총 VDAC3 형광을 정규화 할 때, 배 증가는 대략 두 배 (그림 1E)로 약간 떨어졌다. 배 변화가 정상화하지 않고 더 큰했지만, 우리는 우리가 BETT을 느낄 정규화 된 데이터의 정확성에 더 자신감을 가지고때문에 샘플 처리 MG115 치료뿐만 아니라 변화의 일반적인 효과에 대한 어 제어합니다. 비 centrosomal 사이트 (그림 1B) 또는 VDAC3 (그림 1 층)의 총 세포 수준에서 VDAC3 염색 프로 테아 좀 억제에 의해 영향을받지 않았다. 따라서, 우리는 정량적 VDAC3의 centrosomal 풀 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 조절된다 우리의 이전의 관찰을 확인합니다.
세포주기 동안 centrosomal VDAC3의 변화를 측정하기 위해, 우리는 표지화 된 세포의 4 시간 체이스이어서 4 시간의 BrdU의 펄스 세포를 표지 하였다. 이후 만 S 상 세포가 펄스 동안 BrdU의를 통합 할 예정 늦게 S-단계 또는 초기 G2 단계 중 하나에있을 것입니다 4 시간 체이스 후 BrdU의 양성 RPE1 세포의 대부분 ((두 중심체 사이의 평균 거리가 ± 0.16 μm의 1.35) 두 중심체 사이의 평균 거리가 늦게 G2 단계에서 작은 인구) 1.55 ± 0.22 μm의입니다 센트일부 쌍은 크게 30 (두 중심체> 2 μm의 사이의 평균 거리)로 분리했다. γ-tubulin의 주요 PCM 구성 요소가 크게 G2 단계 (31, 32)에서 발생하고, 이러한 증가는 다른 centrosomal 단백질의 세포주기 변화를 평가하는 가난한 내부 표준하게 중심체 성숙하는 동안 중심체에 축적되고. 한편, Sas6는 수레 바퀴 4,5,7의 조립을 자극하는 초기 S-단계 procentrioles 모집하고, 그것을 (도 2 저하하기 시작하면, 세포 유사 분열을 입력 할 때까지 새롭게 형성된 중심 소체의베이스에 남아 참조 5). 세포가 G2 단계 5 S-단계에서 진행 그러나 헬라 또는 U2OS 세포에서, Sas6의 centriolar 수준은 점차적으로 증가한다. 따라서, 우리는 제 Cep135, 중심 소체의 기단부에 걸쳐 편재 다른 코어 단백질의 centriolar에 대하여 centrosomal Sas6 레벨을 측정세포주기 (33). 중심체가 근접한 경우 우리는 (그림 3A-D를 펄스 또는 추적에서의 BrdU 양성 RPE1 세포에서 Cep135 또는 Sas6의 배경 보정 총 형광 강도에 유의 한 차이가 관찰되지 않았다 두 사이에 '가까운'세포의 평균 거리 중심체는 2㎛ 미만)이다. 따라서, 정규화 Sas6 레벨은 이들 세포 (도 3E)에 비슷한 남았다. 그러나, 우리는 Sas6의 전체 형광 강도 값의 완만 한 증가 (; '먼'세포 두 중심체> 2 μm의 사이의 거리) 중심체가 잘 분리 된 세포에서 Cep135에 대해 동일한의 약간의 증가를 관찰했다. 따라서, 두 개의 잘 분리 중심체와 세포의 정규화 된 총 centrosomal Sas6 수준은 약간 이었지만, 가까이 위치한 중심체와 세포에 비해 통계적으로 유의하게 높았다. 이는 Sas6 수준 위트의 고유 한 규제 가능성H 세포주기 진행 5. 그러나, 약간의 증가 (이 이하 통계적 유의성의) 가깝게 이격 된 중심체 셀들에 동시에 두 중심체를 분석 비교하여, 별도로 분석 하였다 개의 중심체의 형광 농도 첨가에 기인하는 것도 가능하다. VDAC3의 형광 강도 단독 Sas6의로 정규화했을 때 그럼에도 불구하고, 두 개의 밀접하게 이격 된 중심체에서 VDAC3 레벨은 초기 S 상에 비해 늦은 S- / 조기 G2 상에있는 셀이 대략 1.5 배 증가시켰다 세포 (그림 4A-C, F, '가까운'셀). 이러한 세포가 G2 늦은 위상 진행되면, 두 중심체에서 정규화 VDAC3 레벨 늦은 S 상 (도 4C, F)에 비해 2.4 배 감소 하였다.
