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Neuroscience

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52038
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf
* These authors contributed equally

Summary

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Abstract

Microscopia de fluorescência multi-fotão permitiu a análise de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, é amplamente utilizada para estudar sinais de cálcio relacionadas com a actividade em pequenos compartimentos subcelulares, como dendritos e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio pós-sinápticos, as propriedades dos quais são compreendidos apenas marginalmente. Aqui, nós descrevemos um método para a célula inteira patch-clamp combinado e imagem de sódio multi-fotão em micro domínios celulares de neurônios centrais. Além disso, apresentamos um procedimento modificado de ultra-violeta (UV) uncaging -Light-induzida do glutamato, o que permite a ativação confiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Para este fim, as gravações de célula completa foram realizados em cornu Ammonis subdivisão 1 (CA1) neurónios piramidais em fatias de tecido aguda dahipocampo do rato. Os neurônios foram preenchidos com o corante fluorescente SBFI sensível ao sódio através do patch-pipeta, e multi-fotão excitação de SBFI permitiu a visualização dos dendritos e espinhas adjacentes. Para estabelecer uncaging focal induzida por UV, vários parâmetros, incluindo a intensidade da luz, o volume afectada pelo feixe uncaging UV, o posicionamento do feixe, bem como a concentração do composto testado foram engaiolados e optimizado. Nossos resultados mostram que a perfusão local com glutamato enjaulado (MNI-glutamato) e seu resultado UV-uncaging focal em correntes de entrada e transientes de sódio nos dendritos e espinhas. Curso de tempo e de amplitude dos dois sinais de correntes de entrada e de sódio correlacionar com a duração do impulso de uncaging. Além disso, os nossos resultados mostram que os sinais de cálcio intracelular são bloqueados na presença de agentes bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos, demonstrando que são mediados por influxo de sódio que esta via. Em resumo, o método fornece uma ferramenta fiável para oinvestigação dos sinais de sódio intracelular induzida por activação do receptor focal em tecido cerebral intacto.

Introduction

As recentes melhorias nas técnicas de microscopia óptica, como a microscopia multi-fotão têm permitido o estudo de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, estas técnicas são agora amplamente utilizados para analisar os sinais elétricos relacionadas com a atividade dos neurônios, bem como sinais concomitantes de cálcio em pequenos compartimentos subcelulares, ou seja, em dendrites finas e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio em dendritos e espinhas, que possuem propriedades que são largamente inexplorado. Tais sinais podem ser analisados ​​por dois fotões imagiologia de sódio intracelular ([Na +] i) que permite a medição em linha de [Na +] i transitórios durante períodos prolongados sem branqueamento significativo corante ou foto-dano 1,2.

Para imagiologia de [Na +] i por exemplo, Corona Verde ou Asante Natrium Verde 3,4. A sonda fluorescente mais usada para Na + imagem é isophthalate benzofuran- (SBFI) de ligação de sódio. É uma medida proporcional, corante UV-animado semelhante ao conhecido corante sensível ao cálcio com fura-2, e tem sido empregada para imagiologia convencional de Na +, em muitos tipos de células (por exemplo, 5,6). Existem diferentes possibilidades de excitar o corante e coleta de sua fluorescência. Se a alta resolução temporal (ou seja, uma taxa de quadros alta de imagem) é necessária em combinação com a informação espacial, SBFI pode ser animado com uma lâmpada xenon arco ou um dispositivo de alta potência diodo emissor de luz (LED) e sua emissão detectada com uma carga de alta velocidade dispositivo -coupled (CCD) 7,8. Para resolução espacial máxima profunda no tecido, microscopia de varredura a laser multi-fotão é o método de escolha 9. A relativamente baixa efficie quantumNCY de SBFI exige concentrações relativamente elevadas de corante (0,5-2 mM), e o carregamento directo de forma a membrana impermeável de SBFI através de um microeléctrodo afiada 10 ou remendo pipeta 1.

Usando SBFI, trabalho anterior realizado em fatias de tecido agudas do hipocampo de roedores demonstraram transientes de sódio relacionadas com a actividade em dendritos e espinhas de neurônios piramidais CA1 que são causadas principalmente pelo influxo de sódio através ionotrópico receptores NMDA 1,2. Para o estudo das propriedades de tais sinais de sódio locais em mais detalhe, a activação específica de receptores pós-sinápticos, por aplicação de agonistas do receptor é um método bem adequada de escolha. Para imitar a atividade pré-sináptica e liberação do transmissor, a aplicação deve ser relativamente breve e focada para permitir estimulação local. Isto, no entanto, provou ser um grande desafio em tecido intacto. Aplicação de pressão local de agonistas do receptor utilizando uma pipeta de ponta fina permite ap muito focalcação, mas hospeda o risco potencial para a produção de movimento da estrutura de interesse (por exemplo, como um dendrito ou espinhas dendríticas), e, portanto, impede a imagem de alta resolução. A adequação da iontoforese de substâncias neuro-ativa depende de suas propriedades elétricas e altas amplitudes atuais podem produzir artefatos celulares também.

