Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ Immunfluorescens analysen Mål Variasjon i protein nivåer på Centrosomes

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52030
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

Abstract

Centrosomes er små, men viktige organeller som tjener som polene av mitotiske spindel for å opprettholde integriteten genomisk eller montere primære cilia å lette sensoriske funksjoner i celler. Nivået av et protein kan reguleres på en annen måte ved centrosomes enn ved andre .cellular steder, og variasjonen i centrosomal nivået av flere proteiner i forskjellige punkter av cellesyklus synes å være avgjørende for riktig regulering av centriole sammenstilling. Vi har utviklet en kvantitativ fluorescens mikroskopi-analyse som måler relative endringer i nivået for et protein på centrosomes i fikserte celler fra forskjellige prøver, for eksempel ved forskjellige faser av cellesyklusen eller etter behandling med forskjellige reagenser. Prinsippet for denne analyse ligger i å måle bakgrunns korrigert fluorescerende intensitet svarende til et protein ved et lite område, og normal at målingen mot det samme for et annet protein som ikke varierer i henhold til den valgte eksperimentelle condition. Utnytte denne analyse i kombinasjon med BrdU puls og jakt strategi for å studere uaffisert cellesykluser, har vi kvantitativt bekreftet vår siste observasjon at centrosomal pool av VDAC3 reguleres ved centrosomes i løpet av cellesyklusen, sannsynligvis ved proteasom-mediert nedbrytning spesifikt på centrosomes.

Introduction

Centrosomes består av et par av Sentrioler omgitt av pericentriolar materiale (PCM). Å være de store microtubule organisering sentre (MTOCs) i pattedyrceller, centrosomes tjene som de to poler av mitosetråder i dele celler, og dermed bidra til å opprettholde genomisk integritet en. I hvilende celler (f.eks, under G0 fase), en av de to Sentrioler av sentrosomen, nemlig moder centriole, blir omdannet til en basal organ for å montere den primære cilium, et sensorisk organell stikker ut fra celleoverflaten 2. Når cellene gå inn igjen i cellesyklus, er primære cilier demontert og hver centriole dirigerer montering av en procentriole på sin proksimale ende som gradvis forlenges for å danne en moden centriole tre. Ved inntreden av S-fase, slå hjul-lignende struktur som gir 9-gangers symmetri til centriole dannet på overflaten av hvert eksisterende centriole og vil bli undersiden av hver procentriole. Sas6 thatten er uunnværlig for centriole forsamlingen er rekruttert for å danne navet i Cartwheel 4-6. Andre centriolar proteiner blir deretter satt sammen på Cartwheel i en svært regulert, proksimale til distale måte 7. Etter nettopp fullført centriole duplisering, celler montere ekstra pericentriolar materialer for å bygge to funksjonelle centrosomes innen utgangen av G2 fase 8. I tillegg til kjerne centriolar komponenter 9-11, flere andre proteiner inkludert kinaser, fosfataser, anstand, stillaskomponenter, membran tilhørende proteiner og degradering maskiner er forbundet med Sentrioler, basal organer og PCM på ulike tider av cellesyklus 12-16. Det er ofte bemerkes at centrosomal nivåer av mange proteiner er temporært regulert av centrosomal målretting mekanismer og / eller proteasomal nedbrytning ved centrosomes. Viktigere svingningene i centrosomal nivået av flere proteiner som Plk4, Mps1, Sas6, og en CP110t ulike punkter i cellesyklusen ser ut til å være avgjørende for å regulere centriole montering 5,17-22, og i tilfelle av Mps1 hindre dette centrosomal degradering fører til dannelsen av overskytende Sentrioler 19. På den annen side, centrosomal fraksjoner av flere proteiner er mindre labile sammenlignet cytosoliske bassenger. For eksempel siRNA-mediert nedregulering av Centrin 2 (Cetn2) førte til bare en moderat reduksjon av proteinnivå på Sentrioler tross for stor reduksjon i dets hele cellenivåer 23. Det er derfor viktig å måle endringer i nivået av centrosomal proteinene på sentrosomen heller enn å måle hele celle protein nivåer ved vurdering av deres sentrosomen spesifikke funksjoner.

I denne studien har vi utviklet en analyse ved hjelp av indirekte immunfluorescens (IIF) for å kvantifisere den relative nivået av et protein ved centrosomes. Denne analysen er utviklet spesielt for å analysere celler som er fra forskjellige prøverog dermed ikke kan avbildes på samme tid. Disse prøvene kan være celler som ble behandlet med forskjellige reagenser (dvs. medikament versus kontroll), samlet ved forskjellige tidspunkter (dvs. puls versus chase), eller er i forskjellige faser av cellesyklusen. Prinsippet for denne analyse ligger i å måle bakgrunns korrigert fluorescerende intensitet svarende til et protein ved et lite område, og for å normalisere den verdi mot det samme for et annet protein som har nivåer ikke varierer i henhold til de valgte forsøksbetingelser. Flere studier i sentrosomen biologi har nylig benyttet ulike kvantitative mikroskopi teknikker, både levende eller faste celler, for å fastslå sentrosomen-spesifikk funksjon av kandidat proteiner 24-27. I likhet med disse assays, den foreliggende teknikk måler også bakgrunnen korrigert fluorescensintensitet av testprotein. Imidlertid vil inkludering av normalisering ved hjelp av en intern standard i denne analysen sannsynligvis gi størrenøyaktighet og trygghet i å analysere to forskjellige prøver som er på to forskjellige dekkglass. Videre, i tillegg til å undersøke protein-nivå på centrosomes, med mindre justeringer av denne metoden kan anvendes på et variert sett av eksperimentelle betingelser, eller ved andre cellulære områder.