Sas6 수준이 늦은 S-G2 상으로부터 약간 증가하기 때문에, 내부 표준을 사용하여 Sas6 년 12 약간의 과대 평가를 초래G2 후반 단계에서 세포 VDAC3 수준 rease (중심체는, 2㎛ 이상에 의해 분리된다). 우리의 데이터가 Cep135가 더 나은 선택이 세포주기 변화를 평가하기위한 내부 표준임을 시사 동안 우리가 사용할 수있는 VDAC3과 Cep135 항체가 모두 토끼에서 있기 때문에, 우리는 VDAC3에 사용할 수 없습니다. 그러나 Cep135 정규화 Sas6의 중간 값으로 Sas6 정규화 VDAC3 (F VDAC3 / F Sas6)의 중간 값을 곱하면 우리에게 Cep135 정규화 VDAC3 [(F VDAC3 / F Sas6) x의 대략적인 값 (F Sas6을 / 제공 F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. 우리는이 분석, 후반 S / 초 G2 늦은 G2 사이 VDAC3 수준의 변화를 수행 할 때 2 배에 약간 떨어진다. 응축 된 염색체 약한 Sas6 염색으로 판단하여 유사 분열의 모든 단계에 BrdU의 양성 세포 인해 Sas6 수준의 극적인 하락, 우리의 분석에서 제외됩니다. 그러나, 우리는 지적이 centrosomal VDAC3 수준의 재유사 분열을 유지 한 동안에 로우 (데이타 미기재). Cep135 수준이 유사 분열 중에 제거되지 않기 때문에 (도시되지 않음), 본 발명자는 원칙적으로 유사 분열 Cep135 정규화 VDAC3 레벨을 추정하기 위해 재 - 정규화 과정을 반복 할 수있다. 그러나, 현실에서 유사 분열의 centrosomal Sas6 수준은 처음에 Sas6 정규화 VDAC3 수준의 정확한 결정을 허용 너무 변수했다. 에 관계없이 전반적으로, 우리의 데이터는 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체로 조정되어 있는지 확인.
도 1 비동기 성장 RPE1 세포를 4 시간 동안의 BrdU 및 MG115 (MG) 또는 DMSO (DM)와 함께 배양 하였다. (A) 표시됨 항 BrdU의 항체 (적색) 및 훽스트 (물들 랜덤 처리 DMSO 또는 MG115 분야 세포 아르 DNA, 파란색). 여기에 다른 모든 이미지의 막대는 5 μm의를 나타냅니다.(BE) DMSO 또는 MG115은 세포 VDAC3, γ-튜 불린과 BrdU에 대한 항체로 염색 처리 하였다. BrdU의 양성 세포가 동일한 촬영 조건에서 몇 군데 있었다 (노출 푸른 형광 / BrdU의 400 밀리 초 때때로는, 녹색 형광 / VDAC3 500 밀리 초 적색 형광 / γ-tubulin의 300 밀리 초), 및 배경이 VDAC3의 형광 강도를 수정하고 γ-tubulin을 결정 하였다. VDAC3 보여주는 대표 이미지 (VD3, 녹색), γ-tubulin의 (γ-욕조 적색)과 BrdU의 (파란색)는 (B)에 표시됩니다. 사각형으로 표시된 바와 같이 여기에 다른 모든 이미지에, 세트 디지털 중심체 확대 표시합니다. 배경 수정 형광 강도 (F, 임의의 단위) 스물 다섯 세포에서 VDAC3 및 γ-tubulin의에 해당하는 각각 상자와 수염 (C)의 다이어그램 (D)에 그려집니다. 여기서 모든 다른 경우에는, 상자, MA를 하부 및 상부 나타내는 분위수(-) 상자 rker 각 시리즈의 중앙값을 나타내고, 수염은 최소 및 최대 값을 나타낸다. 그 스물 다섯 VDAC3 세포로부터의 노멀라이징 형광 강도 값 (E) 그려진다. (CE)의 경우, P 값은 짝 t 검정에서 파생된다. ***는 페이지 표시 <10-5, 그리고 NS는 페이지 표시> 0.05. (F) α-tubulin의 (α-욕조) 컨트롤을로드 VDAC3 (VDAC3a 및 VDAC3b 16 두)와 γ-tubulin의 (γ-욕조)의 전체 세포 수준을 보여주는 면역 블롯. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
4 시간 브롬으로 표시 한 그림 2. 비동기 적으로 성장 RPE1 세포(γ-욕조, 빨간색) 뒤 펄스와의 BrdU의 부재에 다른 4 시간 동안 쫓아가 Sas6 (녹색) 및 γ-tubulin에 대한 항체로 염색 하였다. 대표 이미지는 두 개의 가까이로 ((A) S-단계에서 Sas6 염색을 보여 Sas6의 초점), (B) 중기 (극에서 두 약한 Sas6의 초점)와 (C) telophase (Sas6의 초점이 극에서 손실됩니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