Uma maneira de contornar esses obstáculos é o emprego de compostos fotoativados e sua fotólise. Basicamente, dois princípios diferentes são usados ​​para a foto-ativação de substâncias enjaulados: I) Wide-campo do flash fotólise 11 e II) uncaging focal empregando módulos de digitalização em combinação com lasers 12. Enquanto todo o campo de flash fotólise é utilizada para activar grandes regiões de interesse, por exemplo, uma célula inteira, uncaging focal é utilizado para estimular especificamente pequenos compartimentos celulares. No presente estudo, nós demonstramos um procedimento de célula inteira de patch-clamp e multi-pimagiologia de sódio Hoton em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging induzida por luz UV de glutamato, o que permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido.

Protocol

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade Heinrich Heine de Düsseldorf, na Alemanha, bem como a Directiva da Comunidade Europeia do Conselho (86/609 / CEE). Todos os experimentos foram comunicadas e aprovadas pelo Bem-Estar Animal de Escritório no Centro Animal Care and Use da Universidade Heinrich Heine de Düsseldorf, Alemanha (Ato Institucional: ø52 / 05). De acordo com o Animal Welfare Act Alemã (Tierschutzgesetz, os artigos 4 e 7), sem aprovação formal adicional para a remoção post mortem de tecido cerebral era necessário.

Para a geração de fatias aguda, os ratos foram anestesiados com CO 2 e rapidamente decapitado (seguindo a recomendação da Comissão Europeia, publicado em: Eutanásia de animais experimentais, Luxemburgo: Serviço das Publicações Oficiais das Comunidades Europeias, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).

1 Preparação deSoluções

  1. Preparar fluido cerebroespinal artificial (ACSF) para dissecção contendo (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 de CaCl2, 6 de MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 20 de glucose e, borbulhar com 95% de O 2 e 5% de CO 2, o que resultou num pH de 7,4.
  2. Preparar para ACSF experiências contendo (em mM): 125 de NaCl, 2,5 de KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 20 de glucose e, borbulhar com 95% de O2 e 5% de CO2, o que resulta em um pH de 7,4.
  3. Preparar a solução intracelular (ICS), contendo (em mM): 150 KMeSO 3, 12,5 hidroxi etil piperazina etano sulfónico (HEPES), 40 KCl, NaCl 5, 1,25 etileno glicol ácido tetraacético (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Na- GTP. Ajustar o pH para 7,3. Armazenar alíquotas de 1 ml a -20 ° C.
  4. Diluir (SBFI) -sal isoftalato benzofurano-ligação de sódio em água bidestilada e preparar alíquotas de 5 ulde uma solução de estoque de 10 mM.
  5. ICS Descongelar e adicionar solução estoque SBFI a uma concentração final de 1 mM. Vortex e micro-filtrado (0,22 pm). Manter a 4 ° C até serem usadas na experiência. Não volte a congelar e usar apenas por um dia.
  6. Preparar a solução de estoque de glutamato MNI 50 mM através da dissolução do composto em água destilada duas vezes. Diluir MNI solução estoque de glutamato para uma concentração final de 5 mM em ACSF normal. Manter a 4 ° C até serem usadas na experiência. Não volte a congelar e usar apenas por um dia. Armazenar aliquotas que não sejam imediatamente utilizadas na experiência, a -20 ° C.

2 Dissecção da Tissue

NOTA: A preparação de fatias de hipocampo agudas do cérebro de roedores foi descrito em pormenor anteriormente 13,14. Em resumo, o protocolo seguinte foi utilizado no presente estudo.

  1. Após a decapitação, remova rapidamente o cérebro do crânio.
  2. Colocar imediatamente o cérebro de uma placa de petricom gelado dissecção ACSF e dissecar um hemisfério, realizando um corte sagital ao longo da linha média.
  3. Executar um segundo corte na orientação desejada como uma superfície de bloqueio e adicionar esta fase para o corte de um vibratome com supercola.
  4. Tome câmara de corte e do elemento de refrigeração (ambos mantidos a -20 ° C) de vibratome fora da fase de corte e congelador lugar com secção cérebro na câmara. Em seguida, coloque elemento de refrigeração na câmara e mergulhe o tecido em gelada dissecção ACSF. Para estabilizar a preparação, pode-se quer para contrariar o bloco de tecido com gel de agar.
  5. Cortar fatias de 250 um de espessura, parasagital do hipocampo com vibratome. Certifique-se de que todos os fluidos ACS são borbulhava em todos os momentos.
  6. Após o corte, manter o tecido em malha, num copo com ACSF normal e incubar a 34 ° C durante 30 min. Em seguida, manter a temperatura ambiente.

