Abstract
Центросомах небольшие, но важные органеллы, которые служат в качестве полюсов митотического веретена для поддержания геномной целостности или собирают первичные реснички, чтобы облегчить сенсорные функции в клетках. Уровень белка может регулироваться по-разному в центросомах, чем в других местах .cellular, а изменение в центросомного уровне нескольких белков в различных точках клеточного цикла, как представляется, имеет решающее значение для надлежащего регулирования центриолей сборки. Мы разработали количественный анализ флуоресцентной микроскопии, который измеряет относительные изменения в уровне белка на центросомах в фиксированных клеток из различных образцов, например, в различных фазах клеточного цикла или после обработки различными реагентами. Принцип этого теста заключается в измерении фона исправлены интенсивность флуоресценции, соответствующую белку в небольшой области, и нормализуют что измерение по сравнению с аналогичным по другим белком, который не меняется в соответствии с выбранным экспериментальным Condition. Используя этот анализ в сочетании с BrdU импульса и стратегии погони изучения невозмущенных клеточных циклов, мы количественно подтверждено наше наблюдение, что в последнее время центросомных пул VDAC3 регулируется на центросомах во время клеточного цикла, скорее всего, от протеасомы-опосредованной деградации конкретно на центросомах.
Introduction
Центросомах состоят из пары центриолей, окруженных pericentriolar материала (ИКМ). Будучи основным микротрубочек организующих центров (MTOCs) в клетках млекопитающих, Центросомы служить как два полюса митотических веретен в делящихся клетках, и, таким образом, помогают поддерживать геномную целостность 1. В покоящихся клетках (например, при G0 фаза), один из двух центриолей центросомы, а именно материнской центриоли, превращается в базальной тела, чтобы собрать первичную ресничку, сенсорный органеллы, выступающий из клеточной поверхности 2. После того, как клетки повторно ввести в клеточный цикл, первичной реснички разобранном и каждый центриоль направляет сборку procentriole на ее проксимальном конце, который постепенно удлиняется с образованием зрелого центриоль 3. В начале S-фазы, колесом, как структура, которая обеспечивает 9-кратной симметрии к центриоли образуется на поверхности каждой существующей центриоли и станет основой каждого procentriole. Sas6 тшляпа является необходимым условием для центриоль сборка на работу, чтобы сформировать ступицу колесом 4-6. Другие центриолярных белки затем собираются на колесом в очень регулируется, проксимальнее дистальной образом 7. После точно завершения центриоли дублирования, клетки собрать дополнительные pericentriolar материалы, чтобы построить две функциональные центросомами к концу фазе G2 8. В дополнение к основным центриолярных компонентов 9-11, несколько других белков, включая киназы, фосфатазы, сопровождающих, компонентов строительных лесов, мембранные, связанных белков и деградации техники связаны с центриолей, базальных тел и PCM в разное время клеточного цикла 12-16. Часто отмечается, что центросомной уровни многих белков временно регулируются центросомных механизмов обеспечения адресности и / или деградации протеосомной на центросомах. Важно отметить, что колебания в центросомной уровне нескольких белков, таких как Plk4, Mps1, Sas6 и CP110 ат различные точки клеточного цикла, как представляется, важно, чтобы регулировать центриоль узел 5,17-22, а в случае Mps1 предотвращения этого центросомных деградации приводит к образованию избыточных центриолями 19. С другой стороны, центросомных фракции нескольких белков менее лабильным сравнению с цитозольных бассейнов. Например миРНК опосредованного вниз регулирования ЦентрИН 2 (Cetn2) привело к лишь умеренное снижение уровня белка в центриолей, несмотря на сильное снижение во всем его уровням клеток 23. Поэтому очень важно, чтобы измерить изменения в уровне центросомных белков на центросома, а не измерения целые уровни белка клеток при оценке их центросомой определенные функции.
В этом исследовании мы разработали анализ с использованием непрямой иммунофлюоресценции (IIF) для количественной оценки относительного уровня белка в центросомах. Этот анализ разработан особенно для анализа клеток, которые из разных образцови, таким образом, не могут быть отображены одновременно. Эти образцы могут быть клетки, которые обрабатывали различными реагентами (например, препарат по сравнению с контролем), собранных в различные моменты времени (то есть, по сравнению с импульсным погоне), или находятся в различных фазах клеточного цикла. Принцип этого теста заключается в измерении фона исправлены интенсивность флуоресценции, соответствующую белку в небольшой области и нормализовать это значение по сравнению с аналогичным по другим белком, уровни не изменяются при выбранных условиях эксперимента. Несколько исследований в биологии центросом недавно использованы различные количественные методы микроскопии, в обоих живых или фиксированных клеток, чтобы определить, центросоме-специфической функции белков-кандидатов 24-27. Как и в этих анализах, настоящая методика также измеряет фона исправлены интенсивности флуоресценции исследуемого белка. Тем не менее, включение нормализации с использованием внутреннего стандарта в этом анализе будет скорее всего больше предложитьточность и уверенность в анализе двух различных образцов, которые находятся на двух разных покровные. Кроме того, в дополнение к рассмотрении уровня белка в центросомах, с незначительными изменениями этот метод может быть применен к разнообразным набором экспериментальных условиях или в других клеточных сайтов.
Здесь мы объединим наши количественные микроскопии анализа со стратегией импульса погони BrdU сравнить клетки от различных стадий клеточного цикла. Вместо того, чтобы, используя стандартные ареста и освобождения клеточного цикла методы, чтобы изучить различные моменты времени клеточного цикла, асинхронно растущих клеток инкубируют с BrdU, чтобы маркировать клетки в S-фазе, и меченые клетки преследовали в течение различного времени (как правило, 4-6 ч). Большинство из меченых клеток будет в S-фазе непосредственно после импульса. Длина погоне выбрана так, что после того, как в погоне, меченые клетки будут в конце S, G2, или митоза, которые могут быть проверены с помощью морфологических характеристик, таких AS-положении центросомах по отношению к NUCлей, расстояние между центросомах, конденсации хромосом и т.д. Таким образом, длина погоне зависит от средней продолжительности S, G2 и M фазе конкретного типа клеток. Так как этот подход позволяет избежать ингибиторы клеточного цикла, такие как гидроксимочевина, aphidicolin, нокодазолом и т.д., что позволяет более физиологически значимого анализа клеточного цикла.
Таким образом, мы демонстрируем, что количественный флуоресцентной микроскопии в одиночку анализ, или в сочетании с BrdU импульса погони анализа, является простой, но мощный метод для точного измерения относительных изменений в центросомной уровня белка-кандидата во время невозмущенной клеточного цикла. Мы измерили центросомной уровень VDAC3, белка, который мы недавно были определены на центросомах в дополнение к митохондриях 16,28, используя эти анализы. Результаты, полученные здесь, проверить наш предыдущее замечание, что центросомной бассейн VDAC3 регулируется деградации, а также меняется в dependen клеточного циклат манера 16, кроме того, проверки применимости этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток
- Используйте теломеразы человека обратной транскриптазы (hTERT) увековечил эпителиальных пигментных клеток сетчатки (hTERT-RPE1; именуемый здесь RPE1).
ПРИМЕЧАНИЕ: RPE1 клетки почти диплоидные, без культурах трансформированных клеток человека, которые обычно используются для изучения центриолей сборку и ресничек. Эти клетки имеют нормальное центриоли цикл дублирования согласованный с регулируемой клеточного цикла. - Прохождение почти сливающийся 100 мм клеточной культуры блюдо RPE1 клеток в отношении 1: 5 разбавлении исходного культуры в свежую 100 мм чашку, содержащую 10 мл DME / F-12 (1: 1), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина (полную среду называют как DME / F-12 среду). Рост клеток при 37 ° С в присутствии 5% СО 2.
- Инкубируют 12 мм круглые покровные стекла в 50 мл 1 N HCl в закрытый стекл нный стакан, O / N без встряхивания при 60 ° С на водяной бане или инкубатора.
- Мтер отбрасывая раствор кислоты, мыть покровные три раза в 100 мл дистиллированной воды путем инкубации в течение 15 мин при периодическом встряхивании. Повторите промывание аналогично в 70% этанола и 95% этанола.
- Высушите покровные индивидуально распространения их на лабораторное промокательной бумаги в шкафу биобезопасности, с последующей стерилизацией УФ-излучением в течение 60 мин.
- Поместите 2-4 сухих покровных в 35 мм культуры клеток блюда. Развести раствор фибронектина или фибронектин, как инженерии полимера (концентрации запас 1 мг / мл) до концентрации 25 мкг / мл в культуре клеток PBS.
- Поместите 80-100 мкл разбавленного раствора на каждый покровное и инкубировать в течение 60 мин, чтобы покрыть верхнюю сторону покровное. Вымойте покровные три раза с помощью PBS перед добавлением полной среды.
2. растущих клеток и обработке клеток протеасома ингибиторов
- Прохождение 2 х 10 5 асинхронно растиING RPE1 клеток в каждой 35 мм блюдо с покровные и расти клетки в 2 мл полной среды. Замените культуральной среде каждые 24 ч со свежими подогретого полной среде.
- Для анализа влияния ингибирования протеасом на центросомной уровне тестового белка (здесь VDAC3 или γ-тубулина), растут клетки в двух 35-мм блюд на 44 часов. Заменить культуральную среду с полной среде и добавить либо MG115 или ДМСО в качестве контроля растворителя при конечной концентрации 5 мкМ или 0,05% соответственно. В то же время, добавление BrdU в клетки в конечной концентрации 40 мкМ и инкубировать клетки в течение 4 ч.
- Передача каждого покровное в 24-луночный планшет. Добавить 500 мкл охлажденного метанола в каждую лунку и инкубируйте при температуре -20 ° С в течение 10 мин, чтобы зафиксировать клетки на покровных стеклах. Немедленно промыть покровные три раза 500 мкл промывочного буфера (1X PBS, содержащий 0,5 мМ MgCl 2 и 0,05% Тритон Х-100).
- Урожай остаточнаяКлетки от 35 мм чашку и центрифуги клетки при 1000 х г в течение 5 мин. Используйте осадок клеток для анализа общего белка по вестерн-блоттинга (шаг 6).
3. BrdU импульса и Чейз Анализ Анализировать уровни белка в разных фазах клеточного цикла
- Для анализа изменения уровня белка (здесь VDAC3, Sas6 или Cep135) на центросомах на разных фазах клеточного цикла, роста клеток в двух 35-мм блюд, содержащих покровные для 44 часов. Заменить культуральную среду с полной среде, содержащей 40 мкМ BrdU и инкубировать клетки в течение 4 ч в инкубаторе для клеточных культур.
- С одной тарелки, передавать покровные в 24-луночный планшет для фиксации клеток с использованием охлажденного метанола, как описано выше в стадии 2.1.2.
- После BrdU импульса 4 ч, удалить BrdU-содержащий носитель, промыть клетки один раз PBS и один раз с полной среде, добавляют свежую среду, а затем растут клетки в отсутствие BrdU в течение различного времени (обычно другим 4 чДля RPE1 клеток) до фиксации клеток, как описано в стадии 2.1.2.
Примечание: Для RPE1 клеток, большинство из BrdU-положительных клеток в конце S или G2-фазы после 4 ч погоне. Это должно быть определено независимо для каждого типа клеток.
4. Иммуноокрашивание
- Инкубируйте фиксированные клетки на покровных стеклах в 200 мкл блокирующего буфера (2% BSA и 0,1% Тритон Х-100 в 1x PBS) в течение 30 мин.
- Инкубируйте клетки с соединением первичных антител (как правило, один поднял у кролика, а другой поднят в мыши) разводили в блокирующем буфере O / N при 4 ° С во влажной камере.
- Для того, чтобы влажной камере, положить влажное бумажное полотенце в нижней половине пустого 1000 мкл кончика пипетки коробке. Lay полоску парафильмом на поверхности стойки, и определить каплю (15-20 мкл) раствора антитела на пленке в течение каждого покровное быть инкубировали. Обратить покровное на капли раствора антител (так, что клетки погружаются) и близкоКрышка коробки наконечника.
- Обратить покровные снова и вернуть их обратно в 24-луночного блюдо. Промыть покровные, а затем инкубируют их в 150 мкл смеси вторичного антитела (здесь зеленый флуоресцентный краситель-конъюгированного антитела против кроличьего и красный флуоресцентный краситель-конъюгированного антитела против мышиного разводили в блокирующем буфере) в течение 1 ч при комнатной температуре. Вымойте покровные три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: флуорофорные-сопряженных вторичные антитела к свету. Защитите образцы из света во время шагов 4.1.3-5.1.2.
- Подготовка к анти-BrdU окрашивание с помощью фиксации окрашенные клетки RPE1 раз с 500 мкл охлажденного метанола при -20 ° С в течение 10 мин, как описано в стадии 2.1.2. Вымойте покровные три раза.
Примечание: Это крепление обеспечивает первичную и вторичную маркировку антител белка (ов), представляющие интерес в процессе кислотного гидролиза на следующей стадии.- Инкубируйте клетки в 200 мкл 2 N HCl в течение 30 мин при комнатной температуре. Нейтрализовать с 300 мкл 1 М Трис-Cl, рН 8бы мыть клетки три раза, используя промывочный буфер.
- Блок клетки снова с помощью 200 мкл блокирующего буфера в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте клетки с анти-крысиного BrdU антителами (разбавленный в блокирующем буфере) в течение 45 мин при 37 ° С во влажной камере. Возвращение покровные обратно в чашке 24-а, промыть их и затем инкубируют с красителем конъюгированного анти-крыс вторичными антителами синего флуоресцентного (разведенного в 150 мкл блокирующего буфера в 24-луночных блюдо в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Вымойте покровные три раза. Найди капли (примерно 3-6 мкл) монтажной раствора, содержащего antifade реагента на предметное стекло микроскопа. Обратить покровное, с сотового стороной вниз, на монтажной решения. Протрите лишнюю жидкость, слегка нажав покровное против скольжения с помощью мягкой чистки ткани. Применение прозрачного лака для ногтей по краю покровного стекла, чтобы запечатать его на предметное стекло микроскопа.
5. Иммунофлуоресценции изображения Acquisition и анализ
- Использование 100X Plan Apo масла иммерсионный объектив (с числовой апертурой 1,4), чтобы получить образы BrdU-положительных клеток RPE1 при температуре окружающей среды.
- Положите слайд на микроскопе (см оборудования), который прилагается с камерой, способной цифровых изображений. Для каждого флуорофора, определить подходящее время экспозиции (как правило, между 300-1000 мс) вручную изучения всех образцов эксперимента. Перед получения изображения клетки, вручную определить соответствующий верхний и нижний фокальной плоскости вдоль оси Z. (обычно 0,2 мкм размера шага). Получение изображений различных образцов, которые находятся на отдельных стеклах с использованием идентичных времени экспозиции для различных флуорофоров вдоль Z-оси с помощью цифровой пакет программного обеспечения обработки изображений микроскопии.
- Выполните деконволюции (в этих случаях не с помощью алгоритма, сосед) всех стеков изображения, полученных по Z-оси.
- Получить полную проекцию интенсивности каждого стека изображения поZ-оси.
- В клетках, где Центросомы близких (расстояние между двумя центросомах составляет менее 2 мкм), нарисуйте маленький квадрат (обычно 20-30 пикселей с каждой стороны) вокруг обеих центросом и отметьте выбранную область.
- Нарисуйте большую площадь (как правило, 24-35 пикселей с каждой стороны), окружающий первый квадрат и отметьте выбранную область большого квадрата.
- Получить область (А) и суммарную интенсивность флуоресценции (F) для каждого флуорофора в каждой коробке (S обозначает небольшую коробку и L обозначает большую коробку).
- Анализ фона исправлены интенсивности флуоресценции каждого флуорофора по формуле, описанной Howell и др 29:. F = F S - [(F L - F) × A S / (а L - S)].
- Получение нормированной интенсивности флуоресценции белка, представляющего интерес (здесь VDAC3 или Sas6) путем расчета отношения фонового коррекцией интенсивности флуоресценции ее FLuorophore к тому, что флуорофора, используемого для выбранного внутреннего стандарта (здесь γ-тубулина, Sas6 или Cep135).
- В случае анализа клетки, где Центросомы хорошо разделены (расстояние между двумя центросомах больше, чем 2 мкм), анализировать каждый центросому отдельно рисунок двух отдельных наборов коробок. Нарисуйте небольшой квадрат (обычно 15-25 пикселей с каждой стороны) вокруг каждого центросома и отметьте выбранную область. Нарисуйте большую площадь (20-30 пикселей на каждой стороне), окружающий первый квадрат и пометить выделенную область.
- Получение область (А) и суммарную интенсивность флуоресценции (F) каждого флуорофора в каждой коробке, и вычислить фоновые исправлены интенсивности флуоресценции каждого флуорофора, отдельно для каждого центросоме, как описано в стадии 5.3.3.
- Зерноуборочный фоновые исправлены интенсивности флуоресценции каждого белка из двух центросом, чтобы получить общее центросомных уровень этого белка в этой ячейке.
- Получитьнормированной интенсивности для интересующего белка путем расчета отношения от общего центросомного интенсивности к суммарной интенсивности центросомного внутреннего стандарта.
- Анализ по крайней мере, 15-25 клеток для каждой экспериментальной состоянии и построить график в таблице.
6. Анализ общего белка с помощью Вестерн-блоттинга
- Ресуспендируют клеток в анализе радиоиммуноосажден (РИПА) буфера, содержащего рН 50 мМ Трис-HCl, 8 150 мМ NaCl, 1% Nonidet Р-40, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) и инкубируют в течение 10 мин на льду чтобы лизировать клетки.
- Центрифуга смеси при 10000 х г в течение 10 мин, отделить от лизата гранулы фракции и измерить общую концентрацию белка каждого лизата с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) набора для анализа.
- Смешайте 40 мкг лизата с 4-кратным SDS-PAGE загрузки буфера (50 мМ Трис-Cl, рН 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 100 мМ дитиотреитола, 0,1% бромвичophenol синий).
- Отварить образцы в течение 10 мин и запуска образцов на 12,5% денатурирующих SDS-PAGE при постоянном напряжении 200 В.
- Передача белков, разделенных на SDS-PAGE на нитроцеллюлозную мембрану с использованием Вестерн-блоттинга техники (при постоянном напряжении 90 В в течение 1 ч в холодной).
- Блок мембраны с 3% обезжиренным молоком в PBS 1x, а затем инкубируют мембрану с разбавленными растворами первичных антител (в данном случае анти-кролик VDAC3, кролик анти-γ-тубулина и мыши анти-α-тубулина) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- После промывки мембраны три раза (каждый 5 мин инкубации при встряхивании) с помощью PBS-T (буфер 1X PBS и 0,2% Твин-20), инкубируют мембрану в смеси ближней инфракрасной (ИК) флуоресцентным красителем конъюгированного анти-кролик и ИК флуоресцентный краситель конъюгированные анти-мышиные вторичные антитела (разбавленный в PBS-T) в течение 1 ч.
- Вымойте мембраны три раза, а затем сканировать мембраны для анализа полосы с помощью инфракрасного Fluorescence система визуализации подходит для обнаружения иммуноблот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наши недавние исследования выявили новый центросомной локализацию и функцию VDAC3, один из митохондриальных поринов 16,28. Иммуноокрашивание нескольких клетках млекопитающих, включая RPE1 клеток с использованием VDAC3-специфические антитела показали заметную центросомной окрашивание и сравнительно слабую митохондрий окрашивания. Мы также показали, что центросомной VDAC3 преимущественно связаны с материнской центриоли, и центросомной пула как эндогенных и эктопически выразил VDAC3 регулируется деградации 16. Для того чтобы проверить количественную IIF анализа мы рассмотрели изменения в центросомой связано VDAC3 бассейн в клетках, которые находятся в S-фазе.
Здесь асинхронно растущих RPE1 клетки обрабатывали либо ингибитора протеасом MG115 или ДМСО растворителя управления в течение 4 ч. Чтобы ограничить наш анализ клеток, которые, которые находятся в S-фазе и проходит центросом в сборе, мы исследовали только клетки, которые включены BrdU дюкольцо тот же 4 ч и имел двух близко расположенных центросомами (расположенных в пределах 2 мкм друг от друга). Мы рассмотрели несколько случайных полей клеток, окрашенных для BrdU и ядер как из контроля и лечения MG115 (рис 1А) сделать вывод, что краткий лечение MG115 не влияет на BrdU включения (примерно 58%) по сравнению с контрольными лечение (примерно 56%) в RPE1 клеток. Как мы сравнивали только клетки, которые были в S-фазе (о чем судили по наличию двух γ-тубулина очагов расстоянии в пределах 2 мкм друг от друга), мы рассмотрели γ-тубулина в качестве потенциального внутреннего стандарта для нормализации. Таким образом, мы впервые рассмотрен, если центросомной уровни γ-тубулина в BrdU-позитивных клеток меняется при ингибировании протеасом. Не удивительно, что существуют значительные различия от клетки к клетке в γ-тубулина интенсивности флуоресценции от одной клетки к другой, и мы обнаружили, что это изменение было полно представлены в ящик с усами диаграмм, которые представляют набор как единое целое имеющихся данных. ЯN BOX и усов диаграммы, коробки представляют собой нижнюю и верхнюю квартиль, маркер в поле указывает на медиану каждой серии, и усы представляют минимальные и максимальные значения, которые часто (но не всегда) выбросы. Как видно на рисунке 1D, центросомных γ-тубулина уровень существенно не отличалась от BrdU-положительных клеток, обработанных либо MG115 или ДМСО, при этом проверки γ-тубулина в качестве внутреннего стандарта для данного эксперимента. В отличие от γ-тубулина, фон-исправлены интенсивность флуоресценции, соответствующий центросомного VDAC3 была примерно в 2,5 раза выше в MG115-обработанных клеток, чем в контрольных клетках (фиг 1с). Когда мы нормируемый суммарный VDAC3 флуоресценции по сравнению с эффективностью γ-тубулина, кратное увеличение незначительно снизилась до примерно в два раза (рис 1E). Хотя раз изменение было больше без нормализации, у нас есть больше уверенности в точности нормированных данных, которые мы считаем Беттконтроль ER для любой общей эффекта лечения MG115, а также из-за изменения обработки образца. VDAC3 окрашивание в не-центросомных сайтов (рисунок 1b) или общего клеточном уровне VDAC3 (рис 1F) не зависит от ингибирования протеасомы. Таким образом, мы количественно проверить наш предыдущее замечание, что центросомной бассейн VDAC3 регулируется протеасомного-опосредованной деградации.
Для того чтобы измерить изменение в центросомного VDAC3 во время клеточного цикла мы назвали клеток с BrdU импульса 4 ч с последующим 4 ч погоне меченых клеток. Так как только S-фазе клеток будет включать BrdU в течение импульса (среднее расстояние между двумя центросомах 1,35 ± 0,16 мкм), большинство BrdU-положительных клеток после RPE1 4 ч погоне будет в любом поздней S-фазе или в начале фазы G2 ( Среднее расстояние между двумя центросомах составляет 1,55 ± 0,22 мкм), с небольшим населением в конце фазы G2, где Centroнекоторая пара значительно разделены (среднее расстояние между двумя центросомах> 2 мкм) 30. γ-тубулина, будучи основным компонентом PCM сильно накапливается в центросомах во центросом созревания, которое происходит в фазе G2 31,32, и это увеличение делает его бедным внутренний стандарт для оценки изменения клеточного цикла других центросомных белков. С другой стороны, Sas6 набирается с procentrioles в начале S-фазы, чтобы стимулировать сборку кульбитов 4,5,7, и остается в основании вновь образованных центриолями, пока клетки вступают в митоз, когда она начинает разлагаться (фиг.2 и ссылку 5). Тем не менее, в HeLa или U2OS клеток, центриолярных уровень Sas6 постепенно увеличивается по мере клетки прогрессировать от S-фазы в фазе G2 5. Таким образом, мы впервые измерили центросомной уровень Sas6 по отношению к тому из Cep135, другой основной центриолей белка, который локализуется в проксимальных концах центриолей по всейклеточного цикла 33. Мы не наблюдали каких-либо существенных различий в фоновых исправлены суммарной интенсивности флуоресценции Cep135 или Sas6 в BrdU-положительных RPE1 клеток от импульса или погони, когда Центросомы близко расположены (рис 3а-D; "закрыть" клетки, где среднее расстояние между двумя Центросомы составляет менее 2 мкм). Соответственно, нормированный уровень Sas6 оставались подобны в этих клетках (фиг 3e). Тем не менее, мы наблюдали умеренное увеличение общего объема значений интенсивности флуоресценции Sas6 и небольшое увеличение же для Cep135 в клетках, где Центросомы хорошо разделены (расстояние между двумя центросомах> 2 мкм, "далекие" клеток). Соответственно, нормированная общей центросомных уровень Sas6 в клетках с два хорошо разделенных центросомах был немного, но статистически значимо выше, чем в клетках с близко расположенными центросомах. Это, вероятно, из-за присущей регулирования Sas6 уровня остроумияфазы цикла ч клеток 5. Тем не менее, это также возможно, что небольшое увеличение (или которые более низкой статистической значимости) обусловлены добавлением интенсивности флуоресценции двух центросомах, которые были проанализированы по отдельности, по сравнению с анализом два центросомами одновременно в клетках с близко расположенными центросомах. Тем не менее, когда интенсивность флуоресценции нормализовали VDAC3, что и только Sas6, уровень VDAC3 на двух близко расположенных центросомах была увеличена примерно в 1,5 раза в клетках, которые в конце S-начале / G2-фазы, по сравнению с ранней S-фазе клетки (рис 4A-C, F; "Закрыть" клеток). Когда эти клетки прогрессировать до конца фазе G2, нормированный уровень VDAC3 на двух центросомах была снижена на 2,4 раза по сравнению с, что в конце S-фазы (фиг.4С, F).
Поскольку уровни Sas6 немного увеличить с конца S-фазе G2, с помощью Sas6 в качестве внутреннего стандарта приводит к незначительному завышению декабряrease уровней VDAC3 в конце G2-фазы клеток (Центросомы разделены более чем 2 мкм). В то время как наши данные свидетельствуют о том, что Cep135 является лучшим выбором в качестве внутреннего стандарта для оценки изменения клеточного цикла, мы не можем использовать его для VDAC3, потому что антитела VDAC3 и Cep135 доступные нам оба из кролика. Тем не менее, умножения среднего значения для Sas6-нормированной VDAC3 (F VDAC3 / F Sas6) по средней стоимости Cep135-нормированной Sas6 дает нам приблизительное значение для Cep135 нормализуется VDAC3 [(F VDAC3 / F Sas6) X (F Sas6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Когда мы провели этот анализ, изменение уровней VDAC3 между конце S / начале G2 и конце G2 слегка падает до 2 раз. BrdU-положительных клеток, которые находятся в любой стадии митоза о чем судили по конденсированных хромосом и слабое окрашивание Sas6 исключены из анализа, в связи с резким падением уровней Sas6. Тем не менее, мы отметили, что уровень повторной центросомной VDAC3осталась низкой в течение митоза (данные не показаны). Поскольку уровень Cep135 не падают во время митоза (данные не показаны), мы могли бы, в принципе, повторите процедуру перенормировки, чтобы оценить Cep135-нормированные уровни VDAC3 в митозе. Однако, в действительности уровень центросомной Sas6 в митоза были слишком переменная для обеспечения точного определения Sas6-нормированных уровней VDAC3 в первую очередь. Несмотря на это, в целом, полученные данные подтвердили, что центросомных пул VDAC3 регулируется на центросомах в течение клеточного цикла.
Рисунок 1. Асинхронный растущие RPE1 клетки инкубировали с BrdU и MG115 (MG) или ДМСО (СД) в течение 4 ч. (А) Показаны случайные поля ДМСО или MG115 обработанные клетки окрашивали анти-BrdU антителами (красный) и Hoechst ( ДНК, синий). Здесь и во всех других изображений бар представляют 5 мкм.(BE) ДМСО или MG115 обрабатывают клетки окрашивали антителами против VDAC3, γ-тубулина и BrdU. BrdU-позитивных клеток были обследованы при одинаковых условиях обработки изображений (экспозиция times- 400 мс для синего флюорофора / ВДУ; 500 мс для зеленого флюорофора / VDAC3; 300 мс для красного флюорофора / γ-тубулина), и фон исправленных интенсивности флуоресценции VDAC3 и γ-тубулина были определены. Типичные изображения, показывающие VDAC3 (VD3, зеленый), γ-тубулина (γ-ванна, красный) и BrdU (синий) приведены в (B). Здесь и во всех других изображений, вставках цифровой увеличивается центросомами как указано квадратов. Фоновые исправлены интенсивности флуоресценции (F; в произвольных единицах), соответствующие VDAC3 и γ-тубулина из двадцать пять клеток приведены на коробке и усов диаграмме в (С) и (D) соответственно. Здесь и во всех других случаях, коробки представляют нижний и верхний квартиль, маrker в коробке (-) указывает на медиану каждой серии, и усы представляют минимальные и максимальные значения. Нормированные значения интенсивности флуоресценции VDAC3 из этих двадцати пяти клеток приведены на (E). Для (CE), стр значение из непарного Т-теста. *** Указывает р <10 -5, и нс указывает р> 0,05. (F) Иммуноблоты, показывающими уровень цельноклеточная о VDAC3 (как VDAC3a и VDAC3b 16) и γ-тубулина (γ-ванна), где α-тубулина (α-ванна) загружает контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное фигура.
Рисунок 2. Асинхронный растущие RPE1 клетки, которые были помечены с 4 часов BrсШ импульса и преследовали еще в течение 4 ч при отсутствии BrdU окрашивали антителами против Sas6 (зеленый) и γ-тубулина (γ-ванне, красный). Типичные изображения показывают окрашивание Sas6 течение (A) S-фазе (с двумя близко Sas6 очаги), (B) метафазы (два слабых Sas6 очаги на полюсах) и (C) телофаза (Sas6 очаги потеряли от полюсов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Асинхронное растущие RPE1 клетки были помечены BrdU импульса 4 ч и преследовали еще 4 ч при отсутствии ВДУ. BrdU-положительных клеток, окрашенных для Cep135 и Sas6 были обследованы при одинаковых условиях обработки изображений (экспозиция times- 400 мсдля синего флюорофора / ВДУ; 400 мс для зеленого флюорофора / Cep135; 500 мс для красного флюорофора / Sas6), и фон исправить флуоресценции интенсивностей Sas6 и Cep135 были определены. Расстояние между двумя центросомах также измеряли во всех клетках. Камера, в которой расстояние между двумя центросомах меньше 2 мкм рассматривать как "закрыть", а когда величина превышает 2 мкм был классифицирован как "удаленная". (AB) Типичные изображения, показывающие Cep135 (C135, зеленый), Sas6 (красный) и BrdU (синий) показано на рисунке. В (Б), C1 и C2 являются два Центросомы представительного 'далеком »клетки. (CD) фоне исправлены интенсивности флуоресценции (F; в произвольных единицах), соответствующую Sas6 (C) и Cep135 (D) от пятнадцати клеток каждой категории показаны на поле и усов диаграмме. (E) нормированные интенсивности Sas6 обезжиривающимм эти клетки построены в ящик с усами схеме. Для (CE), стр значение из непарного Т-теста. * Указывает 0,001 <р <0,05, а нс указывает P> 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. BrdU-позитивные клетки от выше BrdU импульса погони анализа (рисунок 3) окрашивают в течение VDAC3 и Sas6 были обследованы при одинаковых условиях обработки изображений (экспозиция times- 400 мс для синего флюорофора / ВДУ; 500 мс для зеленого флюорофора / Sas6; 1000 мс для красного флюорофора / VDAC3), и фон исправить флуоресценции интенсивности Sas6 и VDAC3 были определены. Расстояние между двумя центросомах измеряли во всех клетках, и клетки были классифицированы как «спотерять "(расстояние между двумя центросомах <2 мкм) и« дальней »(расстояние между двумя центросомах> 2 мкм), как показано на рисунке 3. (AC) Типичные изображения" Закрыть "ячейки в BrdU импульса (А), в BrdU погони (B), и «дальний» клеток в BrdU Чейз (C) окрашивают в течение VDAC3 (VD3, зеленый), Sas6 (красный) и BrdU (синий) показано на рисунке. В (С), C1 и C2 являются два Центросомы. [DE] Фоновые исправлены интенсивности флуоресценции (F; в условных единицах), соответствующие VDAC3 (D) и Sas6 (E) от пятнадцати ячеек каждой категории приведены в ящик с усами схеме. (F) нормированные интенсивности VDAC3 из этих клеток показаны на ящик с усами схеме. Для (DF), стр значение из непарного Т-теста. *** Указывает р <10 -5 **,указывает 10 -5 <р <0,001, и нс указывает P> 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количественный микроскопии в клеточной биологии обычно ассоциируется с анализами изображений живых клеток, таких как флуоресцентного резонанса передачи энергии (FRET), флуоресцентная Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP), и т.д. Однако, там растут примеры клеточных биологов, развивающиеся различные количественные микроскопии анализов для фиксированной Клетки в последние годы 27,34-36. Важно отметить, что прогресс в понимании центросом биологии часто требует понимания центросом-специфической функции белков, центросомной бассейны могут регулироваться иначе, чем другие бассейны. Таким образом, мы разработали количественное IIF анализа специально анализировать относительную центросомной уровень белка в двух по-разному обработанных образцов. Поскольку это требует, чтобы клетки фиксируют и обрабатывают на отдельных стеклах, поэтому мы ввели внутренний стандарт с целью нормализации, чтобы лучше контролировать возможных артефактов из-за необходимости обработки две experimental клеток популяций отдельно, и увеличить точность анализа. Есть только несколько предыдущих исследований 37, которые использовали такое внутренний стандарт для измерения относительной интенсивности флуоресценции испытуемого белка.
При выборе внутреннего стандарта имеет решающее значение для точности нашего анализа, это, возможно, наиболее сложным аспектом. В идеале, центриоли парные дублирующие S-фазе, и дублированные центриоли затем аккумулировать дополнительные компоненты PCM в том числе γ-тубулина во время G2 так, что два зрелых Центросомы может стать полюсами митотического веретена. Таким образом, мы предполагаем, что центросомной уровень γ-тубулина существенно не изменится в клетках, которые строго в S-фазе. Это, кажется, дело в RPE1 клетки, где S-фазы клетки, отмеченных краткого BrdU маркировки. Тем не менее, действия внутреннего стандарта должна быть проверена для каждого типа клеток и экспериментальных условиях. Например, в то время как фон-соотфлуоресценции ИДКТК VDAC3 увеличился более чем в два раза, в ответ на протеасом ингибирование aphidicolin обработке (S-фаза арестован) U2OS клетки, было также небольшой, но статистически значимым (0,001 <р-значение <0,05) увеличение центросомной γ-тубулина (дополнительный рисунок). Таким образом, γ-тубулина не всегда подходит внутренний контроль, даже для клеток, которые задержанных в клеточном цикле.
Подобно всем другим IIF микроскопии анализа, один из недостатков этого анализа является то, что антитела против тестируемого белка и внутреннего стандарта должна быть повышена в различных видов хозяев. В то время как наши данные свидетельствуют о том, что Cep135 является более внутренний стандарт, чем Sas6, мы не могли нормализовать уровень VDAC3 против Cep135 как имеющихся антител против этих белков и, поднятых в кролика. Таким образом, мы вместо этого нормализуется против Sas6, что вызвало завышение снижение уровня VDAC3 в период с конца S-фазе и G2. В ситуации, когда интеrnal стандарт изменяется незначительно, можно ввести еще один фактор нормализации для учета этого изменения. Например, для корректировки различий в Sas6, мы умножили Sas6-нормированной интенсивности VDAC3 со стороны Cep135-нормированной интенсивности Sas6.
В тех случаях, когда выборе подходящего внутренний стандарт трудно, микросферы флуоресцентный краситель покрытием (диаметр 0,02-0,04 мкм) может предоставить альтернативную стратегию. Сигнал флуоресценции микросфер, присутствующих в одной и той же области, что и клетки интереса может быть использована для нормализации флуоресценции сигнал, соответствующий интерес белка. С другой стороны, если тестовые и контрольные клетки отображаемого вместе, можно не нужен такой внутренний стандарт для нормализации. Ранее мы уже использовали версию этого анализа для сравнения центросомной уровень Mps1 в клетках с гиперэкспрессией или циклин A 19 или Antizyme 20, которые либо предотвратить 19 или поощрять 20 градadation из Mps1 в центросомах, соответственно, что в соседних нетрансфицированных клеток отображенных в то же время.
Для того чтобы исследовать влияние центросомной VDAC3 на ингибирование протеасом, мы использовали BrdU маркировки для идентификации и сравнения клеток, которые находятся в S-фазе. В то время как лечение MG115 может ингибировать прогрессирование клеточного цикла, это ингибирование требует значительно более высокую концентрацию, чем 38, которые используются в этом исследовании. В концентрациях, используемых здесь, MG115 может блокировать клеточного цикла контрольных точек и переходы, но не блокируют прогрессию клеточного цикла. Однако, это должно быть проверено для каждого типа клеток, как мы сделали здесь, показывая, что MG115 не изменяет процент BrdU-позитивных клеток по сравнению с ДМСО. Тем не менее, арест клеток в S-фазе с использованием aphidicolin или гидроксимочевину (HU) или синхронизации клеток с использованием митотического "встряхивание" и отпустите или двойной блок и выпуск тимидина могут быть использованы в качестве альтернативных подходов к генерации эквивалентную популярныеных клеток в S-фазе.
Стратегия импульсно-Чейз BrdU для изучения клеточного цикла моменты времени будет очень полезно во многих функциональных анализов, которые требуют невозмущенной клеточный цикл. Это биологически более значительным анализа, которые могут быть в состоянии заменить методы остановку клеточного цикла с использованием различных ингибиторов клеточного цикла. Использование этих ингибиторов могут часто вызывают различные типы физиологического стресса в клетках, в результате изменений в аберрантных фенотипов клеточного цикла. Использование подхода импульса погони позволило нам продемонстрировать, что истощение Cetn2 только задержало центриоли сборку 39, в отличие от вызывая полный блок, как это предлагается в предыдущих исследованиях 23. Обнаружение BrdU-положительных клеток требуется кислотного гидролиза образцов. Мы и многие другие исследователи используют метод, который повторно фиксирует клеток после первичной и вторичной окраски для тестовых белков, до кислотного гидролиза, с несущественной потерей интенсивности окрашивания для дифферет Центросома белки 40. Тем не менее, потенциал альтернативы может быть использование 5-этинил-2'-дезоксиуридин (ОБР), другой аналог тимидина, который, подобно тому, BrdU включены эффективно репликации ДНК 41. Визуализация EDU с помощью "мыши химию" не требует кислотного гидролиза 42, а может, следовательно, более подходит для некоторых антител.
Кроме того, этот анализ может быть легко использован для измерения изменений в посттрансляционных модификаций конкретного белка в центросомах. Например, центросомных уровень фосфорилирования могут быть нормализованы по отношению к общему количеству самого белка, при условии, что существует фосфорилирования сайт-специфические антитела. Этот анализ может быть немедленно применены к оценке относительного уровня фосфорилирования между экспериментальных условиях или фазах клеточного цикла, но потенциально может быть адаптирована к оценке общего уровня фосфорилирования если критические параметры антител парафиновыйтельности известны или могут быть определены. Этот анализ должен быть применим для исследования белков на любом другом сайте в клетках, хотя область интереса не должна быть слишком большой. Анализ будет особенно полезно для измерения в конкретном месте нахождения модуляции белка, который локализован на нескольких клеточных сайтов.
Есть несколько технических параметров, таких как дифференциальной фотовыцветания, эффект цифровых изображений, линейности интенсивности флуоресценции флуорофоров, фонового шума и т.д., которые должны быть приняты во внимание, чтобы максимизировать точность измерения 43. Например, можно переключить флуорохром, связанный с каждым вторым антителом, чтобы оценить вклад фотовыцветания. Многие другие параметры могут быть хорошо контролируется, если использовать одинаковые условия томография (время экспозиции, усиление, размер шага, количество Z-стеки, и т.д.) и тем же программным обеспечением визуализации при каждом запуске визуализации. Хотя мы использовалиАлгоритм Нет-сосед в течение нашего анализа изображения для выполнения деконволюции, этот анализ может быть объединен с другим алгоритмом деконволюции, такие как ограниченного итеративный. Отметим также, что это должно быть легко адаптировать этот анализ для любого количества различных программных пакетов изображений, а чаще всего доступного программного обеспечения для анализа изображений имеет инструменты для анализа интенсивности флуоресценции и расстояния.
Этот анализ должен быть применим к любому типу клеток, и наш выбор клеток здесь основывается исключительно на их значимость в центросом исследований биологии и их применение в наших предыдущих экспертиз центросомной VDAC3 функции 16,28. Тем не менее, действия внутренних стандартов и соответствующих времен для широтно-погони идентификации клеток в S-фазе, G2, или митоза должны быть определены для каждого типа клеток. В целом, наша недавно разработанная количественная методика флуоресценции в сочетании с BrdU импульса погони анализа будет очень полезным методом для решения некоторых сложнаямеханизмы центросом биологии и во многих более широких аспектов клеточной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F.
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