400 밀리 초 때때로는 Cep135 및 Sas6 스테인드 그림 3. 비동기 적으로 성장 RPE1 세포의 BrdU의 부재에 다른 4 시간 동안 4 시간의 BrdU의 펄스으로 표시하고 추격했다. BrdU의 양성 세포가 동일한 이미징 조건에서 몇 군데 있었다 (노출파란색 형광 / BrdU에 대한; 녹색 형광 / Cep135 400 밀리 초; 빨간색 형광 / Sas6) 및 Sas6 및 Cep135의 배경 보정 형광 강도 500 밀리 초는 측정 하였다. 두 중심체 간의 거리는 모든 세포에서 측정 하였다. 두 중심체 사이의 거리가 2㎛ 미만이다 셀 '확대'과 값 이상이고, 2㎛가 '먼'으로 분류 된 것으로 간주 하였다. (AB) Cep135 (C135, 녹색)를 표시하는 대표 이미지는, Sas6 (적색)과 BrdU의 (파란색)가 표시됩니다. (B)에서, C1 및 C2는 대표 '먼'셀의 두 중심체이다. (CD) 배경 수정 형광 강도 (F, 임의의 단위)를 각 범주의 다섯 세포에서 Sas6 (C) 및 Cep135 (D)에 대응하는 상자와 수염도 그려진다. (E) 이리저리 Sas6의 정규화 된 강도m 그 세포는 상자와 수염도 그려진다. (CE)의 경우, P 값은 짝 t 검정에서 파생된다. * <0.001, P <0.05를 나타내고, NS는 P> 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
녹색 형광 / Sas6 500 밀리 청색 형광 / BrdU의 400 밀리 초 때때로는 VDAC3 및 Sas6 스테인드 그림 위의 BrdU의 펄스 체이스 분석 4. BrdU의 양성 세포 (그림 3) 동일한 이미징 조건에서 몇 군데 있었다 (노출; 적색 형광 1000 / 대 밀리 VDAC3), 및 Sas6 VDAC3 및 배경 보정의 형광 강도가 두 중심체 간의 거리는 모든 셀에서 측정하고, 세포는 'C로 분류 하였다. 측정 하였다'(두 개의 중심체 <2 μm의 사이의 거리)'먼 '그림 3과, (2 μm의 두 중심체 사이의 거리>). (AC)의 대표 이미지'BrdU의 펄스 (A)에 가까운 '셀에 손실 BrdU의 체이스 (B), 및 VDAC3 스테인드 BrdU의 체이스 (C)의 '먼'셀 (VD3, 녹색), Sas6 (적색)과 BrdU의 (파란색)가 표시됩니다. (C)에서, C1 및 C2는 두 중심체이다. [DE] 배경 수정 형광 강도 (F, 임의의 단위) 각 범주의 다섯 세포에서 VDAC3 (D) 및 Sas6 (E)에 대응하는 상자와 수염도 그려진다. 그 세포에서 VDAC3의 (F) 표준화 강도는 상자와 수염도 그려진다. (DF)의 경우, P 값은 짝 t 검정에서 파생된다. *** **, P <10-5 나타냅니다10-5 <P <0.001을 나타내고, NS는 P> 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
세포 생물학의 양적 현미경은 일반적으로 고정 된 다른 양적 현미경 분석을 개발하고 세포 생물학의 성장 사례가있다, 그러나 등 (FRAP) 광표백 후 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 형광 복구와 같은 라이브 세포 이미징 분석과 연관된 최근 몇 년 동안 27,34-36 세포. 중요한 것은, 중심체 생물학을 이해 진행은 종종 centrosomal 풀을 다른 풀과 다르게 조절 될 수있다 단백질의 중심체 특정 기능에 대한 이해가 필요합니다. 따라서, 우리는 특별히 다르게 취급 두 시료에서 단백질의 상대적인 수준을 centrosomal 분석 IIF 정량 분석법을 개발 하였다. 이 세포가 분리 된 고정 된 커버에 처리되는 것을 요구하기 때문에, 우리는 따라서 두 experime 인해 취급 필요성 가능한 아티팩트에 더 정규화 제어의 목적으로 내부 표준 도입ntal 세포 집단은 별도로하고, 분석의 정확성을 증가시킨다. 시험 단백질의 상대적 형광 강도를 측정하는 등의 내부 표준을 사용한 이전 연구 몇 37 만있다.