Her kombinerer vi vår kvantitative mikros analysen med en BrdU puls-chase strategi for å sammenligne celler fra ulike cellesyklus stadier. Istedenfor å bruke standard cellesyklus-stans og frigjørings teknikker for å studere forskjellige cellesyklus tidspunkter, asynkront voksende celler blir inkubert med BrdU å merke celler i S-fasen, og de merkede celler blir jaget i forskjellige tidsrom (typisk 4-6 timer). De fleste av de merkede celler vil være i S-fase umiddelbart etter pulsen. Lengden på jakten er valgt slik at etter jakten, vil merkede celler være i slutten av S, G2, eller mitose, som kan bekreftes av morfologiske egenskaper som- posisjon av centrosomes med hensyn til nucLei, avstanden mellom centrosomes, kondensasjon av kromosomer etc. Således vil lengden av chase avhenger av den gjennomsnittlige varigheten av S, G2 og M-fasen av en bestemt celletype. Siden denne fremgangsmåten unngår cellesyklus inhibitorer så som hydroksyurea, aphidicholin, nocodazol, etc., gjør det til en mer fysiologisk relevant cellesyklusanalyse.

Således, viser vi her at den kvantitative fluorescensmikroskopi assay alene, eller i kombinasjon med BrdU puls-chase-analysen, er et enkelt, men kraftig teknikk for nøyaktig å måle de relative endringer i centrosomal nivået av en kandidatprotein under en uforstyrret cellesyklusen. Vi målte centrosomal nivå VDAC3, et protein som vi nylig identifisert på centrosomes i tillegg til mitokondriene 16,28, ved hjelp av disse analysene. Resultater oppnådd her bekrefte vår forrige observasjon at centrosomal pool av VDAC3 er regulert av degradering, og varierer også i en cellesyklus dependent 16 måte, dessuten å validere anvendelse av denne metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture

  1. Bruk menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) udødelig retinal pigment epitelceller (hTERT-RPE1; referert til her som RPE1).
    MERK: RPE1 celler er nær-diploide, ikke-transformerte humane celler som vanligvis brukes til å studere centriole montering og ciliogenesis. Disse cellene følger en normal centriole duplisering syklus koordinert med regulert cellesyklusen.
  2. Passasje en nær sammenflytende 100 mm cellekulturskål av RPE1 celler ved 1: 5 fortynning av den opprinnelige kultur i en frisk 100 mm skål inneholdende 10 ml av DME / F-12 (1: 1) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin (komplett medium omtales som DME / F-12 medium). Dyrke cellene ved 37 ° C i nærvær av 5% CO2.
    1. Inkuber 12 mm runde dekkglass i 50 ml 1 N HCl i et tildekket glassbeger, O / N uten risting ved 60 ° C i et vannbad eller i inkubator.
    2. After kaste syre løsning, vaske Dekk tre ganger i 100 ml destillert vann ved inkubasjon i 15 min med sporadisk risting. Gjenta vaskingen på samme måte i 70% etanol og 95% etanol.
    3. Tørk de Dekk ved individuelt å spre dem ut på en laboratorie-blotting papir i en biosikkerhet skapet, fulgt av sterilisering med UV-bestråling i 60 min.
  3. Plassere 2-4 tørre Dekk i en 35 mm cellekultur parabolen. Fortynn løsningen av fibronektin fibronektin eller lignende konstruert polymer (lager-konsentrasjon på 1 mg / ml) til en konsentrasjon på 25 ug / ml i cellekultur PBS.
    1. Plasser 80-100 ul av den fortynnede løsning på hver dekkglass og inkuberes i 60 min til belegge oversiden av dekkglass. Vask Dekk tre ganger ved hjelp av PBS før du legger komplett medium.

2. voksende celler og Behandling Celler med proteasomhemmere

  1. Passasje 2 x 10 5 asynkront vokseing RPE1 celler i hver 35 mm tallerken som inneholder Dekk og dyrke cellene i 2 ml komplett medium. Sett på kulturmediet hver 24 timer med frisk forvarmet komplett medium.
    1. Å analysere effekten av proteasominhiberingens på centrosomal nivå av test protein (her VDAC3 eller γ-tubulin), dyrke cellene i to 35 mm retter for 44 hr. Sett på kulturmediet med fullstendig medium og tilsett enten MG115 eller DMSO som kontrollmiddel ved en sluttkonsentrasjon på 5 mM eller 0,05% henholdsvis. Samtidig, tilsett BrdU til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 40 mM og inkuberes cellene i 4 timer.
    2. Overfør hver dekkglass i en 24-brønns plate. Legg 500 mL avkjølt metanol til hver brønn og inkuber platen ved -20 ° C i 10 min for å fiksere cellene på dekkglass. Vasker Dekk tre ganger med 500 mL vaskebuffer (1x PBS inneholdende 0,5 mM MgCI2 og 0,05% Triton-X 100).
  2. Høste restceller fra 35 mm skål og sentrifuger cellene ved 1000 xg i 5 min. Bruk cellepelleten å analysere det totale protein ved Western blotting (trinn 6).

3. BrdU Puls og Chase analysen å analysere Protein nivåer i ulike cellesyklus Faser

  1. For å analysere variasjonen av nivået av et protein (her VDAC3, Sas6 eller Cep135) ved centrosomes ved forskjellige faser av cellesyklusen, dyrke cellene i to 35 mm skåler som inneholder dekkglass etter 44 timer. Sett på kulturmediet med komplett medium inneholdende 40 pM BrdU og inkuberes cellene i 4 timer i cellekulturinkubator.
  2. Fra en rett, overføre dekk til en 24-brønners plate for å fiksere cellene ved hjelp av avkjølt metanol som beskrevet i trinn 2.1.2.
  3. Etter 4 timers BrdU puls, fjerner BrdU-inneholdende medium, vaskes cellene en gang med PBS og en gang med komplett medium, tilsett friskt medium og deretter dyrke cellene i fravær av BrdU i forskjellige tidsrom (typisk en 4 timersfor RPE1 celler) før festing av celler som beskrevet i trinn 2.1.2.
    MERK: For RPE1 celler, flertallet av BrdU-positive celler er i slutten av S eller G2-fasen etter en 4 timers jakt. Dette må bestemmes individuelt for hver celletype.

4. Farging

  1. Inkuber de fikserte celler på dekkglass i 200 ul blokkeringsbuffer (2% BSA og 0,1% TritonX-100 i 1 x PBS) i 30 min.
    1. Cellene inkuberes med en blanding av primære antistoffer (typisk en hevet i kanin og en annen hevet i mus) fortynnet i blokkeringsbuffer O / N ved 4 ° C i et fuktet kammer.
    2. For å gjøre en fuktet kammer, sette et vått papirhåndkle i den nederste halvdelen av en tom 1000 mL pipette tips boks. Legge en strimmel av Parafilm på risten overflaten, og oppdage en dråpe (15-20 pl) av antistoffløsningen på Parafilm for hver dekk å bli inkubert. Invertere et dekkglass på en dråpe av antistoffløsningen (slik at cellene er nedsenket) og nærlokket av spissen boksen.
    3. Invertere Dekk igjen og returnere dem tilbake til 24-godt parabolen. Vask objektglassene og deretter inkubere dem i 150 pl sekundært antistoff blanding (her grønt-fluorescerende fargestoff konjugert anti-kanin og rød-fluorescerende fargestoff konjugert anti-mus fortynnet i blokkeringsbuffer) i 1 time ved RT. Vask objektglassene tre ganger.
      MERK: fluoroforpar-konjugert Sekundære antistoffer er lysfølsom. Beskytt prøvene fra lys under trinn 4.1.3-5.1.2.
  2. Klargjør for anti-BrdU-farging ved å feste de fargede RPE1 cellene igjen med 500 ul kald metanol ved -20 ° C i 10 minutter, som beskrevet i trinn 2.1.2. Vask Dekk tre ganger.
    NB: Denne fiksering sikrer det primære og sekundære antistoff merking av protein (er) av interesse i løpet av syrehydrolyseprosessen i det følgende trinn.
    1. Inkuber cellene i 200 pl 2 N HCl i 30 minutter ved RT. Nøytraliser med 300 ul av 1 M Tris-Cl, pH 8 end vaske cellene tre ganger med vaskebuffer.
    2. Blokkere cellene på nytt ved hjelp av 200 ul blokkeringsbuffer i 30 min ved RT.
    3. Inkuber cellene med rotte-anti-BrdU-antistoff (fortynnet i blokkeringsbuffer) i 45 minutter ved 37 ° C i et fuktet kammer. Returnere Dekkglass tilbake til 24-brønners skål, vaske dem, og deretter inkuberes med blå-fluorescerende fargestoff konjugert anti-rotte-sekundært antistoff (fortynnet i 150 ul blokkeringsbuffer i 24-brønners skål i 1 time ved RT.
  3. Vask objektglassene tre ganger. Øye på en dråpe (omtrent 3-6 mL) av en monteringsløsning som inneholder antifade reagent på et glass objektglass. Invertere en dekkglass, med cellen siden ned, på monteringsløsning. Tørk overflødig væske ved å trykke forsiktig på dekk mot raset ved hjelp av myke klut. Påfør gjennomsiktig neglelakk langs kanten av dekkglass å forsegle den på objektglass.

5. Immunfluorescens Bilde Acquisition og analyse

  1. Bruk en 100X Plan Apo oljeneddyppingsobjektivet (med en 1,4 numerisk apertur) om å kjøpe bilder av BrdU-positive RPE1 celler ved romtemperatur.
    1. Sette et lysbilde på mikroskopet (se utstyr) festet med et kamera i stand til digital bildebehandling. For hver fluorophore, bestemme passende eksponeringstid (typisk mellom 300-1000 msek) ved manuelt å undersøke alle prøvene av et eksperiment. Før skaffe bilder av en celle, manuelt bestemme den passende topp og bunn fokalplanet langs Z-aksen (typisk 0,2 um trinnstørrelse). Erverve bilder av forskjellige prøver som er på separate dekkglass ved å bruke identisk eksponeringstiden for forskjellige fluoroforer langs Z-aksen ved hjelp av en digital bildebehandling mikrosprogramvarepakken.
  2. Utføre dekonvolvering (i disse tilfellene bruker Ingen nabo algoritme) av alle bildestakker ervervet langs Z-aksen.
    1. Få tak i den totale intensiteten projeksjon av hvert bilde stabel langsZ-aksen.
  3. I cellene der centrosomes er nær (avstanden mellom to centrosomes er mindre enn 2 mikrometer), tegne en liten firkant (typisk 20-30 piksler per side) rundt begge centrosomes og markere det valgte området.
    1. Tegne en større firkantet (typisk 24-35 piksler per side) som omgir den første plassen og markere det valgte området av den store plassen.
    2. Oppnå det området (A) og det totale fluorescensintensitet (F) på hver fluoroforen i hver boks (S betegner liten boks og L betegner stor boks).
    3. Analyser bakgrunnen korrigert fluorescensintensitet av hver fluorofor ved hjelp av formelen beskrevet av Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A l - A S)].
    4. Oppnå normal fluorescensintensiteten av proteinet av interesse (her VDAC3 eller Sas6) ved å beregne forholdet mellom bakgrunnskorrigerte fluorescensintensitet av sine fluorophore til den av fluoroforen som brukes for den valgte indre standard (her γ-tubulin, Sas6 eller Cep135).
  4. I tilfellet med å analysere celler hvor centrosomes er godt separert (avstanden mellom to centrosomes er større enn 2 um), analysere hver sentrosomen separat ved å trekke to separate sett av bokser. Tegn en liten firkant (typisk 15-25 piksler per side) rundt hver sentrosomen og markere det valgte området. Tegne en større firkantet (20-30 piksler per side) som omgir den første plassen og markere det valgte området.
    1. Oppnå det området (A) og det totale fluorescensintensitet (F) på hver fluoroforen i hver boks, og beregne bakgrunns korrigert fluorescensstyrkene til hver fluorofor, separat for hver sentrosomen, som beskrevet i trinn 5.3.3.
    2. Kombiner de bakgrunns korrigert fluorescensstyrkene til hvert protein fra de to centrosomes for å oppnå den totale centrosomal nivå av at proteinet i den cellen.
    3. Innhentnormaliserte intensiteten for proteinet av interesse ved å beregne forholdet mellom den totale centrosomal intensiteten til den totale centrosomal intensiteten av den interne standard.
  5. Analysere minst 15-25 celler for hver eksperimentell tilstand og plotte grafen i et regneark.

6. Analysere Total protein Bruke Western Blotting

  1. Resuspender cellene i radioimmunopresipitasjon assay (RIPA) buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) og inkuberes i 10 min på is for å lysere cellene.
    1. Sentrifuger blandingen ved 10 000 xg i 10 min, separere lysat fra pelletfraksjonen, og måle det totale proteinkonsentrasjon på hvert lysat ved anvendelse av en bicinchoninic syre (BCA) assay kit.
  2. Bland 40 ug lysat med 4 x SDS-PAGE ladningsbuffer (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 100 mM ditiotreitol, 0,1% Bromophenol blå).
    1. Kok prøvene i 10 min og kjøre prøver på en 12,5% denaturering SDS-PAGE ved en konstant spenning på 200 V.
  3. Overfør proteiner separert på SDS-PAGE på en nitrocellulosemembran ved hjelp av western-blotting-teknikk (ved en konstant spenning på 90 V i 1 time i kaldt).
    1. Blokkere membranen med 3% ikke-fettholdig melk i 1 x PBS, og deretter inkubere membranen med fortynnede oppløsninger av primære antistoffer (i dette tilfelle kanin anti-VDAC3, kanin anti-γ-tubulin og mus anti-α-tubulin) i 1 timer ved romtemperatur.
    2. Etter vasking av membranen tre ganger (hver 5 minutters inkubering med rysting) med PBS-T-buffer (1 x PBS og 0,2% Tween-20), inkubere membranen i en blanding av nær-infrarød (IR) fluorescerende fargestoff konjugert anti-kanin og IR fluorescerende fargestoff konjugerte anti-mus sekundære antistoff (fortynnet i PBS-T) i 1 time.
    3. Vask membranen tre ganger og deretter skanne membranen til å analysere bandene hjelp av en infrarød fluorescence imaging system egnet for immunoblot deteksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vårt nylige studier identifiserte nye centrosomal lokalisering og funksjon av VDAC3, en av de mitokondrielle poriner 16,28. Farging av flere pattedyrceller inkludert RPE1 celler ved hjelp av en VDAC3-spesifikt antistoff viste fremtredende centrosomal flekker og relativt svak mitokondrie farging. Vi viste også at centrosomal VDAC3 fortrinnsvis knyttet til mor centriole, og centrosomal pool av både endogene og ectopically uttrykt VDAC3 reguleres av degradering 16. For å validere den kvantitative IIF analysen undersøkte vi endringene i sentrosomen assosierte VDAC3 basseng i celler som er i S-fase.

Her ble asynkront voksende RPE1 celler behandlet med enten en proteasominhibitor MG115 eller kontrolloppløsningsmiddel DMSO i 4 timer. Å begrense vår analyse til celler som som er i S-fase og gjennomgår sentrosomen montering, vi bare undersøkt celler som innlemmet BrdU during på samme 4 timer og hadde to nært adskilte centrosomes (i avstand innenfor to mikrometer av hverandre). Vi har undersøkt flere tilfeldige områder av celler farget for BrdU og kjerner fra både kontroll- og MG115 behandling (figur 1A) til å konkludere med at den korte behandling av MG115 påvirket ikke BrdU-inkorporering (ca. 58%) sammenlignet med kontrollbehandling (omtrent 56%) i RPE1 celler. Som vi sammenligner kun celler som var i S-fase (som bedømt ved tilstedeværelsen av to γ-tubulin foci i avstand innenfor to mikrometer fra hverandre), vurderte vi γ-tubulin som en potensiell intern standard for normalisering. Dermed må vi først undersøkt om centrosomal γ-tubulin nivåer i BrdU-positive celler variere på proteasomhemmingen. Ikke overraskende var det betydelig celle-til-celle variasjon i γ-tubulin fluorescens intensitet fra en celle til en annen, og vi fant ut at denne variasjonen var best presentert i boks og whisker diagrammer som presenterer datasettet som helhet tilgjengelig. Jegn boksen og whisker diagrammer, bokser representerer nedre og øvre kvartil, markøren i boksen angir medianen av hver serie, og værhårene representerer minimums- og maksimumsverdier, som ofte (men ikke alltid) uteliggere. Som vist i figur 1D, den centrosomal γ-tubulin nivået var ikke signifikant forskjellig mellom BrdU-positive celler behandlet med enten DMSO eller MG115, således validere γ-tubulin som en intern standard for dette eksperimentet. I motsetning til γ-tubulin, bakgrunnen korrigerte fluorescens intensitet som tilsvarer centrosomal VDAC3 var omtrent 2,5 ganger høyere i MG115-behandlede celler enn i kontrollceller (figur 1C). Når vi normalisert total VDAC3 fluorescens mot at γ-tubulin, foldøkningen falt litt til omtrent to ganger (figur 1E). Selv om fold endringen var større uten normalisering, vi har mer tillit til riktigheten av de normaliserte data, som vi føler betteh kontroller for noen generell effekt av MG115 behandling, samt variasjon på grunn av utvalgets behandling. VDAC3 flekker på ikke-centrosomal nettsteder (Figur 1b) eller totalt cellenivå av VDAC3 (figur 1F) ble ikke påvirket av proteasomhemmingen. Dermed vi kvantitativt bekrefte vår forrige observasjon at centrosomal pool av VDAC3 reguleres av proteasome-mediert degradering.

For å måle endringen i centrosomal VDAC3 i løpet av cellesyklusen har vi merkede cellene med en 4 timers BrdU puls etterfulgt av en 4 timers forfølgelse av de merkede celler. Siden bare S-faseceller vil inkorporere BrdU under pulsen (gjennomsnittlig avstand mellom to centrosomes er 1,35 ± 0,16 um), de fleste av BrdU-positive RPE1 celler etter 4 timers jakt vil være ved enten slutten av S-fase eller tidlig fase G2 ( gjennomsnittlig avstand mellom to centrosomes er 1,55 ± 0,22 mikrometer), med en mindre befolkning på sen G2 fase hvor centronoen par har betydelig skilt (gjennomsnittlig avstand mellom to centrosomes> 2 mikrometer) 30. γ-tubulin, være en stor PCM komponent sterkt akkumulerer på centrosomes under sentrosomen modning som foregår på G2 fase 31,32, og denne økningen gjør det en dårlig intern standard for å vurdere cellesyklus varianter av andre centrosomal proteiner. På den annen side er Sas6 rekruttert til procentrioles under tidlig S-fase for å stimulere montering av hjul 4,5,7, og forblir på bunnen av de nydannede Sentrioler inntil celler inn mitose når det begynner å bli redusert (figur 2 og referanse 5). Men i HeLa eller U2OS celler, centriolar nivå Sas6 gradvis øker som celler fremgang fra S-fase til G2 fase 5. Derfor må vi først målte centrosomal Sas6 nivå med hensyn til at av Cep135, en annen kjerne centriolar protein som lokaliserer til de proksimale ende av Sentrioler helecellesyklus 33. Vi observerte ikke noen signifikant forskjell i bakgrunnskorrigerte totale fluorescensstyrkene Cep135 eller Sas6 i BrdU-positive RPE1 celler fra puls eller jage, når centrosomes er tett linjeavstand (figur 3A-D; 'nær' cellene der gjennomsnittlige avstanden mellom to centrosomes er mindre enn 2 um). Følgelig, forble den normalis Sas6 nivå lik i disse celler (figur 3E). Men observerte vi en beskjeden økning i de samlede fluorescens intensitet verdier av Sas6 og en svak økning av det samme for Cep135 i cellene der centrosomes er godt atskilt (avstanden mellom to centrosomes> 2 mikrometer; 'fjerne' celler). Følgelig er den normaliserte totale centrosomal Sas6 nivået i cellene med to godt separerte centrosomes var svakt, men statistisk signifikant høyere enn i celler med tett plasserte centrosomes. Dette er sannsynligvis på grunn av den iboende regulering av Sas6 nivå viddh cellesyklusprogresjon 5. Det er imidlertid også mulig at de svake økninger (som eller lavere statistisk signifikans) er på grunn av tilsetning av fluorescens-intensitetene av to centrosomes som ble analysert hver for seg, sammenlignet med å analysere to centrosomes samtidig i celler med tett plasserte centrosomes. Likevel, når fluorescensintensiteten av VDAC3 ble normalisert med den i Sas6 alene, ble VDAC3 nivå på to nær hverandre centrosomes økte omtrent 1,5 ganger i celler som er i sen S- / tidlig i G2-fasen, sammenlignet med tidlig S-fase- celler (Figur 4A-C, F; 'nære' celler). Når disse cellene videre til slutten av G2-fasen, ble den normaliserte VDAC3 nivå på to centrosomes redusert med 2,4 ganger sammenlignet med den i slutten av S-fasen (Figur 4C, F).

Fordi Sas6 nivåene øker svakt fra slutten av S-fase til G2, ved hjelp av Sas6 som en indre standard fører til en svak overestimering av fellingenrease i VDAC3 nivåer i sene G2-faseceller (centrosomes er adskilt med mer enn 2 um). Mens våre data tyder på at Cep135 er et bedre valg som en intern standard for å vurdere cellesyklusvariasjoner, kan vi ikke bruke den for VDAC3 fordi VDAC3 og Cep135 antistoffer tilgjengelig for oss er begge fra kanin. Men multiplisere medianverdien for Sas6-normalisert VDAC3 (F VDAC3 / F Sas6) av medianverdien av Cep135-normalisert Sas6 gir oss en omtrentlig verdi for Cep135-normalisert VDAC3 [(F VDAC3 / F Sas6) x (F Sas6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Når vi utført denne analysen, endring i VDAC3 nivåer mellom slutten av S / tidlig G2 og sent G2 synker litt til to-fold. BrdU-positive celler som er i en hvilken som helst fase av mitose som bedømt ved kondenserte kromosomer og svak Sas6 farging er ekskludert fra analysen på grunn av den dramatiske fall i Sas6 nivåer. Men vi bemerket at centrosomal VDAC3 nivå reforble lav under mitose (data ikke vist). Fordi Cep135 nivåer ikke slippe under mitose (data ikke vist), kunne vi i prinsippet gjenta re-normalisering prosedyre for å estimere Cep135-normalis VDAC3 nivåer i mitose. Men i virkeligheten centrosomal Sas6 nivåer i mitose ble for variabel for å muliggjøre en nøyaktig bestemmelse av de Sas6-normaliserte VDAC3 nivåene i første omgang. Uansett, samlet, våre data bekreftet at centrosomal pool av VDAC3 reguleres ved centrosomes i løpet av cellesyklusen.

Figur 1
Figur 1. asynkront voksende RPE1 cellene ble inkubert med BrdU og MG115 (MG) ​​eller DMSO (DM) i 4 timer. (A) Vist er tilfeldige felt av DMSO eller MG115 behandlede celler farget med anti-BrdU-antistoff (rød) og Hoechst ( DNA; blå). Her og i alle andre bilder baren representerer fem mikrometer.(BE) DMSO eller MG115 behandlet celler ble farget med antistoffer mot VDAC3, γ-tubulin og BrdU. BrdU-positive celler ble fotografert under identiske bildeforhold (eksponering ganger- 400 msek for blå fluorophore / BrdU, 500 msek for grønn fluorophore / VDAC3, 300 msek for rød fluorophore / γ-tubulin), og bakgrunnen korrigert fluorescensintensiteter av VDAC3 og γ-tubulin ble bestemt. Representative bilder som viser VDAC3 (VD3, grønn), γ-tubulin (γ-badekar, rød) og BrdU (blå) er vist i (B). Her og i alle andre bilder, viser innfellinger digitalt forstørret centrosomes som indikert av rutene. Bakgrunnen korrigeres fluorescensintensiteter (F; i vilkårlige enheter) som tilsvarer VDAC3 og γ-tubulin 20-5-celler er plottet i boksen og whisker diagrammet i (C) og (D) hhv. Her og i alle andre tilfeller boksene representerer nedre og øvre kvartil, marker i boksen (-) indikerer medianen av hver serie, og værhårene representerer minimums- og maksimumsverdier. Normaliserte fluorescens intensitetsverdier av VDAC3 fra de tjuefem-celler er plottet i (E). For (CE), er p-verdi avledet fra uparet t-test. *** Indikerer p <10 -5, og ns tyder p> 0,05. (F) immunoblots viser hel-celle nivåer av VDAC3 (både VDAC3a og VDAC3b 16) og γ-tubulin (γ-tub) hvor α-tubulin (α-tub) lastes kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette figur.

Figur 2
Figur 2. asynkront voksende RPE1 celler som ble merket med en 4 timers BrdU puls og jaget for en annen 4 timer i fravær av BrdU ble farget med antistoffer mot Sas6 (grønn) og γ-tubulin (γ-badekar, rød). Representative bildene viser Sas6 flekker under (A) S-fase (med to nær Sas6 foci), (B) meta (to svake Sas6 foci ved polene) og (C) telophase (Sas6 foci er tapt fra polene). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. asynkront voksende RPE1 celler ble merket med en 4 timers BrdU puls og jaget for en annen 4 timer i fravær av BrdU. BrdU-positive celler farget for Cep135 og Sas6 ble fotografert under identiske bildedannende betingelser (eksponering ganger- 400 msekfor blå fluorophore / BrdU; 400 msek for grønn fluorophore / Cep135; 500 msek for rød fluorophore / Sas6), og bakgrunnen korrigert fluorescensstyrkene Sas6 og Cep135 ble bestemt. Avstanden mellom to centrosomes ble også målt i alle celler. En celle der avstanden mellom to centrosomes er mindre enn 2 mikrometer ble ansett som "nær" og der verdien er mer enn 2 mikrometer ble kategorisert som "fjern". (AB) Representative bilder som viser Cep135 (C135, grønn), Sas6 (rød) og BrdU (blå) er vist. I (B), C1 og C2 er de to centrosomes av den representative "fjernt" celle. (CD) Bakgrunns korrigert fluorescensintensiteter (F; i vilkårlige enheter) svarende til Sas6 (C) og Cep135 (D) fra femten celler fra hver kategori er tegnet opp på boksen og whisker diagram. (E) Normalisert intensiteter av Sas6 from disse cellene er plottet i boksen og whisker diagram. For (CE), er p-verdi avledet fra uparet t-test. * Indikerer 0,001 <p <0,05, og ns tyder p> 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. BrdU-positive celler fra ovenfor BrdU puls-chase analysen (figur 3) farget for VDAC3 og Sas6 ble fotografert under identiske bildeforhold (eksponering ganger- 400 msek for blå fluorophore / BrdU, 500 msek for grønn fluorophore / Sas6; 1000 msek for rød fluorophore / VDAC3), og bakgrunnen korrigert fluorescensstyrkene Sas6 og VDAC3 ble bestemt. Avstanden mellom to centrosomes ble målt i alle celler, og cellene ble kategorisert som 'cmiste "(avstanden mellom to centrosomes <2 mikrometer) og" fjern "(avstanden mellom to centrosomes> 2 mikrometer), som i Figur 3. (AC) Representative bilder av 'nær' celle i BrdU puls (A), i BrdU jage (B), og "fjern" celle i BrdU jage (C) farget for VDAC3 (VD3, grønn), Sas6 (rød) og BrdU (blå) er vist. I (C), C1 og C2 er de to centrosomes. [DE] Bakgrunns korrigert fluorescensintensiteter (F; i vilkårlige enheter) som tilsvarer VDAC3 (D) og Sas6 (E) fra femten celler fra hver kategori er tegnet opp på boksen og whisker diagram. (F) Normalisert intensiteter av VDAC3 fra disse cellene er plottet i boksen og whisker diagram. For (DF), er p-verdi avledet fra uparet t-test. *** Indikerer p <10 -5, **indikerer 10 -5 <p <0,001, og ns tyder p> 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantitativ mikros i cellebiologi er vanligvis forbundet med levende cellebildeanalyser som fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescens Recovery Etter fotobleking (FRAP), etc. Men det er økende eksempler på cellebiologer utviklings ulike kvantitative mikros analyser for fast celler i de senere år 27,34-36. Viktigere, fremgang i forståelsen sentrosomen biologi ofte krever forståelse av sentrosomen-spesifikk funksjon av proteiner som centrosomal bassenger kan være regulert annerledes enn andre bassenger. Således er det utviklet en kvantitativ IIF-analysen for spesifikt å analysere den relative centrosomal nivået av et protein i to ulikt behandlede prøver. På grunn av dette krever at cellene er faste og behandles på separate dekkglass, vi derfor innført en intern standard for formålet med normalisering, for bedre kontroll av eventuelle gjenstander på grunn av nødvendigheten av å håndtere de to experimental cellepopulasjoner separat, og øke nøyaktigheten av analysen. Det er bare noen få tidligere studier 37 som har benyttet en slik intern standard for å måle den relative fluorescensintensitet av et testprotein.

Mens velge en intern standard er avgjørende for nøyaktigheten av vår analyse, er det uten tvil den mest utfordrende delen. Ideelt sett centriole pair duplikater under S-fasen, og de dupliserte Sentrioler deretter samle ytterligere PCM komponenter, inkludert γ-tubulin under G2 slik at de to modne centrosomes kan bli polene på mitotisk spindel. Derfor antar vi at centrosomal nivå av γ-tubulin ikke ville endre seg betydelig i celler som er strengt i S-fase. Dette synes å være tilfelle i RPE1 cellene der S-fase celler er preget av en kort BrdU merking. Imidlertid må gyldigheten av en intern standard testes for hver celletype og eksperimentell tilstand. For eksempel, mens bakgrunnen-tilsvarcted VDAC3 fluorescens økt mer enn to ganger i respons til proteasomhemmingen i aphidicholin behandlet (S-fase arrestert) U2OS celler, var det også en liten, men statistisk signifikant (0,001 <p-verdi <0,05) økning i centrosomal γ-tubulin (supplerende figur). Således er γ-tubulin ikke alltid en egnet intern kontroll, selv for celler som er arrestert i cellesyklusen.

I likhet med alle andre IIF mikroskopi-analyse, er en av ulempene med denne analysen at antistoffer mot testprotein og den indre standard må heves i forskjellige vertsarter. Mens våre data tyder på at Cep135 er en bedre intern standard enn Sas6, kunne vi ikke normalisere VDAC3 nivåer mot Cep135 som de tilgjengelige antistoffer mot disse proteinene ble begge oppvokst i kanin. Derfor har vi i stedet normalisert mot Sas6, noe som forårsaket en overvurdering av nedgangen i VDAC3 nivåer mellom slutten av S-fasen og G2. I en situasjon hvor det internal standard varierer beskjedent, kan man innføre en annen normalisering faktor å ta hensyn til at variasjon. For eksempel, for å korrigere for variasjonen i Sas6, multiplisert vi den Sas6-normalisert VDAC3 intensitet ved Cep135-normalisert Sas6 intensitet.

I tilfeller der du velger en passende intern standard er vanskelig, kan fluorescerende fargestoff belagte sfærer (0,02 til 0,04 mikrometer i diameter) gi en alternativ strategi. Signalet til et fluorescens-mikrokule tilstede i samme felt som cellen av interesse kan brukes til å normalisere den fluorescens-signal som svarer til proteinet av interesse. På den annen side, hvis test- og kontrollcellene blir avbildet sammen, kan man ikke trenger en slik intern standard for normalisering. Vi har tidligere benyttet en versjon av denne analyse for å sammenligne nivået av centrosomal Mps1 i celler som overuttrykker enten syklin A 19 eller Antizyme 20, som enten forebygge 19 eller fremme 20 den degradation av Mps1 ved centrosomes, henholdsvis til at i tilgrensende ikke-transfekterte celler er fotografert på samme tid.

For å undersøke effekten av centrosomal VDAC3 på proteasomhemmingen, brukte vi BrdU merking for å identifisere og sammenligne celler som er i S-fase. Mens MG115 behandling kan inhibere cellesyklusprogresjon, denne inhibering krever en betydelig høyere konsentrasjon enn 38 den som anvendes i denne studien. Ved de konsentrasjoner som brukes her MG115 kan blokkere cellesykluskontrollpunkter og overganger, men ikke blokkerer cellesyklusprogresjon. Imidlertid må det bli bekreftet for hver celletype, som vi her ved å vise at MG115 ikke endre prosentandelen av BrdU positive celler sammenlignet med DMSO. Imidlertid stoppe celler i S-fasen ved hjelp av aphidicholin eller hydroksyurea (HU), eller synkronisering av celler ved hjelp av mitotisk "riste-off" og frigi eller dobbelt tymidin blokk og frigjøring kan brukes som alternative fremgangsmåter for å generere tilsvarende bestandsjoner av celler i S-fase.

Den BrdU puls-chase strategi for å studere cellesyklus tidspunkter vil være meget nyttig i mange funksjonelle analyser som krever en uaffisert cellesyklusen. Dette er en biologisk mer betydelig assay som kan være i stand til å erstatte cellesyklus-stans ved hjelp av ulike teknikker for cellesyklus inhibitorer. Bruk av disse inhibitorer kan ofte føre til forskjellige typer av fysiologisk stress i celler som resulterer i avvikende endringer i cellesyklus fenotyper. Bruk av puls-chase tilnærming mulig for oss å vise at utarming av Cetn2 bare forsinket centriole montering 39 i motsetning til å forårsake en hel blokk som foreslått av tidligere studier 23. Detektering av BrdU-positive celler krever syrehydrolyse av prøvene. Vi og mange andre forskere bruker en teknikk som gjen løser celler etter primær og sekundær farging for test proteiner, før syrehydrolyse, med ubetydelig tap av fargeintensitet for different sentrosomen proteiner 40. Imidlertid kan en potensielt alternativ være å bruke 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EDU), en annen tymidinanalog som er, i likhet med BrdU, inkorporeres effektivt i replikerende DNA 41. Visualisering av Edu bruke "klikk kjemi" krever ikke syrehydrolyse 42, og kan derfor mer egnet for noen antistoffer.

I tillegg kan denne analysen lett brukes til å måle endringen i post-translasjonelle modifikasjoner av et bestemt protein ved centrosomes. For eksempel kan centrosomal nivå av fosforylering normaliseres mot det totale nivå av proteinet i seg selv, forutsatt at fosforyleringssete-spesifikke antistoffer eksisterer. Denne analysen kan umiddelbart anvendes til å vurdere relative nivåer av fosforylering mellom eksperimentelle betingelser eller cellesyklusfaser, men kan eventuelt være innrettet til å vurdere de totale nivåer av fosforylering hvis kritiske parametere av antistoff affinteter er kjent eller kan bestemmes. Denne analysen bør også være aktuelt for studier av proteiner på noe annet nettsted i cellene, selv om regionen av interesse bør ikke være for stor. Analysen vil være spesielt anvendelig for å måle plasseringen spesifikke modulering av et protein som er lokalisert på flere cellulære områder.

Det finnes en håndfull av tekniske parametere som differensialfotobleking, effekten av digital bildebehandling, linearitet fluorescensstyrkene av fluoroforer, bakgrunnsstøy etc. som må tas i betraktning for å maksimalisere nøyaktigheten av målingen 43. For eksempel kan man bytte fluorokrom tilknyttet hvert sekundært antistoff for å vurdere bidraget av fotobleking. Mange andre parametre kan kontrolleres dersom man bruker identiske bildeforhold (eksponeringstid, gevinst, trinnstørrelse, antall Z-stabler, etc.) og det samme bildebehandlingsprogrammer i hvert bilde løp. Selv om vi brukteNo-nabo algoritme hele vår analyse for å utføre bilde dekonvolvering, kan denne analysen kombineres med andre dekonvolvering algoritme som begrenset iterativ. Vi ser også at det skal være enkelt å tilpasse denne analysen til en rekke forskjellige avbildningsprogramvarepakker, som er lettest tilgjengelig programvare for bildeanalyse har verktøy for analyse av fluorescensintensiteten og avstander.

Denne analysen bør være aktuelt for alle celletype, og vårt valg av Cellene her er utelukkende basert på deres relevans i sentrosomen biologi forskning, og deres bruk i våre tidligere undersøkelser av centrosomal VDAC3 funksjon 16,28. Men til gyldigheten av interne standarder og riktige tider for puls-chase identifisere celler i S-fase, G2, eller mitose må bestemmes for hver celletype. Samlet sett vil vår nyutviklede kvantitativ fluorescens teknikk i kombinasjon med BrdU puls-chase analysen være en svært nyttig metode for å løse flere intrikatemekanismer i sentrosomen biologi og i mange bredere aspekter av cellebiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma F8141 Stock of 1 mg/ml in water
DMSO Sigma D2650
MG115 Sigma SCP0005 Stock of 10 mM in DMSO
BrdU Sigma B5002 Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) Sigma T 6557 1:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)  Aviva Systems Biology ARP35180-P050 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)  Santa cruz biotechnology sc-81431 1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) Abcam ab-75005 1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)  Abcam ab6326 1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Life technologies A21093 1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21202 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21203 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21206 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21207 1:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) Sigma T5192 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) Sigma T9026 1:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A10043 1:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated Rockland antibodies 610-731-002 1:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent  Life technologies S36936 Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1 Fisherbrand 12-545-80
Olympus IX-81 microscope Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera QImaging  32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective Olympus 1.4 numerical aperture
Slidebook software package Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay Thermo Scientific 23227
U-MNU2 Narrow UV cube Olympus U-M622 Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube Olympus U-M643 Filter
U-MNU2 Narrow Green cube Olympus U-M663 Filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Tags

Cellular Biology sentrosomen montering cellesyklus centrosomal degradering kvantitativ fluorescens mikroskopi normalisering VDAC3 BrdU puls-chase
Kvantitativ Immunfluorescens analysen Mål Variasjon i protein nivåer på Centrosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Majumder, S., Fisk, H. A.… More

Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes. J. Vis. Exp. (94), e52030, doi:10.3791/52030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter