Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ immunofluorescensassay at måle variationen i proteinniveauer på centrosomer

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52030
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

Abstract

Centrosomer er små, men vigtige organeller, der tjener som poler mitosespindelen at opretholde genomisk integritet eller samle primære cilier at lette sensoriske funktioner i celler. Niveauet af et protein kan reguleres forskelligt på centrosomer end på andre .cellular steder, og variationen i centrosomal niveau af flere proteiner på forskellige punkter af cellecyklus synes at være afgørende for en korrekt regulering af centriole forsamling. Vi udviklede en kvantitativ fluorescensmikroskopi assay, der måler de relative ændringer i niveauet af et protein ved centrosomer i fikserede celler fra forskellige prøver, såsom i de forskellige faser af cellecyklus eller efter behandling med forskellige reagenser. Princippet i dette assay ligger i måling korrigeret for baggrund fluorescensintensitet svarende til et protein på et lille område, og normalisere denne måling mod det samme for et andet protein, der ikke varierer i henhold til den valgte eksperimentelle cetingelse. Ved hjælp af dette assay i kombination med BrdU puls og chase strategi at studere uforstyrrede cellecykler har vi kvantitativt valideret vores nylige iagttagelse, at centrosomal pulje af VDAC3 reguleres på centrosomer under cellecyklussen, sandsynligvis ved proteasom-medieret nedbrydning specifikt mod centrosomer.

Introduction

Centrosomer består af et par centrioler omgivet af pericentriolar materiale (PCM). At være de store mikrotubuli organisere centre (MTOCs) i pattedyrceller, centrosomer tjene som de to poler af mitotiske spindler i delende celler, og dermed bidrage til at bevare genomisk integritet 1. I hvilende celler (f.eks under G0 fase), en af de to centrioler af centrosom, nemlig moderen centriole, omdannes til en basal organ til at samle den primære cilium, en sensorisk organel rager ud fra celleoverfladen 2. Når cellerne igen ind i cellecyklen, er primære cilier adskilt og hver centriole dirigerer samling af en procentriole ved sin proximale ende, som gradvis elongates at danne et modent centriole 3. Ved indtræden af ​​S-fase, er en cartwheel-lignende struktur, der giver 9-fold symmetri til centriole dannet på overfladen af ​​hver eksisterende centriole og bliver bunden af ​​hver procentriole. Sas6 that er uundværlig for centriole samling ansættes til at danne centrum for vejrmølle 4-6. Andre centriolar proteiner samles derefter på vejrmølle i et stærkt reguleret, proksimal til distal måde 7. Efter netop at udfylde centriole dobbeltarbejde, celler samle yderligere pericentriolar materialer til at bygge to funktionelle centrosomer ved udgangen af G2 fase 8. Ud over de centrale centriolar komponenter 9-11 flere andre proteiner, herunder kinaser, phosphataser, chaperoner, stillads komponenter, membran associerede proteiner og nedbrydning maskiner er forbundet med centrioler basal organer og PCM på forskellige tidspunkter af cellecyklussen 12-16. Det er ofte bemærkes, at de centrosomal niveauer af mange proteiner tidsmæssigt er reguleret af centrosomal målretning mekanismer og / eller proteasomalaktivitet nedbrydning ved centrosomer. Vigtigt er det, udsvingene i centrosomal niveau af flere proteiner såsom Plk4, Mps1, Sas6 og CP110 ent forskellige punkter af cellecyklus synes at være afgørende for at regulere centriole samling 5,17-22, og i tilfælde af Mps1 forhindre denne centrosomal nedbrydning fører til dannelse af overskydende centrioler 19. På den anden side centrosomal fraktioner af adskillige proteiner er mindre labile i forhold til cytosoliske pools. For eksempel siRNA-medieret nedregulering af Centrin 2 (Cetn2) medførte kun en moderat fald i proteinniveauet på centrioler trods stor nedgang i hele dets celleniveauer 23. Det er derfor afgørende at måle ændringer i niveauet af centrosomal proteiner på centrosom stedet måle hele celle protein niveauer, når de vurderer deres centrosom-specifikke funktioner.

I denne undersøgelse har vi udviklet et assay ved indirekte immunofluorescens (IIF) at kvantificere det relative niveau af et protein på centrosomer. Dette assay er udviklet specielt til at analysere celler, som er fra forskellige prøverog kan derfor ikke afbildes samtidigt. Disse prøver kan være celler, som blev behandlet med forskellige reagenser (dvs. lægemiddel versus kontrol), opsamlet på forskellige tidspunkter (dvs. puls versus chase), eller befinder sig i forskellige faser af cellecyklussen. Princippet i dette assay ligger i måling korrigeret for baggrund fluorescensintensitet svarende til et protein på et lille område, og at normalisere denne værdi mod den samme for et andet protein, hvis niveauer ikke varierer under de valgte forsøgsbetingelser. Adskillige undersøgelser i centrosom biologi har for nylig udnyttet forskellige kvantitative mikroskopiteknikker, både levende og fikserede celler at bestemme centrosom-specifikke funktion af kandidat-proteiner 24-27. Svarende til disse assays den foreliggende teknik måler også korrigeret for baggrund fluorescensintensitet af testproteinet. Imidlertid ville inddragelsen af ​​normaliseringen anvendes en intern standard i denne analyse sandsynligvis give størrenøjagtighed og tillid i at analysere to forskellige prøver, der er på to forskellige dækglas. Endvidere, ud over at undersøge proteinniveauet ved centrosomer, med mindre justeringer denne metode kan anvendes til et bredt sæt af eksperimentelle betingelser eller andre cellulære steder.