내부 표준을 선택하는 것은 우리의 분석의 정확성을 위해 매우 중요하지만, 틀림없이 가장 어려운 측면이다. 이상적으로, S-단계에서 중심 소체 쌍 중복 및 중복 중심 소체는 두 성숙한 중심체가 방추사의 자극을 변환 할 수있다 G2 중 γ-tubulin에 PCM 등의 추가 성분을 축적. 따라서, 우리는 γ-tubulin에의 centrosomal 수준 S-단계에서 엄격 세포에서 크게 변하지 않을 것이라고 가정한다. 이 S 상 세포를 BrdU의 짧은 라벨로 표시되어 RPE1 셀의 경우 일 것 같다. 그러나, 내부 표준 물질의 유효성은 각 세포 유형 및 실험 조건에 대해 테스트되어야한다. 예를 들어, 동안 배경 - 이리와! 빨리cted VDAC3 형광도 보충 centrosomal γ-tubulin의 작지만 통계적으로 유의 한 (P <0.001 값 <0.05) 증가 (이 있었다 (S 상 체포) U2OS 세포를 치료 aphidicolin의 억제를 프로 테아에 대한 응답으로 두 개 이상의 배 증가 그림). 따라서, γ-tubulin에 심지어는 세포주기에 체포 세포, 항상 적절한 내부 통제하지 않습니다.
다른 모든 IIF 현미경 분석과 유사하게,이 분석의 단점 중 하나는 시험 단백질 및 내부 표준에 대한 항체가 다른 숙주 종에서 발생되어야한다는 것이다. 우리의 데이터가 Cep135가 Sas6보다 더 나은 내부 표준임을 시사 동안, 우리는 모두 토끼에서 제기 된이 단백질에 대한 항체로 사용할 수 Cep135에 대한 VDAC3 수준을 정상화 할 수 없습니다. 따라서, 우리 말 S-위상과 G2 사이 VDAC3 수준의 감소의 과대 평가를 발생 Sas6 상대로 대신 정규화. 여기서 INTE 상황에서rnal 표준은 그 변화를 설명하기 위해 다른 정규화 계수를 도입 할 수있다, 겸손하게 다릅니다. 예를 들어, Sas6의 변동을 보정하기 위해, 우리는 Cep135 정규화 Sas6 강도에 의해 Sas6 정규화 VDAC3 강도를 곱한.
적절한 내부 표준을 선택하는 것이 어려운 경우, 형광 염료 코팅 된 마이크로 스피어 (0.02-0.04 μm의 직경)는 다른 전략을 제공 할 수있다. 관심 셀과 동일한 필드에 존재 형광 마이크로 스피어의 신호는 관심있는 단백질에 대응하는 형광 신호를 정규화하기 위해 사용될 수있다. 테스트 및 제어 셀 함께 묘화하는 경우 한편, 하나는 정규화 이러한 내부 표준를 필요로하지 않을 수있다. 우리는 이전에 19을 방지하거나 (20)에게 degr을 추진 중 19 Antizyme (20)를 과발현 중 하나 사이클린 세포에서 Mps1의 centrosomal 수준을 비교하기 위해이 분석의 버전을 사용하고 있습니다동시에 묘화 인접 형질 감염되지 않은 세포에서의 것과 각각 중심체, Mps1에서의 adation.
프로 테아 좀 억제시 centrosomal VDAC3의 효과를 조사하기 위해, 우리는 S 상에있는 세포를 확인하고 비교하기의 BrdU 라벨링을 사용했다. MG115 처리는 세포주기 진행을 억제 할 수 있지만, 이러한 억제는 상당히 높은 농도로 본 연구에서 사용 된 것보다 38이 필요하다. MG115은 세포주기 체크 포인트 및 전환을 차단할 수 있지만, 세포주기 진행을 차단하지 않고 여기에 사용 된 농도. 우리 MG115은 DMSO에 비해의 BrdU 양성 세포의 비율을 변경하지 않았 음을 표시하여 여기 한 그러나, 즉, 각 세포 유형에 대해 검증되어야한다. 그러나 aphidicolin 또는 하이드 록시 (HU)를 사용 또는 '오프 흔들어'와 해제 또는 더블 티미 딘 블록과 릴리스는 동등한의 popula을 생성하는 다른 방법으로 사용할 수 있습니다 유사 분열을 사용하여 세포를 동기화 S-단계에서 세포를 체포S 단계에서 세포 등이있을 경우.