3 Preparação de Hardware


Figura 1 Esquema mostrando caminhos de luz e controle experimental do equipamento que consiste em imagens multi-fotão, de varredura a laser flash fotólise UV, e eletrofisiologia. The multi-fótons (vermelho) é produzido por uma (IR) laser pulsado, ajustável infravermelho (TISA). Ele passa um obturador mecânico, uma célula de Pockels ', e o detector de IR (detecção da intensidade do feixe), os quais permitem que o controlo da potência do laser e a sua duração de administração. A / flip-out diodo laser opcional flip-in é empregada para alinhamento de base do feixe de laser. O expansor de feixe pode ser usado em combinação com os objectivos com um plano extremamente largo de volta-focal. A roda de filtro controlado remotamente ND podem ser utilizados para além ou em vez da célula de Pockels os 'para controlar a potência do feixe de laser. Depois de passar pela cabeça de leitura, o IR-luz pulsada é guiada ao modelo. Emitemted luz de fluorescência (verde claro) é coletado tanto pelo externo ou os detectores fotomultiplicadores internos (PMTs). Os detectores externos são totalmente sincronizados com os PMT internos através de um interruptor de alta freqüência (controlador PMT). O feixe uncaging (azul claro) é produzido por um laser UV de estado sólido (DPSS UV-Laser). Em seguida, é direcionado para a unidade de digitalização-driven galvo na parte superior traseira do condensador epi-fluorescência por um guia de luz. O posicionamento preciso (aberração cromática entre imagem e feixe uncaging) do ponto uncaging ou área está habilitado pela exportação de imagem do software de imagem. A gestão de tempo para sincronizar a imagem, a eletrofisiologia, ea fotólise é controlada eletronicamente. O detector de transiluminação (TL-PMT) é de necessidade para documentação do posicionamento das pipetas no interior do tecido. As unidades de controlo e de software do sistema de imagem, o qual foi modificado, é utilizada para controlar e sincronizar todos os outros dispositivosnecessário para executar o sistema. Os componentes do sistema rotulada como "custom" foram concebidos e construir / adaptado pelos autores. Alguns componentes foram adaptados para atender as exigências do sistema de multi-fotão custom-build e são rotulados como "modificado". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Ligar os componentes do sistema multi-fotão. Testar e ajustar o alinhamento do feixe de laser infravermelho.
    1. Controle o posicionamento do feixe lançando no prisma centralização em vez de um objetivo. Se o feixe é deslocado, re ajustar-lo pelos espelhos do periscópio. Note-se que o plano de centragem do prisma deve ser, ao mesmo nível que o plano focal posterior da objectiva enquanto a imagem.
    2. Ligue o espectrômetro e verificar as características multi-fótons do feixe.
    3. Definir parâmetros do software de imagem para os seguintes valores: Escolhaum tamanho de quadro de 512 x 512 pixels para imagens Visão geral das células (caixas de clipes menores, com um fator de zoom de 2,5 em alta taxa de quadros e de alta resolução espacial, respectivamente). Defina a velocidade de imagem para o modo rápido e modo de digitalização para XYT. Z-stepping deve ser de 1 mm para pilhas visão geral e 0,2 mm para pilhas detalhados para atender às necessidades espaciais de amostragem para deconvolution realizada mais tarde.
  2. Ajuste multi-fotão feixe de laser (790 nm) intensidade, alterando configurações do celular as Pockels '(poder final ao abrigo do objectivo: ≈ 14-16 mW) e as foto-multiplicadores (PMTs).
  3. Ligue e calibrar sistema uncaging colocando uma lâmina de amostra fluorescente sob a lente objetiva.
    1. Usando binóculos, ajustar o foco da óptica UV e espacialmente limitar o ponto de laser UV para um tamanho de 2 m de diâmetro no máximo, empregando a unidade com foco na cabeça de leitura UGA.
    2. Comece a rotina de calibração da unidade de controle softwar uncaginge.
      1. Defina a laser UV para vários pontos dentro de sua faixa de varredura, enquanto a fluorescência é capturado com uma câmera CCD. Ao carregar no ponto de laser de UV em cada ponto, se ajustar a posição dos espelhos de verificação galvânicos para corresponder a um determinado coordenadas no software.

Figura 2
Figura 2 esquema detalhada que ilustra as características de excitação, e percursos dos feixes de emissão uncaging. O feixe de excitação IV (vermelho) passa o feixe de combinação espelho dicróico ao nível da torre arquivador no condensador de epi-fluorescência do microscópio e para o objectivo atingir a amostra. O feixe uncaging (azul) é entregue através de um quartzo de fibra óptica de luz para a colimação e feixe de unidade com foco e posteriormente guiada aos mi de digitalizaçãorrors na unidade de digitalização, passa um espelho dicróico ao feixe combinando espelho dicróico. Aqui é combinado com o feixe de varrimento de excitação. A luz emitida a partir da amostra a seguir o caminho do trajecto do feixe de varrimento de excitação na orientação oposta em relação à cabeça de leitura de imagem. A câmara é utilizada para o controlo visual da pipeta patch e para o posicionamento do feixe de uncaging em combinação com o microscópio confocal de varrimento a laser (não mostrado). O caminho da luz verde representa uma iluminação epi-fluorescência opcional que pode ser de uso com outras aplicações.

