Abstract
Centrosomi sono piccoli ma importanti organelli che servono come i poli di mitotico mandrino per mantenere l'integrità genomica o assemblare cilia primario per agevolare le funzioni sensoriali nelle cellule. Il livello di una proteina può essere regolata in modo diverso a centrosomes rispetto ad altre posizioni .cellular, e la variazione nel livello centrosomica di diverse proteine in punti diversi del ciclo cellulare sembra essere cruciale per la corretta regolazione del complessivo centriolo. Abbiamo sviluppato un microscopio a fluorescenza dosaggio quantitativo che misura variazioni relative del livello di una proteina a centrosomes in cellule fisse di diversi campioni, come in diverse fasi del ciclo cellulare o dopo trattamento con vari reagenti. Il principio di questo test consiste nel misurare l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione, e normalizzare che misura contro lo stesso per un'altra proteina che non varia con il c sperimentale presceltoondition. Utilizzando questo test, in combinazione con l'impulso BrdU e la strategia caccia di studiare cicli cellulari imperturbati, abbiamo quantitativamente convalidato la nostra recente osservazione che il pool di centrosomica VDAC3 è regolata a centrosomi durante il ciclo cellulare, probabilmente dalla degradazione proteasoma-mediata specificamente a centrosomi.
Introduction
Centrosomi costituiti da una coppia di centrioli circondate da materiale pericentriolar (PCM). Essendo i principali centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) in cellule di mammifero, centrosomi servono come i due poli di fusi mitotici nelle cellule in divisione, e quindi aiutano a mantenere l'integrità genomica 1. Nelle cellule quiescenti (ad esempio, durante la fase G0), uno dei due centrioli del centrosoma, cioè centriolo madre, si trasforma in un corpo basale per assemblare il cilium primaria, un organello sensoriale sporge dalla superficie cellulare 2. Una volta che le cellule ri-entrare nel ciclo cellulare, cilia primaria sono smontati e ogni centriolo dirige il montaggio di un procentriole alla sua estremità prossimale che allunga progressivamente a formare una centriolo maturo 3. All'inizio della fase S, una struttura di carro-like che fornisce la simmetria 9 volte al centriolo è formata sulla superficie di ciascun centriole esistente e diventerà la base di ogni procentriole. SAS6 tcappello è indispensabile per il montaggio centriolo viene reclutato per formare il fulcro della Cartwheel 4-6. Altre proteine centriolar vengono poi assemblati sul cartwheel in un altamente regolamentato, prossimale a distale maniera 7. Dopo aver completato proprio centriolo duplicazione, cellule assemblare materiali pericentriolar supplementari per la costruzione di due centrosomi funzionali entro la fine della fase G2 8. Oltre ai componenti centriolar base 9-11, diverse altre proteine tra cui chinasi, fosfatasi, accompagnatori, componenti del ponteggio, proteine associate membrana e macchinari degrado sono associate a centrioli, corpi basali e PCM in momenti diversi del ciclo cellulare 12-16. Si è spesso osservato che i livelli centrosomica di molte proteine sono temporalmente regolati da meccanismi di targeting centrosomica e / o degradazione del proteasoma in centrosomes. È importante sottolineare che le fluttuazioni del livello centrosomica di diverse proteine come Plk4, Mps1, SAS6, e CP110 unt diversi punti del ciclo cellulare sembra essere essenziale per regolare centriole assemblaggio 5,17-22, e nel caso di Mps1 prevenire questa degradazione centrosomica porta alla formazione di centrioli eccesso 19. D'altra parte, le frazioni centrosomica di diverse proteine sono meno labile rispetto alle piscine citosolici. Per esempio siRNA-mediata down-regulation di Centrin 2 (Cetn2) ha comportato solo una riduzione moderata del livello di proteine nelle centrioli nonostante grande riduzione dei suoi livelli di cellule intere 23. E 'quindi fondamentale per misurare le variazioni del livello delle proteine centrosomica al centrosoma, piuttosto che misurare i livelli di proteine intere cellule nel valutare le loro funzioni specifiche centrosoma.
In questo studio abbiamo sviluppato un saggio con immunofluorescenza indiretta (IIF) per quantificare il livello relativo di una proteina a centrosomi. Questo test è stato sviluppato in particolare per analizzare cellule che sono da diversi campionie quindi non può essere ripreso contemporaneamente. Questi campioni possono essere le cellule che sono stati trattati con diversi reagenti (cioè, farmaco contro controllo), raccolti in diversi momenti (ad esempio, impulsi contro chase), o sono in diverse fasi del ciclo cellulare. Il principio di questo test consiste nel misurare l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione e per normalizzare tale valore contro lo stesso per un'altra proteina i cui livelli non variano nelle condizioni sperimentali adottate. Diversi studi in biologia centrosome hanno recentemente utilizzato varie tecniche di microscopia quantitative, in entrambe le cellule vive o fissi, per determinare la funzione specifica centrosoma di proteine candidate 24-27. Simile a tali saggi, la tecnica attuale misura anche il fondo corretta intensità di fluorescenza della proteina. Tuttavia, l'inclusione della normalizzazione usando uno standard interno in questo saggio sarebbe probabilmente offrire maggiorela precisione e la fiducia ad analizzare due campioni diversi che si trovano su due lamelle differenti. Inoltre, oltre ad esaminare il livello di proteine a centrosomes, con piccole modifiche questo metodo può essere applicato ad un insieme eterogeneo di condizioni sperimentali o in altri siti cellulari.
Qui, uniamo la nostra analisi di microscopia quantitativa con una strategia di pulse-chase BrdU per confrontare le cellule provenienti da diverse fasi del ciclo cellulare. Invece di utilizzare tecniche di arresto del ciclo cellulare normale e rilascio di studiare vari momenti del ciclo cellulare, le cellule in modo asincrono in crescita sono incubate con BrdU per etichettare le cellule in fase S, e le cellule marcate sono inseguiti per diverse volte (in genere 4-6 hr). La maggior parte delle cellule marcate saranno in fase S immediatamente dopo l'impulso. La lunghezza della caccia è scelto in modo che dopo la caccia, cellule marcate saranno in ritardo S, G2 o mitosi, che può essere verificata da caratteristiche morfologiche tale posizione as- di centrosomi rispetto nuclei, distanza tra centrosomi, condensazione di cromosomi ecc Quindi, la lunghezza della caccia dipende dalla durata media di S, G2 e M di fase di un particolare tipo di cellula. Poiché questo approccio evita inibitori del ciclo cellulare come idrossiurea, afidicolina, nocodazole, ecc, permette una analisi più fisiologicamente rilevanti ciclo cellulare.
Così, abbiamo dimostrato qui che la microscopia a fluorescenza quantitativa dosaggio soli, o in combinazione con BrdU test pulse-chase, è una tecnica semplice ma potente per misurare con precisione le relative variazioni del livello centrosomica di una proteina candidato durante un ciclo cellulare imperturbato. Abbiamo misurato il livello di centrosomica VDAC3, una proteina che abbiamo recentemente identificato in centrosomi, oltre ai mitocondri 16,28, con questi test. I risultati ottenuti qui verificare la nostra osservazione precedente che il pool di centrosomica VDAC3 è regolato da degrado, e varia anche in un dependen ciclo cellularet modo 16, inoltre, convalida l'applicabilità di questo metodo.
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Protocol
Cultura 1. Cella
- Utilizzare telomerasi umana trascrittasi inversa (hTERT) cellule epiteliali del pigmento retinico immortalati (hTERT-RPE1, di cui qui RPE1).
NOTA: le cellule RPE1 sono quasi diploide, non trasformati cellule umane che sono comunemente usati per studiare l'assemblaggio centriolo e ciliogenesis. Queste cellule seguono un normale ciclo di duplicazione centriolo coordinato con un ciclo cellulare regolamentato. - Passaggio un quasi confluenti 100 millimetri piatto di coltura cellulare delle cellule RPE1 a diluizione 1: 5 della coltura originale in un piatto dolce 100 mm avente 10 ml di DME / F-12 (1: 1) media supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U / ml di penicillina G e 100 ug / ml di streptomicina (terreno completo è fatto riferimento come DME / F-12 di media). Grow cellule a 37 ° C in presenza di 5% CO 2.
- Incubare 12 millimetri rotondi vetrini in 50 ml di HCl 1 N in un bicchiere di vetro coperto, O / N senza agitazione, a 60 ° C in un bagno d'acqua o incubatore.
- After scartando la soluzione di acido, lavare i coprioggetti tre volte in 100 ml di acqua distillata incubando per 15 min, con agitazione intermittente. Ripetere il lavaggio simile in 70% etanolo e il 95% di etanolo.
- Asciugare i coprioggetti dai loro diffusione singolarmente su una carta assorbente da laboratorio in un armadio biosicurezza, seguita da sterilizzazione con radiazioni UV per 60 min.
- Mettere 2-4 coprioggetto secco in un piatto di coltura cellulare di 35 mm. Diluire la soluzione di fibronectina o fibronectina come polimero ingegnerizzato (concentrazione archivio di 1 mg / ml) ad una concentrazione di 25 ug / ml in PBS coltura cellulare.
- Mettere 80-100 ml di soluzione diluita su ogni coprioggetto e incubare per 60 min per rivestire il lato superiore del vetrino. Lavare i coprioggetti tre volte con PBS prima di aggiungere terreno completo.
2. crescita delle cellule e cellule Trattare con Proteasome Inhibitors
- Passaggio 2 x 10 5 asincrono crescerecellule ing RPE1 in ogni piatto 35 millimetri contenente coprioggetto e far crescere le cellule in 2 ml terreno completo. Sostituire il terreno di coltura ogni 24 ore con terreno completo fresco pre-riscaldato.
- Per analizzare l'effetto di inibizione del proteasoma a livello centrosomica della proteina di prova (qui VDAC3 o γ-tubulina), crescono le cellule in due 35 piatti mm per 44 ore. Sostituire il terreno di coltura con terreno completo e aggiungere sia MG115 o DMSO come solvente comando ad una concentrazione finale di 5 mM o 0,05% rispettivamente. Allo stesso tempo, aggiungere BrdU alle cellule ad una concentrazione finale di 40 mM e incubare cellule per 4 ore.
- Trasferire ogni coprioggetto in un 24-pozzetti. Aggiungere metanolo 500 microlitri refrigerata a ciascun pozzetto e incubare la piastra a -20 ° C per 10 minuti per fissare le cellule sui vetrini. Lavare immediatamente i vetrini tre volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (PBS 1x contenente 0,5 mM MgCl 2 e il 0,05% Triton-X 100).
- Raccogliere il residuocellule dal piatto da 35 mm e centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min. Utilizzare il pellet di cellule per analizzare le proteine mediante western blotting (punto 6).
3. BrdU Pulse e Chase test per analizzare i livelli di proteine nelle diverse fasi del ciclo cellulare
- Per analizzare la variazione del livello di una proteina (qui VDAC3, SAS6 o Cep135) a centrosomes nelle diverse fasi del ciclo cellulare, crescere le cellule in due piatti 35 mm contenenti coprioggetti per 44 hr. Sostituire il terreno di coltura con terreno completo contenente 40 mM BrdU e incubare le cellule per 4 ore nell'incubatrice coltura cellulare.
- Da un piatto, di trasferire i coprioggetti di un 24-pozzetti per fissare le cellule utilizzando metanolo freddo come descritto al punto 2.1.2.
- Dopo l'impulso di BrdU 4 ore, rimuovere il terreno-BrdU contenente, lavare le cellule una volta con PBS ed una volta con mezzo completo, aggiungere mezzo fresco, e poi far crescere le cellule in assenza di BrdU per vari tempi (tipicamente un'altra 4 hrper le cellule RPE1) prima che fissa le cellule come descritto al punto 2.1.2.
NOTA: Per le cellule RPE1, la maggior parte delle cellule BrdU-positive sono in ritardo S o G2-fase, dopo un inseguimento 4 ore. Questo deve essere determinata in modo indipendente per ciascun tipo di cellula.
4. Immunostaining
- Incubare le cellule fissate su vetrini in 200 microlitri di tampone bloccante (2% BSA e 0,1% TritonX-100 in PBS 1x) per 30 min.
- Incubare le cellule con una miscela di anticorpi primari (tipicamente un risalto in coniglio e un'altra sollevato nel topo) diluito in tampone di bloccaggio O / N a 4 ° C in una camera umidificata.
- Per fare una camera umidificata, mettere un tovagliolo di carta bagnata nella metà inferiore di un 1.000 ml box puntale vuota. Disporre una striscia di Parafilm sulla superficie cremagliera, e individuare una goccia (15-20 ml) della soluzione di anticorpi sulla Parafilm per ogni coprioggetto da incubate. Invertire un coprioggetto su una goccia di soluzione di anticorpi (in modo che le cellule sono immerse) e vicinoil coperchio della scatola punta.
- Capovolgere nuovamente coprioggetto e tornare al piatto 24-bene. Lavare coprioggetto e poi incubare 150 miscela anticorpo secondario microlitri (qui green-colorante fluorescente coniugato anti-coniglio e colorante rosso fluorescente coniugato anti-topo diluito in tampone di bloccaggio) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i coprioggetti tre volte.
NOTA: Gli anticorpi secondari fluoroforo-coniugato sono fotosensibili. Proteggere i campioni dalla luce durante le fasi 4.1.3-5.1.2.
- Preparatevi per la colorazione anti-BrdU fissando cellule RPE1 colorate di nuovo con 500 microlitri metanolo raffreddato a -20 ° C per 10 minuti, come descritto al punto 2.1.2. Lavare i coprioggetti tre volte.
NOTA: Questa fissazione assicura l'etichettatura anticorpo primario e secondario della proteina (s) di interesse durante il processo di idrolisi acida nel passaggio seguente.- Incubare le cellule in 200 ml di 2 N HCl per 30 minuti a RT. Neutralizzare con 300 ml di 1 M Tris-Cl, pH 8 und lavare le cellule tre volte con tampone di lavaggio.
- Bloccare le cellule nuovamente utilizzando 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti a RT.
- Incubare le cellule con anticorpo anti-topo (BrdU diluito in tampone di bloccaggio) per 45 min a 37 ° C in una camera umidificata. Restituisce i coprioggetti torna al piatto 24 pozzetti, lavarli e poi incubare con blu-colorante fluorescente coniugato anti-rat anticorpo secondario (diluito in 150 ml di soluzione bloccaggio in piatto 24 pozzetti per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i coprioggetti tre volte. Spot una goccia (circa 3-6 ml) di una soluzione di montaggio contenente antifade reattivo su un vetrino da microscopio in vetro. Invertire un coprioggetto, con la cellula-lato rivolto verso il basso, sulla soluzione di montaggio. Pulire il liquido in eccesso premendo delicatamente il vetrino contro il vetrino utilizzando tessuti di pulizia molli. Applicare lo smalto trasparente lungo il bordo del vetrino per sigillarlo sul vetrino da microscopio.
5. immunofluorescenza Immagine Acquisition e analisi
- Utilizzare un obiettivo ad immersione 100X Plan Apo (con un'apertura numerica 1.4) per acquisire le immagini di cellule RPE1 BrdU-positive a temperatura ambiente.
- Mettere un vetrino sul microscopio (vedi attrezzature) collegato con una macchina fotografica in grado di digital imaging. Per ciascun fluoroforo, determinare il tempo di esposizione appropriata (tipicamente tra 300-1,000 msec) esaminando manualmente tutti i campioni di un esperimento. Prima di acquisire immagini di una cella, determinare manualmente all'inizio appropriato e piano focale inferiore lungo l'asse Z (tipicamente 0,2 micron passo). Acquisire le immagini di diversi campioni che si trovano su vetrini separati con tempo di esposizione identico per i diversi fluorofori lungo l'asse Z utilizzando un pacchetto software di imaging digitale di microscopia.
- Eseguire deconvoluzione (in questi casi utilizzando n algoritmo prossimo) di tutte le pile di immagine acquisiti lungo l'asse Z.
- Ottenere la proiezione intensità totale di ogni pila di immagini insiemeZ.
- Nelle cellule dove centrosomi sono vicini (distanza tra due centrosomi è inferiore a 2 micron), disegnare una piccola piazza (tipicamente 20-30 pixel per lato) intorno ad entrambi i centrosomi e segnare l'area selezionata.
- Disegnare un quadrato più grande (in genere 24-35 pixel per lato) che circondano la prima piazza e segnare l'area selezionata del piazzale.
- Ottenere la zona (A) e l'intensità di fluorescenza totale (F) di ciascun fluoroforo in ciascuna casella (S denota piccola scatola e L indica grande scatola).
- Analizzare il fondo corretta intensità di fluorescenza di ciascun fluoroforo utilizzando la formula descritta da Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)].
- Ottenere l'intensità di fluorescenza normalizzata della proteina di interesse (qui VDAC3 o SAS6) calcolando il rapporto tra l'intensità di fluorescenza di fondo corretto dei suoi fluorophore a quella del fluoroforo utilizzato per lo standard prescelto interno (qui γ-tubulina, SAS6 o Cep135).
- Nel caso di analisi cellule dove centrosomes sono ben separati (distanza tra due centrosomi è maggiore di 2 micron), analizzare ogni centrosome separatamente disegnando due gruppi separati di scatole. Disegnare una piccola piazza (tipicamente 15-25 pixel per lato) intorno ad ogni centrosomi e segnare l'area selezionata. Disegnare un quadrato più grande (20-30 pixel per lato) che circondano la prima piazza e segnare l'area selezionata.
- Ottenere la zona (A) e l'intensità di fluorescenza totale (F) di ciascun fluoroforo in ogni casella, e calcolare correzione del fondo fluorescenza intensità di ciascun fluoroforo, separatamente per ciascuna centrosome, come descritto al punto 5.3.3.
- Combinare correzione del fondo fluorescenza intensità di ciascuna proteina dai due centrosomi per ottenere il livello centrosomica totale di proteine che in quella cella.
- Ottenere ilintensità normalizzata per la proteina di interesse calcolando il rapporto tra l'intensità totale centrosomica all'intensità centrosomica totale dello standard interno.
- Analizzare almeno 15-25 cellule per ogni condizione sperimentale e tracciare il grafico in un foglio di calcolo.
6. Analizzando il Proteine totali Utilizzando Western Blotting
- Risospendere le cellule in radioimmunoprecipitazione dosaggio (RIPA) tampone contenente 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% desossicolato di sodio, 0,1% sodio dodecil solfato (SDS) e incubare per 10 min in ghiaccio per lisare le cellule.
- Centrifugare la miscela a 10.000 xg per 10 min, separare il lisato dalla frazione pellet e misurare la concentrazione di proteine totali di ciascun lisato utilizzando un acido bicinconinico (BCA) Kit test.
- Mescolare 40 ug di lisato con 4x SDS-PAGE tampone di caricamento (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, ditiotreitolo 100 mM, 0,1% Bromophenol blu).
- Lessare i campioni per 10 minuti ed eseguire i campioni su un 12,5% di denaturazione SDS-PAGE ad una tensione costante di 200 V.
- Trasferire le proteine separate su SDS-PAGE su una membrana di nitrocellulosa utilizzando la tecnica western blotting (ad una tensione costante di 90 V per 1 ora a freddo).
- Bloccare la membrana con 3% latte scremato in PBS 1x e quindi incubare la membrana con soluzioni di anticorpi primari diluiti (in questo caso coniglio anti-VDAC3, coniglio anti-γ-tubulina e topo anti-α-tubulina) per 1 ora a RT.
- Dopo aver lavato la membrana tre volte (ogni 5 min di incubazione sotto agitando) usando tampone PBS-T (PBS 1x e 0,2% Tween-20), incubare la membrana in una miscela di infrarosso vicino (IR) colorante fluorescente coniugato anti-coniglio e colorante fluorescente IR coniugati anti-topo anticorpi secondari (diluito in PBS-T) per 1 ora.
- Lavare la membrana per tre volte e quindi acquisire la membrana per analizzare le fasce con un f infrarossisistema di imaging luorescence adatto per il rilevamento immunoblot.
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Representative Results
I nostri studi recenti identificati romanzo localizzazione centrosomica e la funzione di VDAC3, uno dei porine mitocondriali 16,28. Immunostaining di diverse cellule di mammiferi, tra cui le cellule RPE1 utilizzando un anticorpo VDAC3 specifico ha mostrato prominente colorazione centrosomica e relativamente debole colorazione mitocondriale. Abbiamo anche dimostrato che VDAC3 centrosomica è preferenzialmente associata al centriolo madre, e la piscina centrosomica sia endogeno e ectopicamente espresso VDAC3 è regolata dalla degradazione 16. Per convalidare il dosaggio quantitativo IIF abbiamo esaminato i cambiamenti nella piscina VDAC3 centrosoma associate nelle cellule che sono in fase S.
Qui, le cellule RPE1 asincrono in crescita sono stati trattati con l'inibitore del proteasoma MG115 o il solvente DMSO di controllo per 4 ore. Per limitare la nostra analisi a cellule che sono in fase S e in fase di assemblaggio dei centrosomi, abbiamo esaminato solo cellule che incorporati BrdU dusuonare le stesse 4 ore e aveva due centrosomi ravvicinati (distanziati entro 2 micron di ogni altro). Abbiamo esaminato più campi casuali di cellule colorate per BrdU e nuclei provenienti sia il controllo e il trattamento MG115 (Figura 1A) per concludere che il breve trattamento di MG115 non ha influenzato l'incorporazione di BrdU (circa il 58%) rispetto al trattamento di controllo (circa 56%) in cellule RPE1. Come abbiamo confrontando solo le cellule che erano in fase S (come giudicato dalla presenza di due fuochi γ-tubulina distanziati entro 2 micron l'uno dall'altro), abbiamo considerato γ-tubulina come potenziale standard interno per la normalizzazione. Così, abbiamo prima esaminato se centrosomica livelli γ-tubulina nelle cellule BrdU-positive variano su proteosoma. Non sorprendentemente, c'era notevole variazione cellula-cellula γ-tubulina intensità di fluorescenza da una cella ad un'altra, e abbiamo scoperto che questa variazione era meglio illustrati nel riquadro e basette diagrammi che presentano i dati impostati come un tutto disponibili. Iobox n e baffi diagrammi, caselle rappresentano quartile inferiore e superiore, il marcatore nella casella indica la mediana di ogni serie, ei baffi rappresentano valori minimi e massimi, che sono spesso (se non sempre) valori anomali. Come si vede nella figura 1D, il livello di γ-tubulina centrosomica non era significativamente differente tra le cellule BrdU-positive trattati con MG115 o DMSO, convalidando quindi γ-tubulina come standard interno per questo esperimento. In contrasto con γ-tubulina, l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente a VDAC3 centrosomica è stato di circa 2,5 volte maggiore nelle cellule MG115-trattate rispetto alle cellule di controllo (Figura 1C). Quando abbiamo normalizzato fluorescenza totale VDAC3 contro quella di γ-tubulina, la piega aumento è leggermente diminuito a circa due volte (Figura 1E). Sebbene il cambiamento volte è stato maggiore, senza la normalizzazione, abbiamo più fiducia nella correttezza dei dati normalizzati, che riteniamo Bettcontrolli er per qualsiasi effetto generale di trattamento MG115, nonché variazioni dovuti alla trasformazione campione. VDAC3 colorazione in siti non centrosomica (Figura 1B) o il livello cellulare totale di VDAC3 (Figura 1F) non è stata influenzata dalla inibizione del proteasoma. Così, abbiamo quantitativamente verifichiamo la nostra osservazione precedente che il pool di centrosomica VDAC3 è regolata dalla degradazione proteasoma-mediata.
Per misurare la variazione VDAC3 centrosomica durante il ciclo cellulare abbiamo marcato le cellule con un impulso BrdU 4 ore seguita da un inseguimento 4 ore delle cellule marcate. Dal momento che solo le cellule in fase S includeranno BrdU durante l'impulso (distanza media tra due centrosomi è di 1,35 ± 0,16 micron), la maggior parte delle cellule RPE1 BrdU-positive dopo 4 ore di inseguimento sarà sia a tarda fase S o prima fase G2 ( distanza media tra due centrosomi è 1.55 ± 0,22 micron), con una popolazione minore a tarda fase G2 dove il centroqualche coppia ha notevolmente separati (distanza media tra due centrosomi> 2 micron) 30. γ-tubulina, essendo un importante elemento PCM accumula notevolmente in centrosomi durante la maturazione dei centrosomi che si svolge nella fase G2 31,32, e questo lo rende un aumento standard interno povero per valutare le variazioni del ciclo cellulare di altre proteine centrosomica. D'altra parte, SAS6 è assunto per procentrioles durante la prima fase S per stimolare assemblaggio dei cartwheels 4,5,7, e rimane alla base dei centrioli neoformati fino cellule entrano mitosi quando inizia a degradarsi (Figura 2 e riferimento 5). Tuttavia, in cellule HeLa o U2OS, il livello di centriolar SAS6 aumenta gradualmente come cellule progrediscono da S-fase per fase G2 5. Pertanto, abbiamo prima misurato il livello SAS6 centrosomica rispetto a quello di Cep135, un'altra proteina centrale centriolar che localizza alle estremità prossimali dei centrioli tuttail ciclo cellulare 33. Non abbiamo osservato differenze significative sullo sfondo con correzione totale intensità di fluorescenza di Cep135 o SAS6 in cellule RPE1 BrdU-positive da impulsi o caccia, quando centrosomi sono ravvicinati (Figura 3A-D; 'vicino' cellule distanza media tra cui due centrosomes è inferiore a 2 micron). Di conseguenza, il livello SAS6 normalizzato rimasta simile in queste cellule (Figura 3E). Tuttavia, abbiamo osservato un modesto aumento dei valori complessivi di intensità di fluorescenza di SAS6 e un lieve aumento degli stessi per Cep135 in cellule in cui centrosomes sono ben separati (distanza tra due centrosomi> 2 micron; cellule 'lontane'). Di conseguenza, il livello totale normalizzato SAS6 centrosomica in cellule con due centrosomi ben separati era leggermente, ma statisticamente significativamente superiore che nelle cellule con centrosomi ravvicinati. Ciò è probabilmente dovuto alla regolamentazione inerente SAS6 livello witla progressione del ciclo cellulare 5 h. Tuttavia, è anche possibile che i lievi incrementi (che o di significatività statistica inferiore) sono dovuta all'aggiunta intensità di fluorescenza di due centrosomi che sono state analizzate separatamente rispetto all'analisi due centrosomi contemporaneamente in cellule con centrosomi ravvicinati. Tuttavia, quando l'intensità di fluorescenza di VDAC3 stata normalizzata a quella della sola SAS6, il livello VDAC3 a due centrosomi ravvicinati è aumentata circa 1,5 volte in cellule a S / inizio G2-fase tardiva, rispetto alla fase S precoce cellule (Figura 4A-C, F, «stretti» celle). Quando queste cellule progrediscono a tarda fase G2, il livello VDAC3 normalizzato a due centrosomi è stato ridotto di 2,4 volte rispetto a quella alla fine della fase S (Figura 4C, F).
Poiché i livelli SAS6 aumentano leggermente da S-fase tardi per G2, utilizzando SAS6 come standard interno porta ad una leggera sovrastima del dicembrerease in livelli VDAC3 in cellule tardo G2 fase (centrosomi sono separati da più di 2 micron). Mentre i nostri dati suggeriscono che Cep135 è una scelta migliore come standard interno per valutare le variazioni del ciclo cellulare, non possiamo usare per VDAC3 perché i VDAC3 e Cep135 anticorpi a nostra disposizione sono sia da coniglio. Tuttavia, noi moltiplicando il valore mediano per VDAC3 SAS6-normalizzato (F VDAC3 / F SAS6) per il valore medio di Cep135-normalizzato SAS6 dà un valore approssimativo per VDAC3 Cep135-normalizzato [(F VDAC3 / F SAS6) x (F SAS6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Quando abbiamo eseguito questa analisi, il cambiamento nei livelli VDAC3 tra la fine di S / inizio G2 e tardiva G2 scende leggermente per 2 volte. Cellule BrdU-positive che si trovano in qualsiasi fase della mitosi, come giudicato da cromosomi condensati e debole colorazione SAS6 sono esclusi dalla nostra analisi, a causa del drastico calo dei livelli SAS6. Tuttavia, abbiamo notato che il livello VDAC3 centrosomica remained basso durante la mitosi (dati non riportati). Poiché i livelli Cep135 non cadere durante la mitosi (dati non mostrati), potremmo in linea di principio ripetere la procedura di ri-normalizzazione per stimare i livelli di VDAC3 Cep135 normalizzati in mitosi. Tuttavia, in realtà centrosomica livelli SAS6 in mitosi erano troppo variabili per permettere una determinazione accurata dei livelli VDAC3 SAS6 normalizzati in primo luogo. Indipendentemente da ciò, nel complesso, i nostri dati hanno verificato che il pool di centrosomica VDAC3 è regolata a centrosomi durante il ciclo cellulare.
Figura 1. asincrono crescenti cellule RPE1 sono state incubate con BrdU e MG115 (MG) o DMSO (DM) per 4 ore. (A) indicati sono campi aleatori di DMSO o MG115 trattati cellule colorate con anti-BrdU anticorpi (rosso) e Hoechst ( DNA, blu). Qui e in tutte le altre immagini del bar rappresentano 5 micron.(BE) DMSO o MG115 trattate le cellule sono state colorate con anticorpi contro VDAC3, γ-tubulina e BrdU. Cellule BrdU-positive sono stati ripresi in condizioni di imaging identiche (esposizione volte- 400 msec per blu fluoroforo / BrdU; 500 msec per verde fluoroforo / VDAC3; 300 msec per fluorocromo rosso / γ-tubulina) e il fondo corretta intensità di fluorescenza di VDAC3 e γ-tubulina sono stati determinati. Immagini rappresentative mostrano VDAC3 (VD3; verde), γ-tubulina (γ-vasca, rosso) e BrdU (blu) sono mostrati in (B). Qui e in tutte le altre immagini, riquadri mostrano digitalmente amplificati centrosomes come indicato dai quadrati. Correzione del fondo intensità di fluorescenza (F; in unità arbitrarie) corrispondenti a VDAC3 e γ-tubulina dai venticinque celle sono riportati nella scatola e baffo diagramma (C) e (D), rispettivamente. Qui e in tutti gli altri casi, le caselle rappresentano quartile inferiore e superiore, la marker nella casella (-) indica la mediana di ogni serie, e le basette rappresentano valori minimo e massimo. Valori normalizzati di intensità di fluorescenza di VDAC3 da quei venticinque cellule sono tracciate in (E). Per (CE), il valore p è derivato da T-test non appaiati. *** Indica p <10 -5, e ns indica p> 0.05. (F) Immunoblots mostrano livelli di cellule intere di VDAC3 (sia VDAC3a e VDAC3b 16) e γ-tubulina (γ-vasca), dove α-tubulina (α-vasca) viene caricata di controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 2. asincrono crescenti cellule RPE1 che sono stati etichettati con un 4 hr BrdU impulsi e inseguito per un altro 4 ore, in assenza di BrdU sono state colorate con anticorpi contro SAS6 (verde) e γ-tubulina (γ-vasca, rosso). Immagini rappresentative mostrano SAS6 colorazione durante (A) S-fase (con due vicini SAS6 foci), (B) metafase (due debole fuochi SAS6 ai poli) e (C) telofase (foci SAS6 si perdono dai poli). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. asincrono crescenti cellule RPE1 sono stati etichettati con BrdU impulso 4 ore e inseguito per un altro 4 ore, in assenza di BrdU. Cellule BrdU-positive colorate per Cep135 e SAS6 sono stati ripresi in condizioni di imaging identiche (esposizione volte- 400 msecper blu fluoroforo / BrdU; 400 msec per fluorocromo verde / Cep135; 500 msec per fluoroforo rosso / SAS6), e correzione del fondo fluorescenza intensità di SAS6 e Cep135 sono stati determinati. La distanza tra due centrosomi è stata misurata anche in tutte le cellule. Una cella in cui la distanza tra due centrosomi è inferiore a 2 micron è stato considerato come 'vicino' e se il valore è superiore a 2 micron è stato classificato come 'lontana'. (AB) Immagini rappresentative mostrano Cep135 (C135, verde), SAS6 (rosso) e BrdU (blu) vengono visualizzati. In (B), C1 e C2 sono i due centrosomi della cella rappresentante 'lontana'. (CD) con correzione del fondo intensità di fluorescenza (F, in unità arbitrarie) corrispondente a SAS6 (C) e Cep135 (D) da quindici celle di ogni categoria sono tracciati in scatola e schema soffio. (E) intensità normalizzato SAS6 from quelle cellule sono tracciate in scatola e schema soffio. Per (CE), il valore p è derivato da T-test non appaiati. * Indica 0,001 <p <0.05, e ns indica p> 0.05. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. cellule BrdU-positivi sopra BrdU test pulse-chase (Figura 3) colorate per VDAC3 e SAS6 erano ripreso in condizioni di imaging identiche (esposizione volte- 400 msec per blu fluoroforo / BrdU; 500 msec per fluorocromo verde / SAS6; 1.000 msec per rosso fluoroforo / VDAC3), e correzione del fondo fluorescenza intensità di SAS6 e VDAC3 sono stati determinati. La distanza tra due centrosomi è stata misurata in tutte le cellule, e le cellule sono stati classificati come 'cperdere '(la distanza tra due centrosomi <2 micron) e' distante '(la distanza tra due centrosomi> 2 micron), come in figura 3. (AC) Immagini rappresentative della' stretta 'cella a impulsi BrdU (A), in BrdU chase (B), e la cella 'distante' in BrdU Chase (C) colorate per VDAC3 (VD3, verde), SAS6 (rosso) e BrdU (blu) vengono visualizzati. In (C), C1 e C2 sono i due centrosomi. [DE] correzione del fondo intensità di fluorescenza (F, in unità arbitrarie) corrispondenti a VDAC3 (D) e SAS6 (E) da quindici celle di ciascuna categoria sono tracciati in scatola e schema soffio. (F) intensità normalizzata VDAC3 da tali cellule sono tracciate in scatola e schema soffio. Per (DF), valore p è derivato da spaiato T-test. *** Indica p <10 -5, **indica 10 -5 <p <0.001, e ns indica p> 0.05. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Microscopia quantitativa in biologia cellulare è comunemente associato con live-cell test di imaging come la Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), ecc, tuttavia, ci sono esempi di crescita di biologi cellulari di sviluppo diversi saggi microscopia quantitativi per fisso cellule negli ultimi anni 27,34-36. È importante sottolineare che, progressi nella comprensione della biologia centrosoma spesso richiede la comprensione della funzione specifica centrosoma di proteine la cui piscine centrosomica può essere regolato in modo diverso rispetto alle altre piscine. Così, abbiamo sviluppato un IIF dosaggio quantitativo di analizzare in particolare il livello centrosomica relativo di una proteina in due campioni trattati in modo diverso. Poiché ciò richiede che le cellule vengono fissate e trattati su vetrini separati, abbiamo quindi introdotto uno standard interno ai fini della normalizzazione, per un migliore controllo di eventuali artefatti dovuti alla necessità di gestire due experimecell ntale POPOLAZIONI separatamente, e aumentare la precisione del dosaggio. Ci sono solo pochi studi precedenti 37 che hanno utilizzato uno standard tale interno di misura l'intensità di fluorescenza relativa di una proteina di prova.
Mentre la scelta di uno standard interno è fondamentale per la precisione del nostro test, è probabilmente l'aspetto più impegnativo. Idealmente, la coppia duplicati centriolo durante S-fase, e le centrioli duplicati quindi accumulano componenti PCM aggiuntive, tra cui γ-tubulina durante G2 in modo che i due centrosomi maturi possono diventare i poli di fuso mitotico. Pertanto, si assume che il livello centrosomica di γ-tubulina non cambierebbe in modo significativo in cellule che sono rigorosamente in fase S. Questo sembra essere il caso in cellule RPE1 dove le cellule in fase S sono contrassegnati da una breve etichettatura BrdU. Tuttavia, la validità di uno standard interno deve essere testato per ogni tipo di cellula e condizioni sperimentali. Ad esempio, mentre il background-correCTED VDAC3 fluorescenza è aumentato più di due volte in risposta a proteosoma inibizione afidicolina trattati (S-fase arrestato) U2OS cellule, c'era anche un piccolo ma statisticamente significativo (0,001 <p-value <0.05) aumento in centrosomica γ-tubulina (complementare Figura). Così, γ-tubulina non è sempre un appropriato controllo interno, anche per le cellule che vengono arrestati nel ciclo cellulare.
Come tutti i test microscopia IIF, uno degli svantaggi di questo test è che gli anticorpi contro la proteina di prova e lo standard interno devono essere sollevate in diverse specie ospiti. Mentre i nostri dati suggeriscono che Cep135 è una migliore standard interno di SAS6, non siamo riusciti a normalizzare i livelli VDAC3 contro Cep135 come gli anticorpi disponibili contro queste proteine erano entrambi sollevati in coniglio. Così, abbiamo invece normalizzato contro SAS6, che ha causato una sovrastima della diminuzione dei livelli di VDAC3 tra la fine della fase S e G2. In una situazione in cui il intestandard di rnal varia modestamente, si può introdurre un altro fattore di normalizzazione per tenere conto di tale variazione. Ad esempio, per correggere la variazione SAS6, abbiamo moltiplicato l'intensità VDAC3 SAS6 normalizzata dall'intensità SAS6 Cep135-normalizzata.
Nei casi in cui la scelta di uno standard interno adeguato è difficile, microsfere rivestite colorante fluorescente (0,02-0,04 micron di diametro) possono fornire una strategia alternativa. Il segnale di una microsfera fluorescenza presenti nello stesso campo della cella di interesse può essere usata per normalizzare il segnale di fluorescenza corrispondente alla proteina di interesse. D'altra parte, se le celle di prova e di controllo vengono esposte insieme, si può non essere necessario un tale standard interno per la normalizzazione. Abbiamo già usato una versione di questo test per confrontare il livello centrosomica dell'Mps1 in cellule che overesprimono sia ciclina A 19 o Antizyme 20, che sia a prevenire il 19 o 20 promuovere il degradation dell'Mps1 a centrosomi, rispettivamente, a quello in celle adiacenti untransfected impressi allo stesso tempo.
Per esaminare l'effetto di VDAC3 centrosomica su proteosoma, abbiamo usato l'etichettatura BrdU per identificare e confrontare le cellule che sono in fase S. Mentre il trattamento MG115 può inibire la progressione del ciclo cellulare, questa inibizione richiede una concentrazione significativamente superiore 38 rispetto a quello utilizzato in questo studio. Alle concentrazioni usate qui MG115 può bloccare checkpoints del ciclo cellulare e transizioni, ma non bloccare la progressione del ciclo cellulare. Tuttavia, che devono essere verificati per ciascun tipo di cellula, come abbiamo fatto qui mostrando che MG115 non ha modificato la percentuale di cellule positive BrdU rispetto al DMSO. Tuttavia, arrestando le cellule in fase S utilizzando afidicolina o idrossiurea (HU) o la sincronizzazione cellule utilizzando mitotico 'shake-off' e rilasciare o doppio blocco timidina e il rilascio potrebbero essere utilizzati come metodi alternativi per generare popola equivalentezioni di cellule in fase S.
La strategia di pulse-chase BrdU per studiare il ciclo cellulare punti di tempo sarà molto utile in molti saggi funzionali che richiedono un ciclo cellulare imperturbabile. Questo è un test biologicamente più significativo che potrebbe essere in grado di sostituire ciclo cellulare tecniche arresto usando vari inibitori del ciclo cellulare. L'uso di questi inibitori può spesso provocare diversi tipi di stress fisiologico nelle cellule risultanti cambiamenti nei fenotipi aberranti ciclo cellulare. L'uso del metodo pulse-chase ci ha permesso di dimostrare che la deplezione di Cetn2 solo ritardato centriolo montaggio 39 invece di provocare un blocco completo come suggerito da studi precedenti 23. Rilevamento cellule BrdU-positive richiede idrolisi acida dei campioni. Noi e molti altri ricercatori stanno utilizzando una tecnica che ri-fissa le cellule dopo la colorazione primaria e secondaria per le proteine di prova, prima di idrolisi acida, con perdita insignificante di intensità di colorazione per different proteine centrosoma 40. Tuttavia, un potenziale alternativa potrebbe essere quella di utilizzare 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), un'altra analogico timidina che è simile a BrdU, incorporato in modo efficiente in replicare DNA 41. Visualizzazione di EdU usando 'click chemistry "non richiede idrolisi acida 42, e possono quindi più adatto per alcuni anticorpi.
Inoltre, questo dosaggio può essere facilmente utilizzato per misurare la variazione modificazioni post-traduzionali di una particolare proteina a centrosomes. Ad esempio, il livello di fosforilazione centrosomica può essere normalizzato rispetto al livello totale della proteina stessa, a condizione che esistono anticorpi specifici del sito di fosforilazione. Questo test potrebbe essere applicato immediatamente alla valutazione dei livelli relativi di fosforilazione tra le condizioni sperimentali o fasi del ciclo cellulare, ma potrebbe potenzialmente essere adattato per valutare i livelli totali di fosforilazione se parametri critici di anticorpi affinatti- sono noti o può essere determinato. Questo dosaggio dovrebbe essere applicabile anche per lo studio delle proteine in qualsiasi altro luogo in cellule, anche se la regione di interesse non deve essere troppo grande. Il saggio sarà particolarmente utile per misurare la modulazione specifica della posizione di una proteina che è localizzato in più siti cellulari.
Ci sono una manciata di parametri tecnici come photobleaching differenziale, l'effetto di immagini digitali, la linearità delle intensità di fluorescenza di fluorofori, rumore di fondo ecc che deve essere preso in considerazione per massimizzare la precisione della misura 43. Ad esempio, si può cambiare il fluorocromo associato a ciascun anticorpo secondario per valutare il contributo di photobleaching. Molti altri parametri possono essere ben controllate se si usano identiche condizioni di imaging (tempo di esposizione, il guadagno, passo, numero di Z-stack, etc.) e lo stesso software di imaging in ogni seduta di imaging. Anche se abbiamo usatol'algoritmo di No-vicino di casa in tutto il nostro test per eseguire l'immagine deconvoluzione, questo test può essere combinato con altri algoritmi di deconvoluzione come vincolata iterativo. Notiamo anche che dovrebbe essere facile da adattare questo dosaggio a qualsiasi numero di differenti pacchetti software di imaging, come più comunemente disponibili software di analisi dell'immagine ha strumenti per l'analisi delle intensità di fluorescenza e distanze.
Questo test dovrebbe essere applicabile a qualsiasi tipo di cellula, e la nostra scelta di celle qui è basata esclusivamente sulla loro rilevanza nella ricerca di biologia centrosoma, e il loro utilizzo nelle nostre precedenti esami di funzione VDAC3 centrosomica 16,28. Tuttavia, la validità delle norme interne e tempi appropriati per pulse-chase per identificare le cellule in fase S, G2, o mitosi devono essere determinati per ciascun tipo di cellula. Nel complesso, la nostra tecnica fluorescenza quantitativa recente sviluppato in combinazione con la BrdU test pulse-chase sarà un metodo molto utile per risolvere vari intricatomeccanismi della biologia dei centrosomi e in molti aspetti più ampi della biologia cellulare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
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