Her kombinerer vi vores kvantitative mikroskopi assay med en BrdU puls-chase strategi for at sammenligne celler fra forskellige cellecyklus. I stedet for at bruge standard cellecyklusstandsning og frigivelse teknikker til at undersøge forskellige cellecyklus tidspunkter asynkront voksende celler inkuberes med BrdU at mærke celler i S-fase, og de mærkede celler jages til forskellige tidspunkter (typisk 4-6 timer). De fleste af de mærkede celler vil være i S-fasen umiddelbart efter impulsen. Længden af ​​chase vælges således, at efter chase vil mærkede celler i slutningen S, G2 eller mitose, hvilket kan verificeres ved morfologiske karakteristika såsom-stilling af centrosomer med hensyn til nucLei, afstanden mellem centrosomer, kondensering af kromosomer osv Således længden af chase afhænger af den gennemsnitlige varighed af S, G2 og M fase af en særlig celletype. Da denne fremgangsmåde undgår cellecyklusinhibitorer såsom hydroxyurinstof, aphidicolin, nocodazol osv, det giver en mere fysiologisk relevant cellecyklusanalyse.

Således viser vi her, at den kvantitative fluorescens mikroskopi analyse alene, eller i kombination med BrdU puls-chase assay, er en simpel endnu kraftfulde teknik til at præcist at måle de relative ændringer i centrosomal niveau af et kandidat-protein under en uperturberede cellecyklus. Vi målte centrosomal niveau VDAC3, et protein, som vi for nylig identificeret på centrosomer foruden mitokondrier 16,28 ved hjælp af disse assays. Resultater opnået her kontrollere vores tidligere bemærkning om, at centrosomal pulje af VDAC3 reguleres af nedbrydning, og varierer også i en celle cyklus dependent måde 16 endvidere validering af anvendeligheden af denne metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur

  1. Brug human telomerase revers transkriptase (hTERT) udødeliggjort retinal pigment epitelceller (hTERT-RPE1, her benævnt RPE1).
    BEMÆRK: RPE1 celler er næsten diploide, ikke-transformerede humane celler, som normalt bruges til at studere centriole samling og ciliogenesis. Disse celler følge en normal centriole overlapning cyklus koordineret med et reguleret cellecyklussen.
  2. Passage en næsten sammenflydende 100 mm cellekultur skålen RPE1 celler ved 1: 5 fortynding af den oprindelige kultur i en frisk 100 mm skål indeholdende 10 ml DME / F-12 (1: 1) medium suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS), 100 U / ml penicillin G og 100 pg / ml streptomycin (det komplette medium er nævnt som DME / F-12 medium). Grow celler ved 37 ° C i nærvær af 5% CO 2.
    1. Inkuber 12 mm runde dækglas i 50 ml 1 N HCI i en overdækket bægerglas, O / N uden omrystning ved 60 ° C i et vandbad eller i inkubator.
    2. After kassere syreopløsningen vaskes dækglassene tre gange i 100 ml destilleret vand ved inkubation i 15 minutter med lejlighedsvis omrystning. Gentag vask på samme måde i 70% ethanol og 95% ethanol.
    3. Tør dækglassene ved individuelt at sprede dem ud på et laboratorium trækpapir i biosikkerhed kabinet, efterfulgt af sterilisering med UV-stråling i 60 minutter.
  3. Placer 2-4 tørre dækglas i en 35 mm cellekultur skål. Opløsningen af ​​fibronectin eller fibronectin lignende manipuleret polymer (stamkoncentration på 1 mg / ml) til en koncentration på 25 ug / ml i cellekultur PBS fortyndes.
    1. Placer 80-100 pi af den fortyndede opløsning på hver dækglas og inkuber i 60 minutter til at coate oversiden af ​​dækglasset. Vask dækglassene tre gange under anvendelse af PBS før tilsætning af komplet medium.

2. voksende celler og behandling Celler med proteasominhibitorer

  1. Passage 2 x 10 5 asynkront vokseING RPE1 celler i hver 35 mm skål indeholdende dækglas og dyrke cellerne i 2 ml komplet medium. Erstat dyrkningsmediet hver 24 timer med frisk forvarmet komplet medium.
    1. For at analysere virkningen af ​​proteasomhæmning på centrosomal niveau test protein (her VDAC3 eller γ-tubulin), dyrke cellerne i to 35 mm-skåle for 44 timer. Erstat dyrkningsmediet med komplet medium og tilføje enten MG115 eller DMSO som kontrol opløsningsmiddel ved en endelig koncentration på 5 uM eller 0,05% hhv. Samtidig tilsættes BrdU til cellerne til en slutkoncentration på 40 uM og inkuberes cellerne i 4 timer.
    2. Overfør hver dækglas i en 24-brønds plade. Der tilsættes 500 pi afkølet methanol til hver brønd og inkubere pladen ved -20 ° C i 10 min for at fikseres cellerne på dækglassene. Umiddelbart vaskes dækglassene tre gange med 500 pi vaskebuffer (1x PBS indeholdende 0,5 mM MgCl2 og 0,05% Triton-X 100).
  2. Høst den resterendeceller fra 35 mm skål og centrifugeres cellerne ved 1.000 xg i 5 minutter. Brug cellepelleten at analysere det totale protein ved Western blotting (trin 6).