세포주기의 시점을 연구 BrdU의 펄스 - 체이스 전략은 세포주기 교란을 필요로하는 많은 기능 분석에 매우 유용 할 것이다. 이것은 다양한 세포주기 억제제를 사용하여 세포주기 정지 기술을 대체 할 수있을 것보다 중요한 생물학적 분석법이다. 이러한 억제제의 사용은 종종 세포주기의 비정상적인 표현형의 변화의 결과로 세포에서 생리적 스트레스의 다른 유형을 일으킬 수있다. 펄스 추적 방식의 사용은 이전의 연구 (23)에 의해 제안 된 전체 블록의 원인에 반대 중심 소체 어셈블리 (39)를 지연 Cetn2의 고갈을 입증 할 수있었습니다. BrdU의 양성 세포를 검출하는 것은 샘플의 산 가수 분해를 필요로한다. 우리와 다른 많은 연구자들이 기술 사용 differen에 대한 염색 강도의 미미한 손실, 테스트 단백질, 이전에 산 가수 분해에 대한 기본 및 보조 염색 한 후 세포를 다시 수정중심체 단백질 40 톤. 그러나, 잠재적 인 대안은 DNA (41)를 효율적으로 복제 BrdU의 혼입 유사한 -5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘 (EDU), 또 다른 티미 딘 유사체를 사용하는 것도 될 수있다. EDU는 화학을 클릭 '사용의 시각화는 "산 가수 분해 (42)를 필요로하며, 일부 항체 수도 있으므로 적합하지 않습니다.
또한,이 분석은 쉽게 중심체에서 특정 단백질의 번역 후 변형의 변화를 측정하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 인산화 수준 centrosomal 인산화 부위 특이 적 항체가 존재 함을 제공 단백질 자체의 전체 수준에 대하여 정규화 될 수있다. 상기 분석은 즉시 실험 조건 또는 세포주기 단계 사이의 상대적인 인산화 수준을 평가에 적용 할 수 있지만, 잠재적으로 인산화 수준을 총 평가에 적용 할 수 있다면, 임계 파라미터의 항체 affinities는 공지되거나 결정될 수있다. 관심 영역이 너무 크지 않아야하지만,이 분석은 또한, 세포의 다른 사이트에서 단백질의 연구에 적용해야합니다. 분석은 여러 부위에 세포 편재 단백질의 위치 별 변조를 측정하는 것이 특히 유용 할 것이다.
이러한 측정 (43)의 정확도를 최대화하도록 고려 취해 져야 등 차동 광표백, 디지털 이미징의 효과, 형광체의 형광 농도의 선형성, 배경 잡음 등의 기술 파라미터의 소수가있다. 예를 들어, 광표백은 하나의 기여를 평가하기 위해 각 이차 항체와 관련된 형광 색소를 전환 할 수있다. 많은 다른 매개 변수들이 한 동일 묘화 조건 (노출 시간, 게인, 스텝 사이즈, Z-스택 등의 번호)와 각 촬상 런 같은 이미징 소프트웨어를 사용하는 경우를 제어 할 수있다. 우리가 사용되지만화상 컨벌루션을 수행하기 위해 우리의 분석 전반에 걸쳐 노 이웃 알고리즘은이 분석을 반복 제약과 같은 다른 컨벌루션 알고리즘과 결합 될 수있다. 또한 가장 일반적으로 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어는 형광 강도와 거리의 분석 도구가대로, 서로 다른 이미징 소프트웨어 패키지에 임의의 수의 분석이 적응하기 쉽게한다는 것을주의한다.
이 분석은 세포 유형에 적용해야하고, 여기에 세포의 우리의 선택은 순전히 중심체 생물학 연구 관련성 및 centrosomal VDAC3 기능 16, 28의 우리의 이전 시험에서의 사용을 기반으로합니다. 그러나, 펄스 - 체이스 용 내부 표준 물질 및 적절한 시간의 유효성은 각 세포 유형에 대해 결정되어야 S 상, G2 또는 유사 분열에서 세포의 동정을 행 하였다. 전반적으로, BrdU의 펄스 체이스 분석과 함께 우리의 새로 개발 된 정량적 형광 기법은 복잡한 여러 가지를 해결할 수있는 매우 유용한 방법이 될 것입니다중심체 생물학 및 세포 생물학의 많은 넓은 관점에서 메커니즘.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F.
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
