Abstract
Sentrozomlar genomik bütünlüğünü korumak veya hücrelerde duyusal işlevleri kolaylaştırmak için birincil kirpikler araya mitotik iğ direkleri olarak hizmet küçük ama önemli organellerdir. Bir protein seviyesi, diğer .cellular konumlarda daha sentrozom daha farklı düzenlenmiş olabilir, ve hücre döngüsünün farklı noktalarda çeşitli proteinlerin centrosomal seviyesindeki değişimin sentriol düzeneğinin doğru düzenlenmesi için önemli olduğu görülmektedir. Bu tür hücre döngüsünün farklı aşamalarında veya farklı reaktifler ile muamele edildikten sonra çeşitli örneklerden sabit hücrelerde sentrozom bir protein seviyesinde nispi değişiklik ölçen bir sayısal floresan mikroskobu bir deney geliştirildi. Bu deneyde ilkesi küçük bir bölgede bir proteine karşılık gelen arka düzeltilmiş floresan yoğunluğunun ölçülmesi yer alır ve seçilen deney c değişiklik olmayan başka bir protein için aynı karşı ölçüm normalizeondition. BrdU nabız ve soğukkanlı hücre döngüleri incelemek için takip stratejisi ile birlikte bu testte kullanarak, kantitatif özellikle sentrozomlarla de proteazom aracılı bozulması ile muhtemel VDAC3 ve centrosomal havuz, hücre döngüsü sırasında sentrozomlarla de düzenlenir bizim son gözlem, valide var.
Introduction
Sentrozom pericentriolar malzeme (PCM) 'çevrili Sentriyoller bir çift oluşur. Memeli hücrelerinde büyük mikrotübül organize merkezleri (MTOCs) olmak, sentrozomlar bölünen hücrelerde mitotik iğ iki kutup olarak hizmet, ve böylece genomik bütünlüğünü 1 korumamıza yardımcı olur. (G0 aşamasında örneğin) hareketsiz hücrelerde, sentrozom, yani ana sentriolden iki Sentriyoller biri, primer kirpik, hücre yüzeyi 2 dışarı doğru çıkıntı yapan bir duyusal organel birleştirmek için bir taban gövdesi içine transforme edilir. Hücreler bir kez hücre döngüsü yeniden girmek primer kirpikler parçalarına ve her centriole yavaş yavaş olgun centriole 3 oluşturmak üzere uzar proksimal ucunda bir procentriole montajını yönlendirmektedir. S-fazı başlangıcında, sentriolden 9-katlı bir simetriye sağlayan bir çember benzeri bir yapı olan her sentriolden yüzeyi üzerinde oluşturulmuş olan ve her procentriole baz olacaktır. Sas6 tcentriole montaj cartwheel 4-6 hub oluşturmak için işe edilir için şapka vazgeçilmezdir. Diğer centriolar proteinler daha sonra uzak bir şekilde 7 derece düzenlenir, proksimal tekerin üzerine monte edilir. Tam centriole tekrarını tamamladıktan sonra, hücreler G2 fazı 8 yılı sonunda iki fonksiyonel sentrozomlar inşa ek pericentriolar malzemeleri bir araya getirin. Çekirdek centriolar bileşenler 9-11, kinaz, fosfataz, şaperonlar, iskele elemanları, zara bağlı proteinler ve bozunma makineler dahil olmak üzere birçok başka protein ek olarak hücre döngüsü 12-16 farklı zamanlarda Sentriyoller bazal gövde ve PCM ile ilişkilidir. Genellikle, bir çok proteinin centrosomal seviyeleri geçici olarak centrosomal hedefleme mekanizmalarının ve / veya sentrozom de proteozomal bozulması düzenlenir belirtilmelidir. Önemli bir şekilde, Plk4, Mps1, Sas6 ve CP110 a gibi çeşitli proteinlerin centrosomal düzeyinde dalgalanmalarhücre döngüsünün t farklı noktaları centriole düzeneğinin 5,17-22 düzenleyen önemli olduğu görülmektedir, ve bu centrosomal bozulması önlenir Mps1 durumunda fazla Sentriyoller 19 oluşumuna yol açar. Öte yandan, çeşitli proteinlerin centrosomal fraksiyonlar sitosolik havuzları ile karşılaştırıldığında daha az dayanıksız. Örneğin aşağı doğru düzenlenmesi fotoseli 2 (Cetn2) siRNA aracılı olan bütün hücre seviyeleri 23 büyük azalmaya rağmen Sentriyoller protein düzeyinde yalnızca orta derecede bir azalma sağladı. Oldukça onların centrosome özel fonksiyonları değerlendirilirken tüm hücre protein seviyelerini ölçmek daha centrosome de centrosomal proteinlerin düzeyindeki değişiklikleri ölçmek için bu nedenle çok önemlidir.
Bu çalışmada, sentrozom bir proteinin nispi seviyesini ölçmek için dolaylı immünoflüoresans (IIF) kullanan bir analiz geliştirdik. Bu deney, çeşitli örneklerden olan hücreleri analiz etmek için özellikle geliştirilmiştirve bu nedenle, aynı zamanda görüntülü edilemez. Numuneler farklı zaman noktalarında toplandı farklı reaktifler (örneğin, ilaç kontrole karşı) ile muamele edilmiş olan hücreler olabilir (yani, Chase karşı darbe), ya da hücre döngüsünün farklı aşamalarında bulunmaktadır. Bu deneyde ilkesi arka düzeltilmiş floresan yoğunluğu küçük bir bölgede bir proteine karşılık gelen ve, seviyeleri seçilen deney koşulları altında değişmeyen bir başka protein aynı karşı değer normalleştirmek için ölçüm yatmaktadır. Centrosome biyoloji çeşitli çalışmalar son zamanlarda aday proteinlerin 24-27 arasında centrosome özgü fonksiyonunu belirlemek için, hem canlı ya da sabit hücrelerde çeşitli kantitatif mikroskopi teknikleri, kullanılan var. Bu deneylere benzer şekilde, bu teknik, aynı zamanda test proteinin arka plan düzeltilmiş bir flöresan yoğunluk ölçer. Bununla birlikte, bu tahlilde, bir dahili standart olarak normalleştirme dahil büyük ihtimalle daha teklifdoğruluk ve iki farklı lamelleri üzerinde iki farklı örnekleri analiz güven. Ayrıca, sentrozom protein seviyesinin incelenmesine ek olarak, küçük ayarlamalar ile bu yöntem, deney şartlarının farklı ayarlamak için ya da diğer hücresel sitlerde uygulanabilir.
Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarında hücreleri karşılaştırmak için BrdU darbe-kovalamaca stratejisi ile kantitatif mikroskopi tahlil birleştirir. Bunun yerine, hücre döngüsünün farklı zaman noktalarında çalışma zaman uyumsuz büyüyen hücreler standart hücre döngüsü tutuklama ve serbest bırakma teknikleri kullanılarak S-fazında hücreleri etiketlemek için BrdU ile inkübe edilir, ve etiketlenmiş hücreler, çeşitli zamanlarda (tipik olarak 4-6 saat) boyunca takip edilir. Etiketli hücrelerin çoğu hemen darbesinden sonra S-faz olacaktır. Chase sonra işaretli hücrelerin morfolojik özellikleri nuc göre sentrozom gibi maddelerle pozisyonu tarafından kontrol edilebilir geç S, G2 veya mitoz içinde olacak şekilde Chase uzunluğu seçilirLei, sentrozom arasındaki mesafe, vb kromozom kondansasyon Böylece, kovalama uzunluk S, G2 ve belirli bir hücre tipinin M fazında ortalama süresine bağlıdır. Bu yaklaşım, vb hidroksiüre, afidikolin, nokodazol, hücre döngüsü inhibitörleri önler olduğundan, fizyolojik olarak daha uygun hücre döngüsü analizi sağlar.
Bu yüzden, tek başına nicel floresan mikroskobu deneyi veya BrdU Darbe kovalayıcı tahlilinde ile kombinasyon halinde, doğru bir soğukkanlı hücre döngüsü sırasında aday protein centrosomal seviyesinde göreli değişiklikleri ölçmek için basit ama etkili bir yöntem olduğu burada ortaya koymaktadır. Biz, bu deneyler kullanılarak, VDAC3, son zamanlarda 16,28 mitokondri ek olarak sentrozom de tanımlanan bir protein centrosomal düzeyleri ölçüldü. Burada elde edilen sonuçlar VDAC3 arasında centrosomal havuz bozulması ile düzenlenir bizim daha önceki bir gözlem doğrulamak, ve aynı zamanda bir hücre döngüsü bağımlı hazırlık değişirt şekilde 16, ayrıca bu yöntemin uygulanabilirliğini doğrulanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü
- Ters transkriptaz (hTERT) ölümsüzleştirdi retina pigment epitel hücreleri, insan telomeraz kullanın (hTERT-RPE1; RPE1 burada anılacaktır).
Not: RPE1 hücrelerde bu centriole montaj ve ciliogenesis incelemek için kullanılır yakın-diploid, dönüştürülmemiş insan hücreleridir. Bu hücreler düzenlenmiş hücre döngüsü ile koordineli normal centriole çoğaltılması döngüsünü izleyin. - Geçiş 1 ile RPE1 hücrelerinin yakın bir birleşik, 100 mm'lik bir hücre kültürü çanağı: 10 ml ihtiva eden bir taze 100 mm tabak için orijinal kültür 5 seyreltme DME / F-12 (1: 1) ortamı,% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş (FBS), 100 U / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin (tam bir ortam, DME / F-12 ortamı olarak adlandırılır). % 5 CO2 varlığında 37 ° C'de hücreler büyür.
- Bir su banyosu veya inkübatör içinde 60 ° C'de, çalkalanarak olmadan kapalı bir cam beher O / N HC1 50 ml 12 mm yuvarlak cam lamelleri inkübe edin.
- Afasit çözeltisi atılması ter arada çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilerek lamelleri damıtılmış su, 100 ml, üç kez yıkayın. % 70 Etanol ve% 95 etanol ile benzer şekilde yıkama tekrarlayın.
- Ayrı ayrı 60 dakika UV radyasyonu ile sterilizasyon ardından biyogüvenlik kabini içinde bir laboratuvar kurutma kağıdı, onları dışarı yayarak lamelleri kurulayın.
- Bir 35 mm hücre kültür çanağı 2-4 kuru lamelleri yerleştirin. Hücre kültürü, PBS içinde 25 ug / ml'lik bir konsantrasyona kadar işlenmiş polimerin (1 mg / ml stok konsantrasyonu) gibi fibronektin çözeltisi ya da fibronektin ile seyreltilir.
- Her lamel üzerine seyreltilmiş çözeltinin 80-100 ul yerleştirin ve kaplamak için 60 dakika lamel üst tarafı için kuluçkaya yatmaktadır. Tam orta eklemeden önce PBS ile üç kez lamelleri yıkayın.
2. Büyüyen Hücreler ve Proteazom inhibitörleri ile tedavi Hücreler
- Passage 2 x 10 5 asenkron olarak büyümekHer 35 mm çanak ing RPE1 hücreleri lamelleri içeren ve 2 ml tam orta hücreleri büyür. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile her 24 saatte değiştirin.
- Test protein centrosomal düzeyde proteazom inhibisyonunun etkisini analiz etmek (burada VDAC3 veya γ-tubulin), 44 saat için iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek. Komple ortam ile kültür ortamı yerine sırasıyla 5 uM veya% 0.05'lik bir nihai konsantrasyonda kontrol çözücü olarak MG115 veya DMSO ya da eklemek. Aynı zamanda, 4 saat süre ile hücreler 40 uM'lik nihai bir konsantrasyonda, hücrelere BrdU ekleme ve inkübe edilir.
- 24 oyuklu bir plaka içerisinde her bir lamel aktarın. Her bir oyuğa 500 ul soğutulmuş metanol eklenir ve 10 dakika lamelleri hücreleri düzeltmek için, -20 ° C 'de plaka inkübe edin. Hemen lamelleri 500 ul yıkama tamponu ile üç kez yıkayın (0.5 mM MgCI2 ve% 0.05 ihtiva eden 1x PBS, Triton-X-100).
- Artık Hasat35 mm tabak ve santrifüj 5 dakika boyunca 1000 x g'de hücrelerinden hücre. Western blotting (aşama 6), total protein analiz üzere hücre pelleti kullanın.
3. BrdU Darbe ve Chase Testi Farklı Hücre Döngüsü Evreleri Protein Düzeylerinin Analiz
- 44 saat lamelleri içeren iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek, hücre döngüsünün farklı aşamalarında sentrozomlarla bir proteinin (burada VDAC3, Sas6 veya Cep135) seviyesi değişimini analiz etmek. 40 uM BrdU içeren tam ortam maddesi ile kültür ortamı yerine ve hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 4 saat kuluçkalayın.
- Bir tabak, Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi soğutulmuş metanol kullanılarak hücreleri gidermek için bir 24 oyuklu plaka lamelleri aktarın.
- 4 saat BrdU puls sonrasında BrdU-içeren ortam maddesinin ayrılması bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve tam ortam maddesi ile bir kez çeşitli zamanlarda (tipik olarak bir 4 saat boyunca BrdU yokluğunda hücreleri taze ortam ilave ve daha sonra büyüyecekAdım 2.1.2 de açıklandığı gibi hücrelerin sabitleme önce RPE1 hücreleri) için.
Not: RPE1 hücreleri için, BrdU-pozitif hücrelerin çoğu, bir 4 saat Chase sonra geç S ya da G2 faz içindedir. Bu, her bir hücre tipi için ayrı ayrı belirlenmelidir.
4. immün
- 30 dakika boyunca (1 x PBS içinde% 2 BSA ve% 0.1 Triton X-100), bloke edici tampon 200 ul lamelleri ile sabitleştirilmiş hücreler inkübe edin.
- Birincil antikor karışımı ile inkübe hücreleri nemlendirilmiş bir bölmede 4 ° C'de tampon O / N engelleme seyreltilmiş (tipik olarak bir tavşan içinde yetiştirilmiş ve bir fare arttırılmış).
- Nemlendirilmiş bir odasını yapmak için, boş bir 1.000 ul pipet kutusunun alt yarısında ıslak kağıt havlu koymak. Raf yüzeyinde Parafilm bir şerit yatıyordu, ve inkübe her lamel için Parafilm üzerine antikor çözümün bir damlacık (15-20 ul) nokta. Antikor çözeltisi bir damlacık üzerine bir lamel haricindekileri (hücre dalmış böylece) ve yakınucu kutusunun kapağı.
- Yine lamelleri ters çevirin ve 24 kuyu çanak onları geri dönün. Lamelleri yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca (yeşil flüoresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan ve kırmızı flüoresan boya konjuge edilmiş anti-fare, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş burada) 150 ul ikinci antikor karışımı içinde inkübe. Lamelleri üç kez yıkayın.
NOT: florofor-konjuge İkincil antikorlar duyarlı hafif. Adım sırasında ışıktan koruyunuz örnekleri 4.1.3-5.1.2.
- Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi, 10 dakika boyunca -20 ° C 'de 500 ul soğutulmuş metanol ile tekrar boyanmış RPE1 hücrelerin tespit anti-BrdU boyama için hazırlayın. Üç kez lamelleri yıkayın.
Not: Bu tespit, takip eden basamakta asit hidroliz işlemi sırasında ilgili protein (ler), primer ve sekonder antikor etiketleme korur.- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 N HCI, 200 ul hücreleri inkübe edin. 1 M Tris-Cl, 300 ul, pH 8, ile nötralizehücreleri yıkama tamponu kullanarak üç kez yıkayın d.
- Tekrar, oda sıcaklığında 30 dakika blokaj tamponunda 200 ul kullanarak hücreleri bloke eder.
- Nemli bir bölmede 37 ° C 'de 45 dakika boyunca (blokaj tamponu içinde seyreltilmiş) sıçan anti-BrdU antikoru ile inkübe hücreleri. 24 oyuklu tabağa geri lamelleri Dönüş yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat süre ile, 24-çukurlu tabak bloklama tamponu 150 ul seyreltilmiş mavi floresan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikoru (kuluçkalayın.
- Lamelleri üç kez yıkayın. Bir cam mikroskop lamı üzerine antifade reaktif içeren bir montaj çözümün bir damlacık (kabaca 3-6 ul) Nokta. Hücre tarafı montaj çözümü üzerine, aşağı bakacak şekilde, bir lamel haricindekileri. Yavaşça yumuşak doku temizleme kullanarak slayt karşı lamel basarak fazla sıvıyı silin. Mikroskop lamı üzerine mühür lamel kenarında şeffaf oje sürün.
5. Immünofloresan Görüntü EdinimEdinim ve Analizi
- Ortam sıcaklığında BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinin görüntüler elde etmek için (1.4 sayısal diyafram ile) 100X Planı Apo immersiyon yağı hedefi kullanın.
- Dijital görüntüleme yapabilen bir kamera ile mikroskop ekli (donanım bakınız) bir slayt koyun. Her fluorofor için, manuel bir deney tüm örnekleri inceleyerek (tipik 300-1,000 msn arasında) uygun pozlama süresini belirler. Bir hücrenin görüntüleri almadan önce, elle Z-ekseni (genellikle 0.2 mikron adım boyutu) boyunca uygun üst ve alt odak düzlemi belirler. Bir dijital mikroskopi görüntüleme yazılımı paketi kullanarak Z-ekseni boyunca farklı floroforlar için aynı pozlama süresi ile ayrı lamelleri farklı örneklerin görüntüleri edinin.
- Z-ekseni boyunca elde edilen tüm resim yığınlarının (Yok komşu algoritması kullanarak bu durumlarda) dekonvulasyon gerçekleştirin.
- Boyunca her görüntü yığını toplam yoğunluk projeksiyonu eldeZ-ekseni.
- Sentrozomlar (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe en az 2 mikron) yakın hücrelerde, hem sentrozomlarla etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 20-30 piksel) çizmek ve seçilen alanı işaretleyin.
- İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına tipik 24-35 piksel) çizin ve büyük kare seçili alanı işaretleyin.
- Alan (A) ve her kutuya her floroforun toplam floresan yoğunluğu (F) elde (S küçük kutu gösterir ve L büyük kutu gösterir).
- . Howell ve ark 29 tarafından açıklanan formülü kullanarak her floroforun arka plan düzeltilmiş floresan yoğunluğu analiz: F = F S - [(F L - F S) S / (A L - A S) x].
- Bunu fl artalan-düzeltilmiş floresan yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgi (burada VDAC3 veya Sas6) proteinin normalize edilmiş floresan yoğunluğu elde edilir(Burada γ-tubulin, Sas6 veya Cep135) seçilen iç standart için kullanılan floroforun buna uorophore.
- Sentrozomlar iyi ayrılmış nerede hücreleri analiz durumunda, kutuların iki ayrı set çizerek ayrı ayrı centrosome analiz (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe büyük 2 um daha). Her centrosome etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 15-25 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin. İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına 20-30 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin.
- Alanı (A) ve her kutuya her fluorofor toplam floresan yoğunluğu (F) elde edilir, ve adım 5.3.3 tarif edildiği gibi, her bir sentrozom için ayrı ayrı her bir fluorofor arka düzeltilmiş floresan yoğunlukları hesaplamak.
- Bu hücredeki bu proteinin toplam centrosomal seviyesi elde etmek için, iki sentrozom her proteinin arka plan düzeltilmiş floresan şiddetleri birleştirin.
- Elde etmekİç standart toplam centrosomal yoğunluğu toplam centrosomal yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgili proteine normalize şiddeti.
- Her deneysel koşul için en az 15-25 hücreleri analiz ve bir tablo grafiği çizmek.
6. Western Blot kullanma Toplam Protein Analizi
- 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl,% 1 Nonidet P-40,% 1 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren (RIPA) tamponu radyoimmünopresipitasyon deneyinde hücreler yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe hücreleri lize etmek için.
- 10 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin Karışımı topak fraksiyonundan lizat ayrılması ve bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi kiti kullanılarak her bir lizattan toplam protein konsantrasyonunun ölçülmesi.
- 4x SDS-PAGE yükleme tamponu (50 mM Tris-Cl, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol, 100 mM ditiyotireitol,% 0.1 Brom ile lizat 40 ug karıştırın) Mavi ophenol.
- 10 dakika boyunca numune kaynatılır ve 200 V sabit gerilimde, SDS-PAGE, denatüre edici bir% 12.5 ile örnekleri çalıştırmak
- (Soğukta 1 saat süre ile 90 V sabit gerilim) Western lekeleme tekniği kullanılarak bir nitroselüloz zar üzerine, SDS-PAGE üzerinde ayrılmış proteinler aktarın.
- 1x PBS içinde% 3 yağsız süt ile bloke membran ve daha sonra 1 için (bu durumda, tavşan anti-VDAC3, tavşan anti-γ-tübülin ve fare anti-α-tübülin bağında absorbe edilmemesi) ile seyreltildi birincil antikor çözeltileri ile membran inkübe oda sıcaklığında bir saat.
- Membrana PBS-T tamponu kullanılarak üç kez (çalkalama altında, her 5 dakika inkübasyon) yıkandıktan sonra (1x PBS ve% 0.2 Tween-20), yakın kızılötesi (IR), floresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan oluşan bir karışım içinde membran inkübe ve 1 saat boyunca (PBS-T içinde seyreltilmiş) IR florasan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikorlar.
- Membranı üç kez yıkayın ve sonra kızılötesi f kullanarak bantları analiz membran taramaimmünoblot tespiti için uygun luorescence görüntüleme sistemi olmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim son çalışmalar VDAC3, mitokondriyal porinlerini 16,28 birinin yeni centrosomal lokalizasyonu ve fonksiyonu tespit. Bir VDAC3 özel bir antikor kullanılarak RPE1 hücreleri dahil olmak üzere birçok memeli hücrelerinin immün belirgin centrosomal boyama ve nispeten zayıf mitokondriyal boyanma gösterdi. Ayrıca centrosomal VDAC3 tercihen ana sentriolden ve endojen hem de centrosomal havuzu ile ilişkili ve ektopik VDAC3 bozulma 16 düzenlenir ifade olduğunu göstermiştir. Kantitatif IIF tahlil doğrulamak için S-fazında olan hücrelerde sentrozom ilişkili VDAC3 havuzunda değişiklikler incelendi.
Burada, senkronize olmayan bir şekilde büyüyen RPE1 hücreleri proteazom önleyicisi MG115 ya da 4 saat süre ile kontrol çözücü DMSO ile işlemden geçirildi. S-faz ve sentrozom takımını geçiren bulunan hücrelere analizimizi kısıtlamak için, biz sadece BrdU du dahil hücreleri incelendiAynı 4 saat halka ve (birbirini 2 mikron içinde aralıklı) iki yakın aralıklı sentrozomlar vardı. Bu MG115 kısa tedavi BrdU dahil edilmesini, kontrole göre (yaklaşık% 58) etkilemediğini sonuçlandırmak için hem kontrol ve MG115 tedavisi (Şekil 1A) için BrdU boyanmış hücreler ve çekirdekler muhtelif rasgele incelenen alanın (yaklaşık% 56) RPE1 hücrelerinde. Biz (birbirinin 2 um olan aralıklı iki γ-tübülin odaklarının varlığı ile belirlendiği üzere), S-fazında olduğu, sadece hücreler karşılaştırarak olarak, normalleştirme için potansiyel bir iç standart olarak γ-tubulin olarak. BrdU-pozitif hücrelerde centrosomal γ-tübülin seviyeleri proteazom inhibisyonu göre değişebilir Böylece, ilk incelenmiştir. Beklendiği gibi, orada bir hücreden diğerine γ-tübülin floresan yoğunluğu kayda değer hücre-hücre varyasyon ve bu varyasyon iyi bir bütün veriler olarak ayarlanmış verileri sunmak kutusu ve visker şemalarında sunulmuştur olduğu bulunmuştur. Benn kutusu ve bıyık şemaları, kutular alt ve üst çeyreğini temsil kutuya işaret her serinin ortanca gösterir, ve bıyıkları (her zaman olmasa da) genellikle aykırı olan minimum ve maksimum değerler, temsil eder. Şekil 1 D'de görüldüğü gibi, centrosomal γ-tübülin seviyesi bu nedenle, bu deney için, bir iç standart olarak γ-tubulin doğrulayarak, MG115 veya DMSO ile muamele edilen BrdU-pozitif hücreleri arasında önemli ölçüde farklı değildi. -Tubulin γ aksine, centrosomal VDAC3 karşılık gelen arka plan düzeltilmiş bir flöresan yoğunluk kontrol hücreleri (Şekil 1C) daha MG115 ile muamele edilmiş hücreler içinde daha yüksek bir 2.5 kat yaklaşık oldu. Biz γ-tübülinin buna karşı toplam VDAC3 floresan normalize zaman, kat artış kabaca iki kat (Şekil 1E) biraz düştü. Kat değişim normalleşme olmadan büyük olmasına rağmen, biz bett hissediyorum normalize verilerin doğruluğu daha fazla güven var, numune işleme MG115 tedavisi, hem de değişik herhangi bir genel etki için er kontrol eder. Olmayan centrosomal siteleri (Şekil 1B) veya VDAC3 (Şekil 1F) 'nin toplam hücresel düzeyde VDAC3 boyama, proteazom inhibisyonu ile etkilenmemiştir. Böylece, biz kantitatif VDAC3 ve centrosomal havuz proteasome-aracılı bozulması tarafından düzenlenir önceki gözlem doğrulayın.
Hücre döngüsü sırasında centrosomal VDAC3 değişikliği ölçmek için biz etiketli hücrelerin bir 4 saat kovalamaca ardından 4 saat BrdU darbe ile hücreleri etiketli. Beri sadece S-fazı hücreleri darbesi sırasında BrdU dahil olacak, geç S-faz veya erken G2 fazında ya olacak 4 saat kovalamaca sonrası BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinin çoğunluğu ((iki sentrozomlarla arasındaki ortalama mesafe ± 0.16 mikron 1.35 olduğunu) İki sentrozomlarla arasındaki ortalama mesafe geç G2 aşamada küçük bir nüfusa sahip,) 1.55 ± 0.22 mikron olduğu centroBazı çift anlamlı 30 (iki sentrozomlarla> 2 um arasındaki ortalama mesafe) ayrılmış oldu. γ-tubulin, büyük bir PCM bileşeni büyük ölçüde G2 faz 31,32 meydana gelir, ve bu artış, diğer centrosomal proteinlerin hücre döngüsü varyasyonları değerlendirmek için zayıf bir iç standart hale sentrozom olgunlaşması sırasında sentrozom birikir. Öte yandan, Sas6 cartwheels 4,5,7 montajını uyarmak için erken S-fazında procentrioles için işe edilir ve (Şekil 2 bozulmuş başladığında, hücreler mitoza girdiğinde kadar yeni oluşan Sentriyoller tabanında kalır ve referans 5). Hücreler G2 fazında 5 S-fazdan ilerleme Ancak, HeLa veya U2OS hücrelerinde, Sas6 ve centriolar düzeyi giderek artmaktadır. Bu nedenle, ilk Cep135, Sentriyoller proksimal uçları boyunca lokalize bir çekirdek centriolar proteininin göre centrosomal Sas6 seviyesi ölçüldüHücre döngüsü 33. Sentrozomlar yakından aralıklı zaman biz (Şekil 3A-D nabız veya kovalamaca, gelen BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinde Cep135 veya Sas6 arka plan-düzeltilmiş toplam floresan yoğunlukları anlamlı bir fark saptamadık; ikisi arasında 'yakın' hücreleri ortalama mesafe sentrozomlar en az 2 um). Bu duruma göre, normalize Sas6 seviyesi, bu hücreleri (Şekil 3E) içindeki kalmıştır. Bununla birlikte, Sas6 genel floresan yoğunluk değerleri tutarlı bir artış ve (; * uzak hücreleri iki sentrozom> 2 um arasındaki mesafe) sentrozomlar iyice ayrıldığı hücrelerde Cep135 aynı hafif bir artış gözlenmiştir. Buna göre, iki iyi ayrılmış sentrozomlarla birlikte hücrelerde normalize toplam centrosomal Sas6 seviyesi biraz oldu, ama birbirine yakın sentrozomlarla birlikte hücrelerde daha istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek. Bu durum Sas6 düzeyi zekâ doğal düzenlemeye muhtemeldirh hücre döngüsü ilerlemesi 5. Ancak, hafif bir artış (ki ya da daha düşük istatistiksel anlamlılık) yakın aralıklı sentrozom hücrelerde de aynı anda iki sentrozom analiz göre, ayrı ayrı analiz edilmiştir iki sentrozom floresan yoğunlukları ilave bağlı olduğu da mümkündür. VDAC3 floresans yoğunluğu, tek başına Sas6 bu göre normalize edildi zaman Bununla birlikte, iki birbirine yakın sentrozom de VDAC3 seviyesinde erken S-fazı ile karşılaştırıldığında, geç S / erken G2 fazında olan hücrelerde yaklaşık 1.5 kat artmıştır hücreleri (Şekil 4A-C, F; 'yakın' hücreleri). Bu hücreler, son G2 fazında ilerleme, iki sentrozom normalize VDAC3 seviyesi geç S-fazı (Şekil 4C, F) kıyasla 2.4 misli azalmıştır.
Sas6 seviyeleri geç S-fazı, G2 den biraz artış için, iç standart olarak Sas6 kullanılarak Aralık hafif bir fazla tahmin edilmesine yol açarGeç G2 faz hücrelerinde VDAC3 seviyelerinde artma (sentrozomlar fazla 2 um ile ayrılmaktadır). Bizim veri Cep135 daha iyi bir seçim hücre döngüsü değişimleri değerlendirmek için bir iç standart olarak olduğunu göstermektedir iken bize mevcut VDAC3 ve Cep135 antikorları hem tavşan, çünkü biz VDAC3 için kullanamazsınız. Ancak, Cep135-normalize Sas6 medyan değerine göre Sas6-normalize VDAC3 (F VDAC3 / F Sas6) için medyan değeri çarpılarak bize Cep135-normalize VDAC3 [(F VDAC3 / F Sas6) x için yaklaşık bir değer (F Sas6 / verir F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Bu analiz, Geç s / erken G2 ve geç G2 arasında VDAC3 seviyelerinde değişiklik yapıldıktan sonra 2 kat hafifçe düşer. Özet kromozom ve zayıf Sas6 boyama ile değerlendirildiği gibi mitoz herhangi bir aşamasında olan BrdU-pozitif hücreler, Sas6 seviyeleri dramatik düşüş, bizim bu çalışmanın dışında bırakılmıştır. Ancak, biz kaydetti centrosomal VDAC3 seviyesi yenidenmitoz sırasında düşük mained (veriler gösterilmemiştir). Cep135 seviyeleri mitoz sırasında düşürmeyin Çünkü (veriler gösterilmemiştir), biz prensip olarak mitoz Cep135-normalize VDAC3 seviyelerini tahmin etmek yeniden normalleştirme işlemi tekrar olabilir. Bununla birlikte, gerçeklikte, mitoz centrosomal Sas6 seviyesi ilk olarak Sas6 normalleştirilmiş VDAC3 seviyelerinin doğru ve hassas belirlenmesi için izin vermek için çok değişken olmuştur. Ne olursa olsun, genel olarak, bizim veri VDAC3 ve centrosomal havuz, hücre döngüsü sırasında sentrozomlarla de düzenlenir olduğu belirlenmiş.
Şekil 1. eşzamansız büyüyen RPE1 hücreler, 4 saat boyunca BrdU ve MG115 (MG) ya da DMSO (DM) ile inkübe edildi. (A) gösterilen bir anti-BrdU antikoru (kırmızı) ve Hoechst (lekelenmiş rasgele tedavi DMSO veya MG115 alanları hücreleridir DNA, mavi). Burada ve diğer tüm görüntüleri bar 5 mikron temsil eder.(BE) DMSO ve MG115 hücreleri VDAC3, γ-tübülin ve BrdU karşı antikorlar ile boyandı işlemden geçirildi. BrdU-pozitif hücreler aynı görüntüleme koşulları altında görüntülendi (pozlama mavi fluorofor / BrdU için 400 msn times-, yeşil fluorofor / VDAC3 için 500 msn, kırmızı fluorofor / γ-tubulin için 300 msn) ve arka plan VDAC3 floresan yoğunluklarına düzeltilmiş ve γ-tubulin belirlenmiştir. VDAC3 gösteren Temsilcisi görüntüleri (VD3; yeşil), γ-tubulin (γ-küvet, kırmızı) ve BrdU (mavi) (B) 'de gösterilmiştir. Kareler tarafından belirtildiği gibi burada ve diğer tüm görüntüleri, takmalar dijital sentrozomlar büyütülmüş göstermektedir. Arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları (F, rasgele birimlerde) yirmi beş hücrelerinden VDAC3 ve γ-tubulin karşılık gelen sırasıyla kutu ve visker (C) 'şeması ve (D)' de çizilmiştir. Burada ve diğer tüm durumlarda, kutular, ma alt ve üst çeyrek temsil(-) kutusuna rker her serinin ortanca gösterir, ve bıyıkları minimum ve maksimum değerleri temsil eder. Bu yirmi beş hücrelerinden VDAC3 normalize edilmiş floresan yoğunluk değerleri (E) 'de çizilmiştir. (CE) için, p değeri eşsiz T-testi türetilmiştir. *** P gösterir <10 -5, ve ns p gösterir> 0.05. (F) α-tubulin (α-küvet) kontrolü yükleniyor VDAC3 (VDAC3a ve VDAC3b 16 ikisi) ve γ-tubulin (γ-küvet) tüm hücre düzeylerini gösteren İmmnüblotlar. Bu büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.
4 saat Br ile etiketlenmiş Şekil 2. uyumsuz büyüyen RPE1 hücreleri(γ-küvet; kırmızı) dU nabız ve BrdU yokluğunda bir 4 saat boyunca takip edilir Sas6 (yeşil) ve γ-tubulin karşı antikor ile boyandı. Örnek görüntüleri olan iki yakın olan ((A), S-fazında Sas6 boyanmama Sas6 odaklar), (B) metafaz (kutuplarda iki zayıf Sas6 odaklar) ve (C) telofaz (Sas6 odakları kutuplarından kaybolur). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
400 msn kez-Cep135 ve Sas6 lekeli Şekil 3. uyumsuz artan RPE1 hücreleri BrdU yokluğunda bir 4 saat için 4 saat BrdU darbe ile etiketlenmiş ve takip edildi. BrdU-pozitif hücreler, aynı görüntüleme koşulları altında görüntülendi (maruziyetMavi fluorofor / BrdU için; Yeşil fluorofor / Cep135 için 400 msn; Kırmızı fluorofor / Sas6) ve Sas6 ve Cep135 arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları için 500 msn belirlendi. İki sentrozom arasındaki mesafe, aynı zamanda tüm hücrelerde ölçülmüştür. İki sentrozomlarla arasındaki mesafe az 2 mikron olan bir hücre 'yakın' ve değer olduğu fazla 2 mikron 'uzak' olarak kategorize edilmiştir olarak kabul edildi. (AB) Cep135 (C135; yeşil) gösteren Temsilcisi görüntüleri, Sas6 (kırmızı) ve BrdU (mavi) gösterilir. (B) 'de, C1 ve C2 için temsili' uzak 'hücrenin iki sentrozomlar bulunmaktadır. (CD), arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları (F, rasgele birimlerde), her bir kategori beş hücrelerinden Sas6 (C) ve Cep135 (D) 'e uygun kutu ve visker diyagramı çizilmiştir. (E) sağa sola Sas6 Normalize yoğunluklarım bu hücrelerin kutu ve bıyık şemada çizilmiştir. (CE) için, p değeri eşsiz T-testi türetilmiştir. * 0.001 <p <0.05 gösterir ve ns p> 0.05 gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yeşil fluorofor / Sas6 için 500 msn, mavi fluorofor / BrdU için 400 msn times- VDAC3 ve Sas6 için lekeli Şekil yukarıdaki BrdU darbe kovalamaca testte 4. BrdU-pozitif hücreler (Şekil 3) aynı görüntüleme koşulları altında görüntülendi (maruziyet; 1000 kırmızı fluorofor / VDAC3 için msn) ve Sas6 ve VDAC3 arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları, iki sentrozom arasındaki mesafe tüm hücrelerde ölçülmüştür ve hücrelerin 'c olarak kategorize edildi. belirlendi'(iki sentrozom <2 um arasındaki mesafe)' uzak 'Şekil 3'de olduğu gibi, (2 ila iki sentrozom arasındaki mesafe>). (AC) temsili görüntüleri' BrdU puls (A) yakın hücreler için, kaybetmek BrdU kovalamaca (B), ve VDAC3 için lekeli BrdU kovalamaca (C) 'uzak' hücre (VD3; yeşil), Sas6 (kırmızı) ve BrdU (mavi) gösterilir. (C) 'de, C1 ve C2, iki sentrozomlar bulunmaktadır. [DE] arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları (F, rasgele birimlerde), her bir kategori beş hücrelerinden VDAC3 (D) Sas6 (E) karşılık gelen kutu ve visker diyagramı çizilmiştir. Bu hücrelerden VDAC3 (F) Normalize yoğunlukları kutu ve bıyık şemada çizilmiştir. (DF) için p değeri eşsiz T-testi türetilmiştir. *** **, P <10 -5 gösterir10 -5 <p <0.001 gösterir ve ns p> 0.05 gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre biyolojisinde Kantitatif mikroskopi yaygın sabit farklı nicel mikroskopi deneyleri gelişmekte hücre biyologları artan örnekler vardır, vb Ancak, (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra böyle Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), Floresan Kurtarma gibi canlı hücre görüntüleme deneyleri ile ilişkilidir Son yıllarda 27,34-36 hücreler. Önemlisi, sentrozom biyoloji anlamada ilerleme genellikle centrosomal havuzları diğer havuzlar daha farklı düzenlenebilir proteinlerin centrosome özel fonksiyon anlamayı gerektirir. Bu yüzden, özel olarak, iki farklı işlem gören numunelerde, bir proteinin nispi centrosomal seviyesini analiz etmek için bir nicel IIF bir deney geliştirildi. Bu hücreler sabit ve ayrı lamelleri işlenir gerektirdiğinden, bu nedenle nedeniyle iki experime taşıma gerekliliği olası eserler için daha iyi kontrol normalleşme, amacıyla bir iç standart tanıttıntal hücre ayrı ayrı nüfustur ve testin doğruluğunu artırmak. Bir test proteinin nispi floresan yoğunluğu ölçmek için böyle bir iç standart kullanılan bir kaç önceki çalışmalar 37 sadece vardır.
Dahili bir standart tercih eden deneyinin doğruluğu için çok önemli olduğundan, bu muhtemelen en zor yönüdür. İdeal olarak, S-fazında centriole çifti çiftleri ve çoğaltılamaz Sentriyoller sonra iki olgun sentrozomlar mitotik iğ kutuplarını haline böylece G2 sırasında γ-tubulin dahil olmak üzere ek PCM bileşenleri birikir. Bu nedenle, biz γ-tübülinin centrosomal düzeyi S-fazında kesinlikle vardır hücrelerde önemli bir değişiklik olmaz varsayıyorum. Bu S-fazı hücreleri, kısa bir BrdU etiketleme işaretlenmiştir RPE1 hücrelerinde durumda görünmektedir. Bununla birlikte, dahili bir standart geçerliliği, her bir hücre tipinde ve deneysel koşul için test edilmelidir. Örneğin, ise arka-plakası üzerindeCTED VDAC3 floresan, ayrıca ek centrosomal γ-tubulin küçük ama istatistiksel olarak anlamlı (p <0.001-değeri <0.05) artış vardı ((S-fazı tutuklandı) U2OS hücreleri tedavi aphidicolin önlemesi proteazom yanıt ikiden fazla kat arttı Şekil). Böylece, γ-tubulin bile hücre döngüsü yakalandı hücreler için, her zaman uygun bir iç denetim değildir.
Diğer tüm IIF mikroskopi tahliline benzer biçimde, bu deneyde dezavantajlarından bir test proteini ve iç standart karşı antikorların farklı konakçı türlerinde yükseltilebilir olmasıdır. Bizim veri Cep135 Sas6 daha iyi bir iç standart olduğunu göstermektedir ederken, biz de tavşan yetiştirildi bu proteinlere karşı kullanılabilir antikorlar gibi Cep135 karşı VDAC3 seviyelerini normale olamazdı. Bu nedenle, geç S-fazı ve G2 arasında VDAC3 seviyelerindeki azalma olan yüksek değerleri neden Sas6 karşı yerine normalleştirilmiş. Burada entegrasyon bir durumdarnal standart bir o varyasyon hesabını başka bir normalleşme faktörü tanıtabilirsiniz, alçakgönüllülükle değişir. Örneğin, Sas6 varyasyon düzeltmek için, biz Cep135 normalize Sas6 yoğunluğu Sas6 normalleştirilmiş VDAC3 yoğunluğu çarpılır.
Uygun bir iç standart seçimi zor olduğu durumlarda, floresan boya kaplı mikroküreler (0,02-0,04 mikron çapında) bir alternatif strateji sağlayabilir. Çevrede bulunan hücre ile aynı alanda mevcut olan bir floresan mikro sinyal ilgi proteine karşılık gelen floresan sinyalini normalize etmek için kullanılabilmektedir. Test ve kontrol hücreleri birlikte yansıması, diğer yandan, bir normalleştirme için bu tür bir iç standart gerekmeyebilir. Daha önce 19 önlemek ya da 20 DEGR teşvik ya da A 19 veya Antizyme 20 aşırı miktarda ya da siklin hücrelerde Mps1 arasında centrosomal düzeyini karşılaştırmak için bu tahlilinin bir çeşidi kullanmışlardırAynı zamanda görüntülü bitişik transfekte edilmemiş hücrelerde bulunan sırasıyla sentrozom, en Mps1 bölgesinin adation.
Proteazomu engellenmesi üzerine centrosomal VDAC3 etkisini incelemek amacıyla, S-fazında olan hücreleri tespit ve karşılaştırmak için BrdU etiketleme kullanılır. MG115 tedavisi, hücre döngüsü ilerlemesini inhibe edebilir, ancak bu inhibisyonu anlamlı ölçüde daha yüksek konsantrasyonu, bu çalışmada kullanılan 38 daha gerektirir. MG115 hücre döngüsü kontrol noktaları ve geçişler engelleyebilirsiniz, ancak hücre döngüsü ilerlemesini engellemez burada kullanılan konsantrasyonlarda. Biz MG115 DMSO göre BrdU pozitif hücrelerin yüzdesi değiştirmediğini gösteren burada olduğu gibi Bununla birlikte, bu, her hücre türü için kontrol edilmelidir. Ancak, afidikolin veya hidroksiüre (HU) kullanarak ya da 'off-shake' ve bırakın veya çift timidin blok ve serbest eşdeğer bir nüfusa üreten alternatif yaklaşımlar olarak kullanılabilecek mitotik kullanarak hücrelerin senkronize S-fazında hücreleri tutuklamayaS-fazı hücre leri.
Hücre döngüsü süresi noktaları incelemek için BrdU darbe-kovalamaca stratejisi soğukkanlı hücre döngüsü gerektiren birçok fonksiyonel tahlillerde çok yararlı olacaktır. Bu, çeşitli hücre döngüsü inhibitörleri kullanılarak hücre döngüsü tutuklama teknikleri değiştirmek mümkün olabilir, biyolojik olarak daha anlamlı bir deneydir. Bu inhibitörlerin kullanımı genellikle hücre döngüsü fenotipleri anormal değişiklikler elde edilen hücrelerde fizyolojik stres farklı neden olabilir. Darbe-kovalamaca yaklaşımının kullanılması sadece önceki çalışmalarda 23 tarafından önerilen bir tam blok neden karşı centriole takımını 39 gecikmiş Cetn2 bu tükenmesi göstermek için bize sağladı. BrdU-pozitif hücrelerin saptanması örneklerin asit hidrolizi gerektirir. Biz ve diğer birçok araştırmacı bir teknik kullanan ayırıcı için boyama yoğunluklarının önemsiz kaybı ile, test proteinleri, önce asit hidroliz için birincil ve ikincil boyandıktan sonra hücrelerin yeniden giderircentrosome proteinler 40 t. Ancak, potansiyel alternatif DNA 41 kopyalayan verimli dahil BrdU benzer 5-etinil-2'-deoksiüridin (EDU), başka bir timidin analog, kullanmak olabilir. Edu kimya tıklayın 'kullanarak Görselleştirme "asit hidroliz 42 gerektirir, ve bazı antikorlar için olabilir bu nedenle daha uygun değil.
Buna ek olarak, bu deney, kolaylıkla sentrozom de özel bir proteinin öteleme sonrası modifikasyon değişikliği ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, fosforilasyon centrosomal seviyesi fosforilasyon site-spesifik antikorlar mevcut olması şartıyla, proteinin kendisinin toplam seviyede karşı normalize edilebilir. Bu deney, hemen deneysel koşullar ya da hücre döngüsü faz arasında fosforilasyon göreli düzeylerini değerlendirmek için uygulanabilir, ancak, potansiyel fosforilasyon toplam seviyelerini değerlendirmek için adapte edilebilir, eğer kritik parametreler antikor parafin vetekli- bilinmektedir veya belirlenebilir. Ilgi bölgesi çok büyük olmamalı ancak bu deney, aynı zamanda, hücre, herhangi başka bir yerinde protein çalışmaları için geçerli olmalıdır. tahlili, çok sayıda hücre bölgelerinde lokal olarak yerleşen bir proteinin yere özgü modüle edilmesini ölçmek için özellikle faydalı olacaktır.
Bu tür ölçüm 43 doğruluğunu maksimize etmek dikkate alınmalıdır vb diferansiyel photobleaching, dijital görüntüleme etkisi, fluorophores floresan yoğunluklarının doğrusallık, arka plan gürültüsü gibi teknik parametrelerin bir avuç vardır. Örneğin, bir ışıkla ağartma katkısını araştırmak için her bir sekonder antikor ile ilişkili florokrom geçebilir. Birçok diğer parametreler de bir özdeş görüntüleme koşulları (pozlama süresi, kazanç, adım boyutu, Z-yığınlarının, vb sayısı) ve her görüntüleme vadede aynı görüntüleme yazılımı kullanıyorsa kontrol edilebilir. Kullandığımız rağmenGörüntü kıvrım giderme gerçekleştirmek için analiz boyunca Resim komşu algoritması, bu deney yinelemeli kısıtlı gibi diğer ters evrişim algoritması ile kombine edilebilir. Ayrıca, en yaygın olarak bulunan görüntü analiz yazılımı floresan yoğunluğu ve mesafe analiz araçları gibi, çeşitli görüntüleme yazılım paketleri herhangi bir sayıda bu testte kolaylıkla adapte olması gerektiğini not edin.
Bu tahlil, herhangi bir hücre türüne uygulanabilir olmalı, ve burada hücrelerin bizim seçim tamamen centrosome biyoloji araştırma alaka ve centrosomal VDAC3 fonksiyonu 16,28 bizim daha önceki sınavlarda kendi kullanımına dayanır. Bununla birlikte, darbe kovalayıcı iç standartlar ve uygun zamanlarda geçerliliği, her hücre türü için belirlenmelidir S-fazı, G2 veya mitoz bölünmede hücreleri tanımlamak için. Genel olarak, BrdU darbe-kovalamaca testi ile birlikte bizim yeni geliştirilen kantitatif floresan tekniği karmaşık birkaç çözmek için çok yararlı bir yöntem olacaktırcentrosome biyoloji ve hücre biyolojisi birçok geniş açıdan mekanizmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F.
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