3. BrdU Pulse og Chase Assay til Analyser Protein niveauer i forskellige cellecyklusfaser

  1. For at analysere variation af niveauet af et protein (her VDAC3, Sas6 eller Cep135) ved centrosomer i forskellige faser af cellecyklussen, vokser celler i to 35 mm skåle indeholdende dækglas for 44 timer. Erstat dyrkningsmediet med komplet medium indeholdende 40 uM BrdU og inkuber cellerne i 4 timer i cellekultur inkubator.
  2. Fra en skål overføres dækglassene til en 24-brønds plade til at fastsætte cellerne under anvendelse af afkølet methanol som beskrevet i trin 2.1.2.
  3. Efter 4 timer BrdU puls, fjern BrdU-holdige medium, vaske cellerne én gang med PBS og en gang med komplet medium, tilsættes frisk medium, og derefter dyrke cellerne i fravær af BrdU i forskellige tidsrum (typisk et andet 4 timerfor RPE1 celler) før fiksering af cellerne som beskrevet i trin 2.1.2.
    BEMÆRK: RPE1 celler, de fleste af BrdU-positive celler er i sen S eller G2-fase efter en 4 timers chase. Dette skal bestemmes uafhængigt for hver celletype.

4. Immunfarvning

  1. Inkuber de fikserede celler på dækglas i 200 pi blokerende buffer (2% BSA og 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS) i 30 minutter.
    1. Inkubér cellerne med en blanding af primære antistoffer (typisk en rejst i kanin og en anden hævet i mus) fortyndet i blokeringsbuffer O / N ved 4 ° C i en befugtet kammer.
    2. For at gøre et fugtigt kammer, sætte en våd køkkenrulle i den nederste halvdel af en tom 1.000 pi pipettespids kassen. Læg en strimmel parafilm på stativet overflade og spotte en dråbe (15-20 pi) af antistoffet opløsningen på Parafilm for hvert dækglas at inkuberes. Vend et dækglas på en dråbe af antistof-opløsning (så celler er nedsænket) og tætlåg boksen tip.
    3. Vend dækglas igen og returnere dem tilbage til 24-godt fad. Vask dækglas og derefter inkubere dem i 150 pi antistofblanding sekundære (her grøn-fluorescerende farvestof konjugeret anti-kanin og røde fluorescerende farvestof konjugeret anti-muse fortyndet med blokerende buffer) i 1 time ved stuetemperatur. Vask dækglassene tre gange.
      BEMÆRK: fluoroforen-konjugerede sekundære antistoffer er lysfølsomme. Beskyt prøverne fra lys under trin 4.1.3-5.1.2.
  2. Forbered anti-BrdU farvning ved fastsættelse af de farvede RPE1 cellerne igen med 500 pi afkølet methanol ved -20 ° C i 10 minutter, som beskrevet i trin 2.1.2. Vask dækglas tre gange.
    BEMÆRK: Denne fiksering sikrer den primære og sekundære antistof mærkning af proteinet (erne) af interesse under syrehydrolyse proces i det følgende trin.
    1. Inkubér cellerne i 200 pi 2 N HCI i 30 minutter ved stuetemperatur. Neutraliseres med 300 pi af 1 M Tris-Cl, pH 8 end vaskes cellerne tre gange ved anvendelse af vaskepuffer.
    2. Bloker cellerne igen med 200 pi blokerende buffer i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Inkubér cellerne med rotte-anti-BrdU-antistof (fortyndet i blokeringsbuffer) i 45 minutter ved 37 ° C i et fugtigt kammer. Retur dækglassene tilbage til 24-brønds skål, vaske dem og derefter inkuberes med blå-fluorescerende farvestof konjugeret anti-rotte-sekundært antistof (fortyndet i 150 pi blokerende buffer i 24-brønds skål til 1 time ved stuetemperatur.
  3. Vask dækglassene tre gange. Spot en dråbe (ca. 3-6 pi) af et monterings opløsning indeholdende antiblegemiddel reagens på et objektglas. Vend et dækglas, med celle-nedad, på monteringsløsning. Tør overskydende væske ved at trykke forsigtigt dækglasset mod dias ved hjælp af bløde rengøring væv. Anvende gennemsigtige neglelak langs kanten af ​​dækglasset at forsegle det på mikroskopobjektglasset.

5. Immunofluorescens Billede Acquisition og analyse

  1. Brug en 100X Plan Apo olieimmersion mål (med en 1,4 numerisk åbning) til at erhverve billeder af BrdU-positive RPE1 celler ved stuetemperatur.
    1. Sæt et dias på mikroskopet (se udstyr) fastgjort med et kamera er i stand til digital billedbehandling. For hver fluorofor, fastsætte en passende eksponeringstid (typisk mellem 300-1000 ms) ved manuelt at undersøge alle prøver af et eksperiment. Før erhverve billeder af en celle, manuelt bestemme den passende top og bund brændplan langs Z-aksen (typisk 0,2 um trin størrelse). Acquire billeder af forskellige prøver, der er på separate dækglas med identisk eksponeringstid for forskellige fluoroforer langs Z-aksen ved hjælp af en digital mikroskopi imaging software-pakke.
  2. Udfør dekonvolution (i disse tilfælde ved brug Ingen nabo algoritmen) af alle billedstakke erhvervet langs Z-aksen.
    1. Opnå den samlede intensitet projektion af hvert billede stak sammenZ-aksen.
  3. I celler, hvor centrosomer ligger tæt (afstanden mellem to centrosomer er mindre end 2 um), tegne en lille firkant (typisk 20-30 pixels pr side) omkring begge centrosomer og markere det valgte område.
    1. Tegn en større kvadrat (typisk 24-35 pixels pr side) omkring første pladsen og markere det valgte område af det store torv.
    2. Opnå området (A) og det samlede fluorescensintensitet (F) for hver fluorofor i hver boks (S betegner lille boks og L betegner stor kasse).
    3. Analyser, korrigeret for baggrund fluorescens intensiteten af hver fluorofor ved hjælp af formlen beskrevet af Howell et al 29:. F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)].
    4. Opnå den normaliserede fluorescensintensitet af proteinet af interesse (her VDAC3 eller Sas6) ved beregning af forholdet mellem baggrund korrigeret fluorescensintensitet af sine fluorophore til af fluoroforen bruges til den valgte interne standard (her γ-tubulin, Sas6 eller Cep135).
  4. I tilfælde af analyse af celler, hvor centrosomer er godt adskilt (afstanden mellem to centrosomer er større end 2 um), analysere hver centrosom separat ved at trække to separate sæt af kasser. Tegn en lille firkant (typisk 15-25 pixels pr side) omkring hvert centrosom og markere det valgte område. Tegn en større kvadrat (20-30 pixel pr side) omkring første pladsen og markere det valgte område.
    1. Anskaf området (A), og den samlede fluorescensintensitet (F) af hver fluoroforen i hver kasse, og beregne baggrundskorrigerede fluorescensintensiteter af hver fluorofor, separat for hver centrosom, som beskrevet i trin 5.3.3.
    2. Kombiner baggrundskorrigerede fluorescensintensiteter af hvert protein fra de to centrosomer at få den samlede centrosomal niveau af dette protein i denne celle.
    3. Anskaffor proteinet af interesse ved at beregne forholdet mellem den samlede centrosomal intensitet til den samlede centrosomal intensiteten af ​​den interne standard normaliseret intensitet.
  5. Analyser mindst 15-25 celler for hver eksperimentel betingelse og plotte grafen i et regneark.

6. Analyse af Total Protein anvendelse af Western Blotting

  1. Resuspender cellerne i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCI, 1% Nonidet P-40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) og inkuberes i 10 min på is at lysere cellerne.
    1. Centrifugeres blandingen ved 10.000 xg i 10 min, adskille lysatet fra pelletfraktionen og måle den totale proteinkoncentration af hvert lysat under anvendelse af en bicinchoninsyre (BCA) assay kit.
  2. Bland 40 ug lysat med 4x SDS-PAGE loading buffer (50 mM Tris-CI, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 100 mM dithiothreitol, 0,1% Bromophenol blå).
    1. Kog prøverne i 10 min og køre prøverne på en 12,5% denatureringsbetingelser SDS-PAGE ved en konstant spænding på 200 V.
  3. Overfør proteinerne separeret på SDS-PAGE på en nitrocellulosemembran ved hjælp af western blotting-teknikken (ved en konstant spænding på 90 V i 1 time i kulde).
    1. Bloker membranen med 3% fedtfri mælk i 1x PBS og derefter inkubere membranen med opløsninger af fortyndede primære antistoffer (i dette tilfælde kanin anti-VDAC3, kanin-anti-γ-tubulin og muse-anti-α-tubulin) for 1 timer ved stuetemperatur.
    2. Efter vask af membranen tre gange (hver 5 minutters inkubation under omrystning) ved hjælp af PBS-T-buffer (1x PBS og 0,2% Tween-20), inkuberes membranen i en blanding af nær-infrarød (IR) fluorescerende farvestof konjugeret anti-kanin og IR fluorescerende farvestof konjugeret anti-muse-sekundære antistoffer (fortyndet i PBS-T) i 1 time.
    3. Vask membranen tre gange og derefter scanne membranen at analysere båndene ved hjælp af en infrarød fluorescence imaging system egnet til immunoblot detektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vores seneste undersøgelser identificeret roman centrosomal lokalisering og funktion af VDAC3, en af de mitokondrie poriner 16,28. Immunfarvning af adskillige mammale celler, herunder RPE1 celler under anvendelse af et VDAC3-specifikt antistof viste fremtrædende centrosomal farvning og forholdsvis svag mitokondrie farvning. Vi viste ligeledes, at centrosomal VDAC3 fortrinsvis er forbundet med moderen centriole og centrosomal pulje af både den endogene og ektopisk udtrykte VDAC3 reguleres af nedbrydning 16. For at validere den kvantitative IIF assay undersøgte vi ændringerne i centrosom-associerede VDAC3 pool i celler, som er i S-fase.

Her blev asynkront voksende RPE1 celler behandlet med enten proteasominhibitor MG115 eller kontrol opløsningsmiddel DMSO i 4 timer. Hvis du vil begrænse vores analyse til celler, der er i S-fasen og undergår centrosom samling, vi kun undersøgt celler, der er indarbejdet BrdU during samme 4 timer og havde to tætliggende centrosomer (afstand indenfor 2 um af hinanden). Vi undersøgte flere tilfældige områder af celler farvet for BrdU og kerner fra både kontrol og MG115 behandling (figur 1A) til at konkludere, at den korte behandling af MG115 ikke påvirkede BrdU inkorporering (ca. 58%) i forhold til at styre behandlingen (ca. 56%) i RPE1 celler. Som vi sammenligne kun celler, der var i S-fase (som bedømt ved tilstedeværelsen af ​​to γ-tubulin foci anbragt inden 2 um af hinanden), fandt vi γ-tubulin som en potentiel intern standard for normalisering. Således har vi først undersøgt, om centrosomal γ-tubulin niveauer i BrdU-positive celler varierer efter proteasomhæmning. Ikke overraskende var der stor celle-til-celle variation i γ-tubulin fluorescensintensitet fra en celle til en anden, og vi fandt, at denne variation blev bedst præsenteres i boks og knurhår diagrammer, der præsenterer data sættet som helhed tilgængelig. Jegn box og knurhår diagrammer repræsenterer kasser den nedre og øvre kvartil, markøren i boksen angiver medianen af ​​hver serie, og whiskers repræsenterer minimum og maksimum værdier, som ofte (men ikke altid) outliers. Som det ses i figur 1 D, den centrosomal γ-tubulin niveau var ikke signifikant forskellig mellem BrdU-positive celler behandlet med enten MG115 eller DMSO, således at validere γ-tubulin som en intern standard for dette eksperiment. I modsætning til γ-tubulin, baggrunden korrigeret fluorescensintensitet svarende til centrosomal VDAC3 var ca. 2,5-fold højere i MG115-behandlede celler end i kontrolceller (figur 1c). Når vi normaliseret total VDAC3 fluorescens mod denne af γ-tubulin, faldt dobling anelse til omkring to gange (figur 1E). Selvom fold ændring var større uden normalisering, vi har mere tillid til nøjagtigheden af ​​de normaliserede data, som vi føler bettER styringer til en generel effekt af MG115 behandling, samt variation som følge af prøve behandling. VDAC3 farvning ved ikke-centrosomal steder (Figur 1B) eller den samlede cellulære niveau VDAC3 (figur 1 F) blev ikke påvirket af proteasomhæmning. Således har vi kvantitativt kontrollere vores tidligere bemærkning om, at centrosomal pulje af VDAC3 reguleres af proteasom-medieret nedbrydning.

For at måle ændringen i centrosomal VDAC3 under cellecyklussen har vi mærkede celler med en 4 timers BrdU puls efterfulgt af en 4 timers chase af de mærkede celler. Da kun S-fase celler vil inkorporere BrdU under pulsen (gennemsnitlig afstand mellem to centrosomer er 1,35 ± 0,16 um), at størstedelen af ​​BrdU-positive RPE1 celler efter 4 timers chase vil være på enten sene S-fase eller tidligt G2 fase ( gennemsnitlig afstand mellem to centrosomer er 1,55 ± 0,22 um), med en mindre befolkning sent G2 fase, hvor Centronogle par har markant adskilt (gennemsnitlig afstand mellem to centrosomer> 2 um) 30. γ-tubulin, er en vigtig PCM komponent spænder akkumuleres på centrosomer under centrosom modning, der foregår på G2 fase 31,32, og denne stigning gør det en dårlig intern standard til vurdering cellecyklus variationer af andre centrosomal proteiner. På den anden side er Sas6 rekrutteret til procentrioles under tidlig S-fase til at stimulere samling af cartwheels 4,5,7 og forbliver i bunden af de nydannede centrioler indtil celler ind mitose, når det begynder at blive nedbrudt (figur 2 og reference 5). Men i HeLa eller U2OS celler, det centriolar niveau Sas6 øges gradvist som celler udvikler sig fra S-fase til G2 fase 5. Derfor vi først målte centrosomal Sas6 niveau med hensyn til den i Cep135, en anden kerne centriolar protein, der lokaliserer til den proksimale ende af centrioler helecellecyklussen 33. Vi har ikke observere nogen signifikant forskel i baggrunden korrigeret samlede fluorescensintensiteter af Cep135 eller Sas6 i BrdU-positive RPE1 celler fra puls eller chase, når centrosomer er tætliggende (figur 3A-D, "tæt" celler, hvor gennemsnitlig afstand mellem to centrosomer er mindre end 2 um). Følgelig normaliserede Sas6 niveau forblev ens i disse celler (figur 3E). Men observerede vi en beskeden stigning i den samlede fluorescens intensitetsværdier af Sas6 og en lille stigning i den samme for Cep135 i celler, hvor centrosomer er godt adskilt (afstanden mellem to centrosomer> 2 m; "fjernt" celler). Følgelig normaliserede samlede centrosomal Sas6 niveau i celler med to godt adskilte centrosomer var lidt, men statistisk signifikant højere end i celler med tætliggende centrosomer. Dette skyldes sandsynligvis den iboende regulering af Sas6 niveau with cellecyklusprogression 5. Det er imidlertid også muligt, at små stigninger (som eller lavere statistisk signifikans) skyldes tilsætning fluorescensintensiteter to centrosomer der blev analyseret separat i forhold til analyse af to centrosomer samtidig i celler med tætliggende centrosomer. Ikke desto mindre, når fluorescensintensitet VDAC3 blev normaliseret til det Sas6 alene blev VDAC3 niveau to tætliggende centrosomer forøget omtrent 1,5 gange i celler, der er i slutningen af ​​S- / tidlig G2-fase i forhold til den tidlige S-fase celler (figur 4A-C, F, "tæt" celler). Når disse celler videre til sent G2 fase blev normaliseret VDAC3 niveau to centrosomer reduceret med 2,4 gange i forhold til, at der i slutningen af S-fasen (figur 4C, F).