      1. Use o sistema de fotólise no modo local para ganhar aplicações focais. Certifique-se de que o ajuste de foco do feixe de uncaging (potência média por baixo da objectiva: 0,55 mW) resulta em um tamanho de mancha de 1,5 um de diâmetro (extensão xy) como revelado em uma corrediça fluorescente posicionado num nível z que corresponde ao do um tecidofatia (não mostrado).
    2. O posicionamento preciso do local uncaging é conseguido através da importação de uma imagem do sistema de imagem por meio de uma conexão de rede entre uncaging- e imagem-computadores.
      1. Usando um software capturador de tela, ler continuamente os quadros do software de imagem (ao invés da alimentação da câmera) e ajustar os quadros de imagem e uncaging congruente. Exporte todos os 10 º quadro do software de imagem como uma imagem de referência para a unidade de flash para garantir o ajuste adequado durante todo o experimento.

Figura 3
Figura 3 O ajuste do ponto uncaging: Para posicionar precisamente o local uncaging, uma captura de tela do software de imagem (quadro amarelo) é importado para o software uncaging (quadro verde). Aimagem à esquerda dentro do quadro amarelo representa uma imagem Hi-Lo codificado (azuis: pixels pretos, vermelho: saturado pixels) de toda a célula CA1 piramidal. A imagem é sobreposta pela grelha de calibração do software uncaging (verde "X"). Para a direita, uma parte ampliada da célula é mostrada com o ponto uncaging sobreposta (cruz vermelha). A mancha amarela é a imagem sobreposta automaticamente do feixe uncaging. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Ligue micromanipuladores, componentes de eletrofisiologia e dispositivo de aplicação de pressão para entrega do composto enjaulado para a região de destino.
  2. Instale um dispositivo de aplicação de pressão focal para perfusão local de compostos engaiolados. Isto reduzirá os custos de enorme em comparação com o banho de perfusão destas substâncias. Ajuste a pressão segurando a pressão atmosférica dada para impedir que um arrastar de ACSF para dentro ou para uma fuga de substâncias enjaulados da pipeta de aplicação.
    NOTA: O dispositivo de aplicação de pressão apresenta um micro-válvula de alta precisão e ultra-rápida no suporte da pipeta. Isso permite empregar pressões de aplicação mínimas e, portanto, reduz artefatos de movimento a um mínimo durante a perfusão local com o composto enjaulado.
  3. Puxe para pipetas de célula inteira patch-clamp e perfusão local usando capilares de vidro de borosilicato polido-fogo. As pipetas devem ter um diâmetro da ponta de ~ 1 ^ m e uma resistência de R ≈ 3 mohms (valores determinados com K-MeSO 3 baseada ICS).
  4. Local fatia no banho experimental e apor-a com uma grelha (quadro platina 250 um de espessura, com filamentos estendidos cirúrgicos, od 40 um) (Figura 4A, B). Use um, (bola de sucção no lado da ponta quebrada) quebrada de ponta porosa e fogo-polido Pasteur pipeta invertida para a transferência de fatia. Evite dobrar e qualquer outra movimentação dura da fatia.
    5. Figura 4
    Figura 4 Os componentes do banho experimental e posicionamento do banho na platina do microscópio. (A) O banho experimental consiste no próprio (quadrado azul) câmara de banho, que está rodeada por um anel de metal magnético. O tubo assegura perfusão contínua do banho com uma solução salina (ACSF). A grade para prender e fixar a fatia é colocado na câmara de banho. (B) preparação fatia aguda posicionado dentro da câmara de banho. A fatia é fixado pelos fios da grelha. (C) de posicionamento e da geometria do banho experimental na fase de microscópio durante os experimentos.

    1. Coloque banho na fase microscópio e permanentemente perfuse fatia com ACSF.

    4.-cell Whole Patch-aperto

    1. Carga remendo pipeta com ICS contendo SBFI e carregar pipeta perfusão local com composto enjaulado. Anexar pipetas para micromanipuladores correspondentes. Coloque eletrodo de referência no banho. Certifique-se de que você está aterrado de forma permanente, para evitar danos ao palco cabeça (cf Figura 4C).
    2. Abaixe as duas pipetas em banho e colocá-los acima da região hipocampal CA1. Aplique uma leve pressão para pipeta de patch (40 mbar) para evitar a diluição dos ICS com ACSF.
    3. Compensar o potencial deslocamento da pipeta patch usando o software de eletrofisiologia.
    4. Aproxime-se de uma célula piramidal CA1 com o patch pipeta empregando microscopia vídeo IR-DIC. Aplicar sucção suave até uma Giga-selo é obtido. Escolha de uma célula a soma dos quais está localizado a 30 -70 uM abaixo da superfície da fatia para assegurar a morfologia das células intactas do lado da mão e uma menor espalhamento e atenuação do feixe uncaging do lado contrário.
    5. Compensar a capacidade de rápido. Membran pausae e de células abertas para obter a configuração de célula inteira.
    6. Compensar a capacidade de lenta e resistência série.
    7. Permitir que a célula a ser dialisado com os SBFI-ICS durante pelo menos 30 minutos antes de começar as experiências de imagiologia.

    5. imagem multi-fotão e estimulação

    Figura 5
    Figura 5 protocolo experimental. Para inicializar um experimento, um pulso de disparo (indicado pelo sinal vermelho (ᴨ) ea linha vermelha) está definido para iniciar, simultaneamente, a imagem latente (azul), a eletrofisiologia (verde), e da administração do Caged composto (amarelo) no ponto de tempo 0 seg. Durante este primeiro período, o feixe de imagem deve ser totalmente escurecida (luz azul). Após 4,5 s (linha tracejada), a perfusão local do composto enjaulado é encerrado eo feixe de imagem deve ser definida para o seu worintensidade rei para aquisição de dados (azul). 1.5 sec depois (tempo ponto 6 seg), um segundo pulso de disparo é dado (indicado pelo sinal vermelho (ᴨ) ea linha vermelha), que inicializa a unidade de flash UV (duração do flash: 300 ms; indicado pelo flash amarelo ) e define marcadores na eletrofisiologia eo protocolo de imagem.

    1. Adicionar tetrodotoxina (TTX, 500 nM) para ACSF para evitar a ativação dos canais de sódio dependentes da voltagem e da geração de potenciais de ação.
    2. Visualize morfologia celular utilizando multi-fotão excitação e resultando SBFI fluorescência e escolher um dendrito espinhoso para a experiência. Zoom para imagens em uma resolução maior e colocar uma caixa de grampo em torno do dendrito.
    3. Encha uma pipeta de patch padrão com ACSF 10 l contendo glutamato enjaulado. Ligue a pipeta para o sistema de aplicação de pressão e anexá-lo ao micromanipulador.
    4. Coloque pipeta com composto enjaulado perto do dendrito (~ 30 m). Posicione a pipeta para permitirperfusão local eficiente da dendrite de escolha. Ajustar o laser uncaging: posicionar o local uncaging estreita (~ 1-2 mm) para a estrutura de interesse.
    5. Definir regiões de interesse no dendrito escolhido e espinhas adjacentes usando software de imagem.
    6. Aproxime-se da região de interesse e focally injetar o composto enjaulado por vários segundos com baixa pressão (<3 PSI). Iniciar patch clamp e gravações de fluorescência (excitação em 790 nm, de multi-fotão) através de um sinal de disparo.
      Nota: Durante a perfusão local do composto em gaiolas, o feixe de excitação é completamente escurecido para prevenir o branqueamento.
    7. Pare a perfusão local do composto enjaulado. Aumente a intensidade do laser de dois fótons para permitir excitação eficiente de SBFI e aplicar um flash UV para inicializar uncaging (uncaging duração de 300 ms).
    8. Monitorar alterações em SBFI fluorescência. Parar a gravação depois SBFI fluorescência se recuperou de volta à linha de base.

    6 Farmacologia

    1. Para testar o envolvimento de receptores de glutamato ionotrópicos na geração de correntes e / ou sinais de sódio evocadas por fotólise por UV do glutamato enjaulado, empregar os bloqueadores do receptor.
      1. Mudar para ACSF contendo o bloqueador do receptor de AMPA-ciano-nitroquinoxalina-diona (CNQX, 10 uM) e do bloqueador do receptor de NMDA-amino-fosfonopentanoato (APV, 50 uM), para além de TTX (ver acima) e perfundir fatia de pelo menos 10 min.
      2. Procedimento de estimulação Repeat (ver 5.4 e 5.5.)
    2. Reversibilidade dos efeitos dos inibidores
      1. Volte para o ACSF normal contendo apenas TTX.
      2. Perfundir fatia para 20 min.
      3. Procedimento de estimulação Repeat (ver 5.4 e 5.5.).

    7 Morfologia

    1. Gravar um XYZ-stack do clipe box set-região para as medições realizadas. Certifique-se que esta pilha é oversampled espacialmente (pelo menos 0,2 m por pixel) para permitir deconvolution melhor imagem e para aumentar a qualidade de imagem e resolução.
    2. Gravar um XYZ-pilha de toda a célula para avaliar a morfologia das células.
    3. Algoritmo de deconvolução executado.

Representative Results

No presente estudo, nós demonstramos um método de microscopia multi-fotão de dinâmica de sódio celulares com o corante fluorescente SBFI dependente de sódio em neurónios piramidais CA1 do rato aguda fatias de tecido de hipocampo. Além disso, mostramos como combinar esta técnica de imagem com uncaging baseada no escaneamento a laser de compostos neuro-ativo (por exemplo, o glutamato enjaulado) e seu direcionamento preciso para micro-domínios celulares.

Carregando os neurónios com SBFI através da pipeta patch-activada a visualização de toda a célula, incluindo dendrites finas e espinhas adjacentes, empregando múltiplos fotões de excitação (Figura 6A, B, D e figura 7A).

Figura 6
Figura 6 sinais de sódio e correntes sinápticas induzidas por fotólise de glutamato enjaulado. (A) Maximimagem de projeção al de um neurônio CA1 piramidal carregado com SBFI via pipeta de patch (PP). A caixa indica a área mostrada ampliada em B. LP indica a posição e orientação da pipeta para a perfusão local de glutamato enjaulado. (B) de projecção de alta potência máxima de uma pilha de secções ópticas de uma dendrite com espinhas dendriticas adjacentes. As pilhas de secções ópticas sofreu z-alinhamento e deconvolução. A cruz vermelha indica a região alvo do feixe uncaging. A linha pontilhada laranja delineia a região de interesse a partir do qual a emissão de fluorescência foi registada. A caixa indica a área mostrada ampliada em D. (C) Esquerda: sinal de sódio (linha superior) e somático interior atual (linha inferior) induzida por fotólise de glutamato enjaulado (indicado pelo flash amarelo). A linha vermelha representa um ajuste dos dados experimentais. A área cinzenta representa o período em que o flash uncaging (300ms) obstruiu a imagem de fluorescência SBFI Direito.: Sem pré-perfusão com glutamato enjaulado, o mesmo-flash UV nem provocou uma mudança na emissão SBFI, nem uma corrente para dentro (D) À esquerda:. Imagem de alta potência do dendrito e adjacente espinhas, conforme esboçado na B. Ao lado, a mesma imagem com valores de cinza invertidos. As linhas tracejadas indicam as regiões de interesse, em que a emissão de fluorescência foi registado. A cruz vermelha indica a localização do feixe uncaging direita:. Transientes sódio induzida por fotólise-lampejo de UV de glutamato enjaulado. Traço azul: sinais de sódio no dendrito; traço vermelho: resposta média de três espinhas adjacentes ao local uncaging; traço verde: resposta média de três espinhas distantes. favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.

Após a perfusão local com Cagedglutamato, a aplicação de um flash de UV perto de uma dendrite resultou numa diminuição transitória na emissão de fluorescência de SBFI, reflectindo um aumento na concentração de cálcio intracelular (Figura 6C, D e Figura 7B). Ao mesmo tempo, uma corrente de influxo foi registada a soma (Figura 6C e a Figura 7B). Aumentando a duração do flash de UV resultou no aumento da amplitude de ambos os provocada correntes para dentro e os sinais de sódio (dados não mostrados), indicando que o sistema foi bem dentro da sua gama dinâmica e que as respostas celulares nem uncaging nem estavam saturados. Aplicação de um aparelho de lampejo de UV de duração idêntica ou mais fatias para que não havia sido pré-perfusão com glutamato enjaulado, nunca provocou alterações na fluorescência SBFI nem correntes de entrada, indicando que estes sinais são devido à uncaging de glutamato (Figura 6C). Além disso, estes resultados mostram que nenhum dos componentes interdependência imaging- e observa-se u uncagingnder nossas condições experimentais. Sinais de sódio também pode ser detectado nas espinhas dendríticas (Figura 6D). Enquanto nós não tentou realizar a estimulação de uma única coluna apenas com glutamato uncaging, amplitudes de pico tende a ser um pouco maior em lombadas próximas ao local uncaging, enquanto que as espinhas mais longe mostrou alterações de fluorescência praticamente idênticas às do dendrito pai (Figura 6D).

Por fim, estudou-se o caminho para o influxo de sódio em dendritos e espinhas em resposta a uncaging de glutamato. Para este fim, utilizou-CNQX e APV, que são bloqueadores selectivos para os sódio-permeável, os receptores do glutamato ionotrópicos do AMPA- e subtipo NMDA-, respectivamente. Os nossos resultados mostram que os sinais de sódio intracelular induzida pelo glutamato e as correntes somáticas eliciados foram omitidos na presença destes bloqueadores (Figura 7B). Após a lavagem para fora dos bloqueadores, os sinais são recuperados. Isso demonstra that uncaging de glutamato ativa os receptores de glutamato ionotrópicos em neurônios piramidais CA1, que medeiam o influxo de sódio em dendritos e espinhas, resultando em transientes de cálcio intracelular ea correntes de entrada.

Figura 7
Figura 7 Perfil farmacológico de sinais de sódio evocadas e correntes de entrada. (A) cheio de SBFI CA1 piramidal neurônio com o patch pipeta (PP) ligado à soma (B) À esquerda:. Transitória de sódio e atual somática induzida por foto-ativação de glutamato enjaulado em um dendrito e espinhos anexados Center:. Perfusão com o Os bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos CNQX e APV inibe tanto o sinal de sódio e a corrente de influxo induzido por uncaging direita:. Ao wash-out dos bloqueadores, os sinais são restaurados. Os represen linha vermelhats um ajuste dos dados experimentais. A área cinza representa o período em que o flash uncaging (300 ms) obstruiu a imagem de SBFI fluorescência. favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.

Discussion

O presente estudo mostra que SBFI é bem adequado para dois fótons de imagem de transientes de cálcio intracelular em pequenos compartimentos celulares. Tem que se ter em mente, porém, que a eficiência quântica de SBFI é bastante baixo em 15 e relativos alterações na concentração de sódio são muito pequenas com atividade fisiológica. Assim, a medição de alta resolução de transientes de Na + em processos distintos é uma tarefa relativamente tedioso, e criação de faixas ou a média de vários ensaios, pode ser necessário para obter sinais satisfatórios. Além disso, a cinética de transientes de sódio são surpreendentemente lenta, tornando obrigatória a gravar por períodos de tempo prolongados. Esta observação corresponde àqueles em estudos anteriores, onde decaimento monoexponencial de transientes de sódio em dendrites neuronais e em astrócitos foi caracterizado por grandes constantes de tempo de decaimento no intervalo de 10 segundos à temperatura ambiente, 1,2,6. Transientes de sódio, portanto, parecem exercer uma vez co muito mais lentourse e muito maiores constantes de tempo de decaimento, em comparação com transientes de cálcio 16.

Separe essas desvantagens, a imagiologia de sódio revela-se uma ferramenta valiosa para a investigação das propriedades fisiológicas de subdomínios neuronais. Por exemplo, a imagiologia de sódio pode servir para acompanhar a actividade sináptica excitatória no ou perto de sinapses activas. Porque não é essencialmente sódio tamponada 8,17, transientes sódio induzido da actividade são linearmente relacionado com uma vasta gama de libertação sináptica de glutamato aplicado exogenamente ou glutamato. Eles, portanto, representam indicadores diretos e imparciais sobre a atividade glutamatérgica neuronal. Além disso, os corantes indicadoras de sódio apresentam uma elevada K d 's (da SBFI K d está na gama de 25 a 1 mM). Mesmo com as concentrações relativamente elevadas de corante intracelulares utilizados para atingir o brilho suficiente (geralmente 0,5-1 mM), a alta K d 's significa que os próprios corantes não actuar como tampões para sódio. Por conseguinte, eles não se distorcem o campo de amplitude nem o tempo de transientes de sódio, o que é sempre uma preocupação quando corantes sensíveis ao cálcio são introduzidos nas células 18. Assim, pode-se presumir que os sinais detectados representam uma boa medida das mudanças "reais" em sódio intracelular. Seu curso lento tempo implica, então, que a velocidade de difusão intracelular de sódio nos neurônios é muito menor do que anteriormente se pensava 19.

Um requisito essencial para a execução bem sucedida de experimentos que abordam as propriedades excitatórias transmissão e influxo de sódio vias sinápticas em espinhas e dendritos é a indução de uma ativação rápida e altamente localizada de estruturas pós-sinápticos. Isto pode ser obtido por aplicação rápida e local de glutamato ou agonistas de glutamato na vizinhança directa de uma coluna ou um dendrito pelo fotólise de compostos em gaiolas. Flash fotólise faz dama não mecanicamentege o tecido, é livre de artefatos de movimento e está bem estabelecido para a investigação de questões relacionadas (por exemplo, a sinalização local de cálcio). O diâmetro da mancha de 1,5 um foi uncaging no plano xy. Uncaging perto de um sinal de sódio espinhoso dendrito induzida em ambas as espinhas e a dendrite pai. Considerando que os sinais tendem a ser maior nas espinhas mais próximas ao local uncaging, as amplitudes do dendrito pai e espinhas mais longe ainda eram bastante semelhantes aos imediações do local uncaging. Uncaging foi realizada durante 300 mseg, durante o qual as correntes internas aumento na amplitude. Glutamato Uncaged poderia ter difundido no tecido durante o mesmo período de tempo, ativando os receptores de glutamato ionotrópicos e influxo de sódio em regiões dendríticas e espinhas mais longe do local uncaging.

Um problema intrínseco que ocorre quando se utiliza um laser de UV para a fotólise de compostos engaiolados administradas através da solução do banho de célulasé "filtragem interior". Devido à elevada taxa de absorção da gaiola, a luz UV é atenuada fortemente ao longo do caminho do objectivo para o local de estimulação 20,21. Uma maneira possível de evitar isso é a perfusão local com a gaiola que está restrito apenas ao sítio de estimulação, o qual, além disso, diminui a quantidade de composto necessária para enjaulado um mínimo. Em comparação com uncaging UV a laser de varredura-mediada, quase-infra-vermelho de dois fotões uncaging 22 é espacialmente mais precisa, principalmente porque a exactidão da estimulação é aumentada no eixo z. Por outro lado, devido à pequena secção transversal de gaiolas vulgarmente utilizados para os comprimentos de onda mais longos, como empregues com excitação de dois fotões, ou uma elevada concentração do composto em gaiolas ou muito elevada, são necessárias intensidades de luz potencialmente fototóxicos. Além disso, dois fótons uncaging exige um investimento muito maior no equipamento; entre outros, um laser de IR adicional além dos componentes ópticos, é necessário,.

Ambos SBFI e MNI-glutamato são excitáveis ​​na faixa de comprimento de onda idênticas. Isto pode levar a uma indesejada interdependência de laser de UV e uncaging SBFI ou laser imagem IR e MNI-glutamato, o que resulta no branqueamento de SBFI pelo flash uncaging e / ou um uncaging contínua de glutamato por o feixe de luz infravermelha. No entanto, como mostrado na Figura 6C, nem um flash UV, por si só, nem a imagem de vários fótons causado tais efeitos recíprocos, nas condições experimentais.

Sistemas de flash de UV semelhantes ao descrito aqui são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios e outros podem ser relativamente facilmente incorporado em qualquer microscópio de imagem multi-fotão existente. Ele oferece a vantagem de que o feixe de laser para fotólise pode ser posicionado livremente no campo de visão. Além disso, o sistema permite um reposicionamento rápido e automático do feixe de laser e o volume de libertação, respectivamente, no campo de visão durante uma experiência. Our modificação simplifica e melhora o posicionamento preciso do local uncaging, de modo a que os quadros do software de imagem pode servir para ajustar quadros de imagem e uncaging congruentemente.

Tomados em conjunto, de células inteiras de patch-clamp e imagem multi-fotão de sódio em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging luz UV-induzido de glutamato, permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Pode, assim, servem para analisar as propriedades de transmissão sináptica excitatória e de sinais de sódio em neurónios pós-sinápticos no tecido intacto.

Disclosures

Os autores declaram não haver interesses conflitantes. Os autores receberam apoio financeiro permitindo Open Publication Acesso por Rapp optoeletrônicos (Wedel, Alemanha), que produz um instrumento usado no artigo de vídeo. A empresa não foi nem envolvidos nos experimentos, nem na manipulação de dados, nem na escrita manuscrita.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Alemã de Ciência (DFG, Ro2327 / 6-1) para CRR Os autores gostariam de agradecer a S. Durry e C. Rodrigo para assistência técnica especializada, e M. Dubbert (Laboratório de Eletrônica, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia, Alemanha) para obter ajuda na implementação do controlador de célula Pockels eo interruptor HF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate-glass capillaries Hilgenberg 1405059 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Camera Jenoptik ProgRes MF IR-DIC compatible camera
Deconvolution software SVI Huygens Pofessional X11
Fiber optic spectrometer Ocean Optics USB 4000 Miniature fiber optic spectrometer
Filter tubes VWR cenrifugal filter, 0.2 µm
Imaging software Olympus Europe Flowview Ver 5.0c, Tiempo
IR beam power controller Custom built Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell
IR laser SpectraPhysics Mai-Tai fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION
IR power monitor Custom built
Micromanipulator Burleigh PCS 5000
Microscope/Imaging System Olympus Europe BX51WI/FV300 Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified
ND filter wheel Newport 50Q04AV.2 UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0
Objective Nikon Instruments Europe NIR Apo 60x/1.0w
Patch clamp amplifier HEKA EPC-10
Pipette puller Narishige Model PP-830
Pneumatic drug ejection system NPI Electronic PDES-DXH
Pockels cell Conoptics 350-80 LA-BK EOM, used as fast switch and for power adjustment
Pockels cell driver Conoptics M302-RM High voltage differential amplifier
Shutter Vincent Associates LS6ZM2 ALMgF2-coated BeCu blades
Shutter controller Custom built
Shutter driver Vincent Associates Uniblitz VCM D1
Slicer/Vibratome Thermo Scientific Microm HM 650 V
Uncaging software Rapp OptoElectronic UGA40 1.1.2.6 + NetCam
UV laser Rapp OptoElectronic DL-355/10 cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION
UV laser scanning system Rapp OptoElectronic UGA 40 Galvanometric scanning system
Name of Compound Company Catalog Number Comments/
Description
CNQX Sigma Aldrich C-127 AMPA receptor antagonist; CAUTION
DL-AP5 Alfa Aesar J64210 NMDA receptor antagonist; CAUTION
SBFI K+ salt Teflabs OO32
TTX Ascent Scientific Asc-055 Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION
NMI-caged-L-Glutamate Torcis 1490 Caged glutamate released upon UV absobtion

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References

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Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. J. Vis. Exp. (92), e52038, doi:10.3791/52038 (2014).

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