Fordi Sas6 niveauerne stige en smule fra slutningen S-fasen til G2, hjælp Sas6 som en intern standard fører til en mindre overvurdering af decemberrease i VDAC3 niveauer i slutningen af ​​G2-fase celler (centrosomer er adskilt med mere end 2 um). Mens vores data antyder, at Cep135 er et bedre valg som intern standard for vurdering cellecyklus variationer, kan vi ikke bruge det til VDAC3 fordi VDAC3 og Cep135 antistoffer til rådighed for os er begge fra kanin. Men at multiplicere den gennemsnitlige værdi for Sas6-normaliseret VDAC3 (F VDAC3 / F Sas6) ved medianværdien af Cep135-normaliseret Sas6 giver os en tilnærmet værdi for Cep135-normaliseret VDAC3 [(F VDAC3 / F Sas6) x (F Sas6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Når vi udført denne analyse, ændringen i VDAC3 niveauer mellem slutningen S / tidlig G2 og sene G2 falder en smule til 2-fold. BrdU-positive celler, der er i ethvert stadium af mitose som bedømt ved kondenserede kromosomer og svag Sas6 farvning er udelukket fra analysen, på grund af det dramatiske fald i Sas6 niveauer. Vi bemærkede dog, at det centrosomal VDAC3 niveau reforblev lavt under mitose (data ikke vist). Fordi Cep135 niveauer ikke falde under mitose (data ikke vist), kunne vi i princippet gentages re-normalisering procedure at estimere Cep135-normaliseret VDAC3 niveauer i mitose. Men i virkeligheden centrosomal Sas6 niveauer i mitose var for variabel at give mulighed for en nøjagtig bestemmelse af Sas6-normaliserede VDAC3 niveauer i første omgang. Uanset, samlet, vores data verificeret, at centrosomal pulje af VDAC3 reguleres ved centrosomer under cellecyklussen.

Figur 1
Figur 1. asynkront voksende RPE1 celler blev inkuberet med BrdU og MG115 (MG) ​​eller DMSO (DM) i 4 timer. (A) Vist er tilfældige områder af DMSO eller MG115 behandlede celler farvet med anti-BrdU-antistof (rød) og Hoechst ( DNA; blå). Her og i alle andre billeder baren repræsenterer 5 um.(BE) DMSO eller MG115 behandlede celler blev farvet med antistoffer mod VDAC3, γ-tubulin og BrdU. BrdU-positive celler blev afbildet under identiske imaging forhold (eksponering gange-400 msek for blå fluorofor / BrdU; 500 msek for grøn fluorofor / VDAC3; 300 ms for rød fluorophor / γ-tubulin), og korrigeret for baggrund fluorescensintensiteter af VDAC3 og γ-tubulin blev bestemt. Repræsentative billeder, der viser VDAC3 (VD3, grøn), γ-tubulin (γ-tub, rød) og BrdU (blå) er vist i (B). Her og i alle andre billeder, viser mellemværker digitalt forstørret centrosomer som angivet af firkanter. Korrigeret for baggrund fluorescensintensiteter (F; i arbitrære enheder) svarende til VDAC3 og γ-tubulin fra femogtyve celler er afbildet i boksen og whisker diagram i (C) og (D) henholdsvis. Her og i alle andre tilfælde, repræsenterer æsker nedre og øvre kvartil, den marker i kassen (-) angiver medianen af ​​hver serie, og whiskers repræsenterer minimum og maksimum værdier. Normaliserede fluorescensintensitet værdier VDAC3 fra disse femogtyve celler er afbildet i (E). For (CE) er p-værdi afledt af uparret t-test. *** Angiver p <10 -5 og ns indikerer p> 0,05. (F) Immunoblots viser hel-celle niveauer af VDAC3 (både VDAC3a og VDAC3b 16) og γ-tubulin (γ-karbad), hvor α-tubulin (α-karbad) loader kontrol. Klik her for at se en større udgave af dette figur.

Figur 2
Figur 2. asynkront voksende RPE1 celler, som blev mærket med en 4 timer BrdU puls og afdrevet i yderligere 4 timer i fravær af BrdU blev farvet med antistoffer mod Sas6 (grøn) og γ-tubulin (γ-tub, rød). Repræsentative billeder viser Sas6 farvning under (A) S-fase (med to tæt Sas6 foci), (B) metafase (to svage Sas6 foci ved polerne) og (C) telofase (Sas6 foci er tabt fra polerne). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. asynkront voksende RPE1 celler blev mærket med en 4 timers BrdU puls og afdrevet i yderligere 4 timer i fravær af BrdU. BrdU-positive celler farvet for Cep135 og Sas6 blev afbildet under identiske betingelser imaging (eksponering gange-400 msekfor blå fluorofor / BrdU; 400 msek for grøn fluorofor / Cep135; 500 msek for rød fluorophor / Sas6), og baggrundskorrigerede fluorescensintensiteter af Sas6 og Cep135 blev bestemt. Afstanden mellem to centrosomer blev også målt i alle celler. En celle, hvor afstanden mellem to centrosomer er mindre end 2 um blev betragtet som "tæt" og når værdien er mere end 2 um blev kategoriseret som "fjernt". (AB) Repræsentative billeder viser Cep135 (C135, grøn), Sas6 (rød) og BrdU (blå) er vist. I (B), C1 og C2 er de to centrosomer repræsentanten 'fjernt' celle. (CD), korrigeret for baggrund fluorescensintensiteter (F; i arbitrære enheder) svarende til Sas6 (C) og Cep135 (D) fra femten celler i hver kategori er afbildet i boksen og whisker diagram. (E) Normaliseret intensiteter af Sas6 from de celler er plottet i boksen og knurhår diagram. For (CE) er p-værdi afledt af uparret t-test. * Angiver 0,001 <p <0,05, og ns angiver p> 0,05. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. BrdU-positive celler fra ovenstående BrdU puls-chase assay (figur 3) farvet for VDAC3 og Sas6 blev afbildet under identiske betingelser imaging (eksponering gange-400 msek for blå fluorofor / BrdU; 500 msek for grøn fluorofor / Sas6; 1.000 msek for rød fluorofor / VDAC3) og baggrundskorrigerede fluorescensintensiteter af Sas6 og VDAC3 blev bestemt. Afstanden mellem to centrosomer blev målt i alle celler, og cellerne blev kategoriseret som 'cmiste "(afstanden mellem to centrosomer <2 um) og» fjernt "(afstanden mellem to centrosomer> 2 um), som i figur 3. (AC) Repræsentative billeder af" tæt "celle i BrdU puls (A), i BrdU chase (B), og 'fjern' celle i BrdU chase (C) farvet for VDAC3 (VD3, grøn), Sas6 (rød) og BrdU (blå) er vist. I (C), C1 og C2 er de to centrosomer. [DE], korrigeret for baggrund fluorescensintensiteter (F; i arbitrære enheder), som svarer til VDAC3 (D) og Sas6 (E) fra femten celler i hver kategori er afbildet i kassen og knurhår diagram. (F) Normaliseret intensiteter af VDAC3 fra disse celler er plottet i boksen og knurhår diagram. For (DF), er p-værdi afledt af uparret t-test. *** Angiver p <10 -5 **angiver 10 -5 <p <0,001, og ns angiver p> 0,05. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantitativ mikroskopi i cellebiologi er ofte forbundet med levende cell imaging assays, såsom fluorescensresonansenergioverførsel (FRET), Fluorescens Recovery Efter Fotoblegning (FRAP) osv Men der er voksende eksempler på cellebiologer udvikle forskellige kvantitative mikroskopi analyser for fast celler i de seneste år 27,34-36. Det er vigtigt, fremskridt i forståelsen centrosom biologi ofte kræver forståelse af centrosom-specifikke funktion proteiner, hvis centrosomal puljer kan være reguleret anderledes end andre puljer. Således har vi udviklet en kvantitativ IIF assay til specifikt at analysere den relative centrosomal niveau af et protein i to forskelligt behandlede prøver. Da dette kræver, at celler fikseret og forarbejdet på separate dækglas vi derfor indført en intern standard med henblik på normalisering, til bedre kontrol for mulige artefakter som følge af nødvendigheden af ​​håndtering af to experimental cellepopulationer separat og forøge nøjagtigheden af ​​assayet. Der er kun få tidligere undersøgelser 37, der har brugt sådan en intern standard til at måle den relative fluorescensintensitet af en test protein.

Mens valget af en intern standard er afgørende for nøjagtigheden af ​​vores analyse, er det nok den mest udfordrende aspekt. Ideelt set centriole par dubletter under S-fase og den duplikerede centrioler derefter akkumulere yderligere PCM komponenter, herunder γ-tubulin under G2, således at de to modne centrosomer kan blive polerne af mitotiske spindel. Derfor antager vi, at centrosomal niveau af γ-tubulin ikke ville ændre sig væsentligt i celler, der er strengt i S-fase. Dette synes at være tilfældet i RPE1 celler, hvor S-fase celler er markeret med en kort BrdU mærkning. Imidlertid skal gyldigheden af ​​en intern standard testes for hver celletype og eksperimentel betingelse. For eksempel, mens baggrunden-korreCTED VDAC3 fluorescens steg mere end to gange som svar på proteasomhæmning i aphidicolinbehandlede (S-fase standset) U2OS celler, var der også en lille, men statistisk signifikant (0,001 <p-værdi <0,05) stigning i centrosomal γ-tubulin (supplerende Figur). Således γ-tubulin er ikke altid en passende intern kontrol, selv for celler, der er standset i cellecyklussen.

Svarende til alle andre IIF mikroskopi assay, en af ​​ulemperne ved dette assay er, at antistoffer mod det foreliggende protein og den interne standard skal hæves i forskellige værtsarter. Mens vores data antyder, at Cep135 er en bedre intern standard end Sas6, kunne vi ikke normalisere VDAC3 niveauer mod Cep135 som de tilgængelige antistoffer mod disse proteiner blev begge rejst i kanin. Således har vi i stedet normaliseret mod Sas6, som forårsagede en overvurdering af faldet i VDAC3 niveauer mellem sen S-fase og G2. I en situation, hvor internal standard varierer beskedent, kan man indføre en anden normaliseringsfaktor at tage højde for denne variation. For eksempel, for at korrigere for variationen i Sas6 vi mangedoblet Sas6-normaliseret VDAC3 intensitet af Cep135-normaliseret Sas6 intensitet.

I tilfælde, hvor valget af en passende intern standard er vanskeligt, kan fluorescerende farvestof coatede mikrosfærer (0,02-0,04 um diameter) give en alternativ strategi. Signalet af en fluorescens mikrosfære til stede i det samme område som cellen af ​​interesse, kan anvendes til at normalisere fluorescenssignalet, svarende til proteinet af interesse. På den anden side, hvis test- og kontrolceller afbildes sammen, kan man ikke behøver en sådan intern standard for normalisering. Vi har tidligere anvendt en version af dette assay at sammenligne centrosomal niveau Mps1 i celler, der overudtrykker enten cyclin A 19 eller Antizyme 20, som enten forhindre 19 eller fremme 20. graderadation af Mps1 på centrosomer henholdsvis at tilstødende transficerede celler afbildes samtidigt.

For at undersøge effekten af ​​centrosomal VDAC3 ved proteasomhæmning brugte vi BrdU mærkning for at identificere og sammenligne celler, der er i S-fase. Mens MG115 behandling kan hæmme cellecyklusprogression, denne inhibering kræver en væsentligt højere koncentration 38 end den, der anvendes i denne undersøgelse. Ved de koncentrationer, der anvendes her MG115 kan blokere cellecykluskontrolpunkter og overgange, men ikke blokerer cellecyklusprogression. Dog skal der kontrolleres for hver celletype, som vi gjorde her ved at vise, at MG115 ikke ændrede procentdelen af ​​BrdU positive celler i forhold til DMSO. Men standsning celler i S-fase under anvendelse af aphidicolin eller hydroxyurinstof (HU) eller synkroniserer celler under anvendelse af mitotiske 'ryste-off' og frigivelse eller dobbelt thymidin blok og frigivelse kan anvendes som alternative metoder til at generere tilsvarende poputioner af celler i S-fase.

BrdU puls-chase strategi at studere cellecyklus tidspunkter vil være meget nyttige i mange funktionelle assays, som kræver en uforstyrret cellecyklussen. Dette er en biologisk større assay, der kan være i stand til at erstatte cellecyklusstandsning teknikker, der anvender forskellige cellecyklusinhibitorer. Anvendelse af disse inhibitorer kan ofte forårsage forskellige typer af fysiologisk stress i celler, hvilket resulterer i afvigende ændringer i cellecyklus fænotyper. Anvendelse af puls-chase tilgang muligt for os at vise, at udtømning af Cetn2 kun forsinket centriole samling 39 i modsætning til at forårsage en komplet blok som foreslået af tidligere undersøgelser 23. Afsløring BrdU-positive celler kræver syrehydrolyse af prøverne. Vi og mange andre forskere bruger en teknik, der på ny fastsætter celler efter primær og sekundær farvning for test proteiner, før syrehydrolyse, med ubetydeligt tab af farvningsintensiteter for different centrosom proteiner 40. Imidlertid kunne et potentielt alternativ være at anvende 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (edu), en anden thymidin analog, der er svarende til BrdU inkorporeret effektivt i replikerende DNA 41. Visualisering af Edu hjælp 'klik kemi "ikke kræver syrehydrolyse 42, og kan derfor mere egnet til visse antistoffer.

Desuden kan dette assay let anvendes til at måle ændringen i post-translationelle modifikationer af et bestemt protein i centrosomer. For eksempel kan centrosomal niveau af phosphorylering normaliseres mod den totale niveau af proteinet selv, forudsat at der findes phosphoryleringssted-specifikke antistoffer. Denne analyse kan straks anvendes på vurderingen relative phosphorylering mellem eksperimentelle betingelser eller cellecyklus faser, men potentielt tilpasses til at vurdere de samlede niveauer af phosphorylering hvis kritiske parametre for antistof paraffinteter er kendte eller kan bestemmes. Denne analyse bør også gælde for undersøgelse af proteiner på noget andet websted i celler, selvom området af interesse ikke bør være for store. Assayet vil være særlig nyttigt at måle stedspecifikke modulation af et protein, der er lokaliseret på flere cellulære steder.

Der er en håndfuld af tekniske parametre som forskellen fotoblegning, effekten af digital billedbehandling, linearitet fluorescensintensiteterne af fluoroforer, baggrundsstøj etc., der skal tages i betragtning for at maksimere nøjagtigheden af målingen 43. For eksempel kan man skifte fluorochrom forbundet med hvert sekundært antistof at vurdere bidraget af fotoblegning. Mange andre parametre kan velkontrolleret, hvis man anvender tilsvarende billeddiagnostiske betingelser (eksponeringstid, gain, trin størrelse, antal Z-stakke, etc.) og samme imaging software i hver imaging løb. Selvom vi anvendteNo-nabo algoritmen hele vores analyse til at udføre billede deconvolution kan dette assay kombineres med andre deconvolution algoritme såsom begrænset iterativ. Vi konstaterer også, at det skal være let at tilpasse dette assay til et vilkårligt antal forskellige imaging softwarepakker, som mest almindeligt tilgængelige billedanalyse software har værktøjer til analyse af fluorescensintensitet og afstande.

Denne analyse bør finde anvendelse på en hvilken som helst celletype, og vores valg af celler Her er udelukkende baseret på deres relevans i centrosom biologi forskning, og deres anvendelse i vores tidligere undersøgelser af centrosomal VDAC3 funktion 16,28. Men for at gyldigheden af ​​interne standarder og passende tidspunkter for puls-chase identificere celler i S-fase, G2, eller mitose skal bestemmes for hver celletype. Samlet set vil vores nyudviklede kvantitativ fluorescens teknik i kombination med BrdU puls-chase assay være en meget nyttig metode til at løse flere indvikletmekanismer centrosom biologi og i mange bredere aspekter af cellebiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma F8141 Stock of 1 mg/ml in water
DMSO Sigma D2650
MG115 Sigma SCP0005 Stock of 10 mM in DMSO
BrdU Sigma B5002 Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) Sigma T 6557 1:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)  Aviva Systems Biology ARP35180-P050 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)  Santa cruz biotechnology sc-81431 1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) Abcam ab-75005 1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)  Abcam ab6326 1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Life technologies A21093 1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21202 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21203 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21206 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21207 1:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) Sigma T5192 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) Sigma T9026 1:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A10043 1:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated Rockland antibodies 610-731-002 1:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent  Life technologies S36936 Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1 Fisherbrand 12-545-80
Olympus IX-81 microscope Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera QImaging  32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective Olympus 1.4 numerical aperture
Slidebook software package Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay Thermo Scientific 23227
U-MNU2 Narrow UV cube Olympus U-M622 Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube Olympus U-M643 Filter
U-MNU2 Narrow Green cube Olympus U-M663 Filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Tags

Cellebiologi centrosom samling cellecyklus centrosomal nedbrydning kvantitativ fluorescensmikroskopi normalisering VDAC3 BrdU puls-chase
Kvantitativ immunofluorescensassay at måle variationen i proteinniveauer på centrosomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Majumder, S., Fisk, H. A.… More

Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes. J. Vis. Exp. (94), e52030, doi:10.3791/52030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter