Summary
우리는 고해상도 현미경 운모지지 지질 이중층을 제조하는 방법을 제시한다. 운모는 원자 규모에서 투명하고 평면이지만, 거의 때문에 어려움을 처리하는 영상에서 사용되지; 우리의 준비는 운모 시트도 증착 결과 및 이중층의 제조에 사용되는 물질을 감소시킨다.
Abstract
지원되는 지질 이중층 (SLB 수)가 널리 막 특성 (상 분리, 클러스터링, 역학)과 같은 약물이나 펩티드 등의 다른 화합물과의 상호 작용을 연구하기위한 모델로 사용된다. 그러나 SLB 특성 사용 지원에 따라 다르다.
SLB 이미징 및 측정에 일반적으로 사용되는 기술들은 단일 분자 형광 현미경, FCS 및 원자 힘 현미경 (AFM)이다. AFM은 매우 평탄한 표면 (일반적으로 운모)를 필요로하는 동안 대부분의 광학 이미징 연구가 유리 지지체 상에 실시되기 때문에 이들 재료의 충전 및 평활성 속성 강하게 확산 영향 때문에, 이러한 기술의 결과는, 직접 비교 될 수 없다. 불행하게도, 유리 슬라이드에 절단 및 운모의 얇은 조각을 접착제로 붙이기에 필요한 손재주의 높은 수준의 SLB 준비를위한 운모의 일상적인 사용에 장애물을 선물한다. 이 선택의 방법, 이러한 준비 운모 것입니다 있지만표면은 종종 특히 작은 작동 거리, 높은 수치 조리개 렌즈로, 요철 (물결 모양) 및 이미지에 어려운 끝나게. 여기에서 우리는 지질 소포 증착 및 SLB의 제조에 대해 얇고 편평한 운모 표면을 제조하기위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제시한다. 또한, 우리의 사용자 정의 만든 챔버는 SLB 형성 소포 만 아주 작은 볼륨을 필요로합니다. AFM 연구에서 사용 된 것과 직접 필적 고품질 지질 이중층 표면의 효율적인 간단하고 저렴한 생산 전체적인 절차 결과.
Introduction
본 프로토콜의 전반적인 목표는 원자 힘과 결합 될 수있는 광학 전반사 형광 현미경 (TIRFM) 또는 공 초점 현미경을 이용한 운모지지 지질 이중층 (SLB 수)의 고해상도 영상화 운모 표면의 제조 방법을 도시하는 것이다 현미경 (AFM).
유동화 증권 지질 클러스터링, 상 분리, 펩티드, 단백질 또는 다른 화합물 1-5 이중층 구성 요소 또는 상호 작용의 역학의 수많은 연구를위한 널리 사용되는 모델입니다. 다른 기판은 SLB 형성 연구 4,6-8의 특성에 따라 (즉, 유리, 운모, 이산화 규소, 중합체)에 사용될 수있다. 분리막 연구는 TIRFM 및 AFM 같은 현미경을 기반 영상 기술에 의존하고 있습니다. 유리는 투명하기 때문에 이에 TIRFM 이미징, 유리 표면은 일반적인 선택이다. 유리의 제조가 비교적 용이하고, 결과의 품질은 주로이전에 지질 소포의 증착 청소 철저한 표면에 의해 결정된다. 높은 축 방향의 해상도에 의한 AFM은 운모 표면을 필요로한다. 운모는 완벽한 기초 분열 부근으로, 규산염 광물이다. 따라서, 갓 절단 운모 심지어 서브 - 나노 미터 스케일 (9)에 막 고저차의 관찰을 허용, 원자 적으로 평면이다.
이러한 형광 상관 분광법 (FCS), 추적 단일 분자 (SMT) 및 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구와 같은 방법을 사용하여 확산 연구는 지질 막 역학들이 퇴적되는에 표면의 유형, 이에 유리에 크게 의존하지만 보여 주었다 운모는 매우 다양한 결과 10, 11를 줄 수 있습니다. 이러한 차이는 멤브레인 프로브의 확산 계수뿐만 아니라, 서로 다른 속도로 확산 입자의 분리 된 집단의 검출 및 가능한 다른 상태 사이의 전환뿐만 있습니다.
따라서,동일한 표면 (이 경우 운모에) 사용되지 않는 TIRFM 및 AFM 기술을 사용하여 얻어진 결과의 직접적인 비교가 종종 문제가된다. TIRFM 및 AFM 이중층 이미징이 같은 운모 표면 (12, 13)에 실시 된 일부 연구가 있지만, 운모는 거의 대부분 때문에 처리 문제, 광학 현미경에 사용되지 않습니다. 운모 준비는 광학 접착제 (12)를 사용하여 커버 슬립에 붙어있다 얇은 전단지,에 손으로 절단을 필요로한다. 그러나이 방법은 만족스러운 결과를 달성하기 위해 연습이 필요합니다. 더욱이, 얻어진 표면은 그들 어려운 낮은 작동 거리, 높은 개구 수 렌즈를 사용할 수 있도록, 흔히 물결 두껍다.
이 프로토콜에 기술 된 바와 같이 제조 된 운모의 표면은 매우 얇은 (170 μM의 coverslip에 두께를 포함하여 ~ 220 μm의) 매우 평면, 성공 고해상도 이미징을위한 중요하다 "파상"를 피하는. 그들은 사용될 수있다TIRFM 또는 공 촛점 설정하십시오. 또한, 동일한 시료를 AFM에 전달 될 수 있고, 심지어 TIRFM / 촛점과 AFM과 동시에 이미지화. 이러한 두 가지 기술을 결합하면 이중층 막 구조물 (14)과 확산 거동의 직접적인 상관 관계를 허용한다. 운모 표면이 갓 절단되어 있기 때문에, 그들은 깨끗하고 (유리 청소 프로토콜은 일반적으로 같은 피라니아 솔루션, 황산, 나트륨 / 수산화 칼륨 등 화학 물질을 포함한다) 시간이 많이, 제대로 재현하고, 잠재적으로 위험한 청소 절차가 필요하지 않습니다. 또한이 프로토콜에 설명 작은 챔버의 설치, 50 미만 μL에 효과적인 이중층의 형성에 필요한 소포의 양을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 표면 어셈블리의 전체 프로세스는 시간 소모적 종래의 운모 벽개 및 부착을 마찬가지로, (제조 미만 30 분 소요), 및 서, 고도의 기술을 필요로하지 않는 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 운모 및 슬라이드 준비
- 장소 번호 1 ½ (0.17 mm)는 염색 랙에 커버 슬립.
- 60 ° C에서 2 % 세제에 30 분 동안 초음파 처리
- 탈 이온수로 20 회 반복한다.
- 집게를 사용하여 슬라이드를 제거하고 압축 공기 또는 질소를 사용하여 건조한다.
- 운모 시트를 가위 또는 면도날을 사용하여 10 × 10mm 사각형 조각으로 잘라.
- 면도날을 사용하여 2 ~ 3 얇은 전단지에 각 운모 조각을 잘라.
참고 :이 단계는 날카로운 칼날의 사용을 필요로합니다.
2. 운모 조립 및 장착 상공 회의소
- 에탄올로 청소 현미경 유리 슬라이드.
- 광학 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 단계 1.6 절단 운모의 접착제 전단지. 낮은 점도의 접착제가 더 강하를 확산하고 운모를 접착하는 것이 좋습니다.
- , UV 램프에서 10 분을 치료.
NOTE : 접착제는 350 ~ 380 ㎚의 범위에서 최대 흡수 및 requ의 추천 에너지로 UV 광에 의해 경화된다전체 치료를위한 IRED 4.5 J / ㎠이다. 그러나, 다른 광원 (접착제 공급 업체에서 제공하는 자료를 참조)이 단계를 사용할 수 있습니다. - 스카치 테이프로 처음 몇 층을 제거하여 깨끗한 운모 표면을 노출.
- 운모 표면에 광학 접착제의 작은 방울 (~ 20 μm의)를 배치합니다.
참고 :이 단계에서, 낮은 형광도 수준 높은 점성 접착제를 권장합니다. 우리의 경험은 낮은 (2.2 단계) 고점도 접착제의 조합을 사용하는 운모 분할 상당히 효과 (단계 2.7)을 증가 시킨다는 것을 보여 주었다. - 조심스럽게 기포를 방지, 접착제의 하락에 갓 청소 커버 슬립을 배치, 1 분에 정착 할 수 있습니다.
- , UV 램프에서 10 분을 치료.
NOTE :이 단계 후에, 유리 슬라이드, 운모 및 커버 슬립의 샌드위치 (몇 주까지) 시간의 비교적 긴 기간 동안 저장 될 수있다. 운모 표면이 신선한 확인하기 위해, 단지 실제 SLB 준비하기 전에 다음 단계로 진행합니다.
참고: 접착제가 380 ㎚ ~ 350의 범위에서 최대 흡수와 완전 경화에 필요한 에너지를 추천 UV 광에 의해 경화된다 4.5J/cm는 2이다. 그러나, 다른 광원 (접착제 공급 업체에서 제공하는 자료를 참조)이 단계를 사용할 수 있습니다. - 비디오 같이 exacto 칼을 사용하여 부드럽게 측 유리 슬라이드에서 커버 슬립을 분리. 대부분의 경우에, 운모의 얇고 편평한 층은 커버 슬립에 연결된 상태로 유지된다. (단계 2.4에서 반복) 재사용 할 수 운모 유리 슬라이드에 부착.
- 운모 층이 여전히 커버 슬립에 접착되는 단계 2.8 분할시 완전히 제거되지 않았 음을 확인하기 위해, 육안으로 또는 해부 현미경으로 표면 품질을 확인합니다. 집게에 작은 상처를 만들거나 바늘을 해부하는 것은 운모에서 검출 가능하게 다른 일관성이있는 접착제를 구별하는 데 도움이 될 것입니다.
- 1.5 ㎖의 유리 병 뚜껑의 고무 패킹을 제거하고 광을 사용하여 표면에 거꾸로 뚜껑을 접착제접착제 또는 매니큐어 및 UV 램프를 치료, 또는 공기는 각각 10 분을 건조 할 수 있습니다.
참고 : 샘플 AFM 이미징과 동시에 광 (TIRFM 또는 공 초점)을 준비하는 경우, 1.5 ㎖의 유리 병 뚜껑을 현미경 무대에 AFM 헤드 마운트 너무 작은 수 있습니다. 그 경우, 캡 AFM 헤드 장착에 적합한 큰 직경을 갖는 임의의 플라스틱 O-링에 의해 치환 될 수있다. 실험 운모 표면을 손상시키지 않고, 캡을 제거 요구의 경우, 실리콘 그리스 대신 접착제 또는 매니큐어 사용될 수있다.
3. 지원되는 지질 이중층 (SLB) 형성
- 면에 실에 새로 제조 된 리포좀 솔루션을 놓습니다. SLB 형성에 필요한 최소 볼륨 ~ 30 μL입니다.
참고 : 리포좀 및 SLB 형성에 대한 자세한 내용은, 예컨대 가방 등 한 출판 프로토콜을 참조 2014 년 15.. - 원하는 프로토콜을 사용하여 SLB 형성을 진행합니다. 부화 중이미징, 챔버는 열 블록 또는 용융 온도 이상으로 사용되는 지질을 유지하는 데 필요한 온도를 유지하기 위해 가열 현미경 단에 배치 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SLB 수있는 지질 형광 프로브의 확산 동작은 기판에 따라 다르다. SMT 기술과 결합 된 TIRFM는 입자의 움직임을 시각화하고 그들의 확산 계수를 추출하기위한 중요한 방법이다. DOPC 유리와 운모 지원 (1,2 - dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린) 이중층에 확산 핑고 마이 엘린 - ATTO647N 프로브의 단일 분자 신호는 첨부 된 애니메이션 그림에 표시됩니다. 운모 표면은 여기에 제시된 프로토콜에 따라 제조 하였다. 광학 수차를 추정하기 위해, 반 최대 (FWHM)의 전체 폭을 측정하고 16, 17 플러그인 모자이크 2D PSF 크기 ImageJ에를 사용하여 20 점 확산 함수 (PSF)에 대해 평균 하였다. 유리와 운모의 측정 FWHM은 각각 441nm와 464nm (그림 1)이었다. 유리와 운모에 영상과 해상도의 22 나노의 차이는 중요하지 않습니다. 두 경우 모두, 각각의 단일 형광 분자의 PSF의 중심은 로카 수연속적인 프레임에 lized 및 모자이크 입자 추적기 ImageJ에는 16, 17 플러그인과 함께 시간이 지남에 따라 입자의 궤적에 링크. 2 양면에 지원하는 이중층에 걸쳐 확산 입자의 샘플 궤적을 보여줍니다. 유리와 운모 지원 DOPC 막에 확산 형광 프로브의 평균 제곱 변위 (MSDS는) 그림 3에 그려졌다. 두 집단의 모델이 빠르고 느린 확산 계수를 추출하는 데 사용 된 여러 집단의 공존으로 인해, 방법에 따라 기술 슈츠 (그림 4, 그림 5) (18)에 의해. 확산 계수와 그들의 분획 TrackArt 소프트웨어 (19)를 사용하여 추출하고, 표 1에 요약되어있다.
빠르고 느린이 예제의 결과는 확산 프로브의 두 개의 분리 된 상태의 존재를 증명한다. 빠른 인구의 확산 계수는 약 10.5 배 높은 운모 유리보다. 그러나 느린 구성 요소는, 운모 만 ~ 1 / 10 빠른 인구의 D에 비해 (<0.01 μm의 2 / 초) 유리에 거의 움직입니다.
그림 1. 평균 PSF의 크기입니다. 유리 (검은 색 실선)와 운모 (빨간 점선)에서 측정 한 20 지점의 평균 PSF 강도 프로파일. 유리 및 운모 대한 정규화 휘도의 최대 값의 절반 (FWHM)에서 전체 폭은 각각 441 ㎚, 464 nm의 것으로 추정되었다. 22 나노의 차이는이 두 표면 사이의 영상 해상도에 큰 하락이없는 것을 나타냅니다. PSF 강도 프로파일이 모자이크 PSF 2D 도구 ImageJ에 플러그인 (16, 17)를 사용하여 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 샘플 궤적. 유리 (A)와 운모 (B)에서 지원 DOPC의 지질 이중층에 확산 SM-ATTO647N의 샘플 궤적. 유리 지원 이중층에서, 프로브는 종종 때때로 빠른 확산 상태로 전환 표면에 고정된다. 운모 지원 이중층에 확산 프로브는 대조적으로, 거의 표면에 고정되지 않는다. 대신, 그들은 빠르고 느린 확산 상태 사이를 전환하는 경향이 것은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 광장 변위를 의미한다. 광장 변위 평균 에 확산 SM-ATTO647N 입자의 사항 유리 (■) 및 운모 (●)이 DOPC 이중층을 지원했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 누적 확률 분포는. 광장 변위의 누적 확률 분포 (CPD)에 맞는 유리 (A)에 확산 SM-ATTO647N 입자의 양 지수 (두 인구) 확산 모델에 맞는 운모 (B) 지원 DOPC 이중층. 배포 및 적합는 다섯 번째 시간 지연 (Δ의 t = 50 밀리 초)을 위해 제공된다. 계산 및 플롯 TrackArt 19 소프트웨어를 사용하여 얻을 수있다.야윈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
빠른 (R 1) 천천히 (R 2) 확산에 대한 그림 5. MSD와 분수 플롯. MSD 플롯 인구와 CPD에 맞는 계산 빠른 인구 (F 1)의 비율. 결과는 유리 (A)에 확산 SM-ATTO647N 입자에 대해 개별적으로 제시하고 운모 (B)는 DOPC 이중층을 지원합니다. 계산 및 플롯이 TrackArt 19 소프트웨어를 사용하여 얻을 수 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 인구 1 (빠른) | 인구 2 (저속) | |||||||
| D 1 (μm의 2 / 초) | 분획 (%) | D 2 (μm의 2 / 초) | 분획 (%) | |||||
| 유리 | 1.840 ± 0.031 | 65.19 ± 0.56 | 0.006 ± 0.001 | 34.81 ± 0.56 | ||||
| 운모 | 53.88 ± 0.26 | 0.176 ± 0.002 | 46.12 ± 0.26 | |||||
확산 통계의 표 1. 확산 계수. 요약. 느리고 빠른 인구와 그 분획물에 대한 확산 계수. 계산은이 인구 모델을 사용 TrackArt 소프트웨어에서 수행되었다. 궤적 인식 및 모자이크 입자 추적기 ImageJ에 플러그인을 사용하여 연결되어 있었다.
애니메이션 그림 :. 유리 (왼쪽)와 운모 (오른쪽)에서 지원 DOPC 이중층에 확산 핑고 미엘린 - ATTO647N의 단일 분자 확산 인터벌 TIRFM 영화. 스케일 바는 5 μm의 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 지질 이중층 증착 및 고해상 이미징 부드럽고 얇은 운모 표면의 제조 방법을 설명한다. 기술은 주로 고품질 운모 표면을 얻기위한 중요한 유리 운모 - 유리 샌드위치 (단계 2.8)의 세세한 제외에 한정되는 최소한의 수동 기술을 필요로한다. 운모는 클 리빙없이 광학 접착제에서 분리하는 것이 가능하기 때문에 갓 절단 운모의 검사는 항상 광학 접착제의 노출 된 영역을 남기고,이 시점에서 필요하다. 즉, 접착제 대신에 운모의 이중층의 원치 않는 증착 될 수 있습니다. 운모 표면은 몇 가지 예외가 우리가 얻어진 균일하게 높은 광학 이미징 품질로 볼때, 커버 슬립의 표면에 평행하여 기재 한 방법은 사용하여 제조; 따라서 우리는 추가 검증을위한 필요성을하지 않았다.
챔버 설치의 마지막 단계는 사용자 정의 할 수 있습니다. 비디오 튜토리얼을 보여줍니다챔버로 사용되는 1.5 ㎖의 유리 병 플라스틱 캡은, 그러나이 유사한 모양의 개체를 원하는 크기로 대체 할 수있다 홀더와 샘플 AFM 헤드에 맞게하는 동시에 AFM-TIRFM/confocal 이미징, 예 : . 이미징 표준 35mm 금속 셀 챔버를 사용하여 수행 될 경우에 사용자 지정 챔버의 설치는 생략 할 수있다. 이 경우에는 그러나, 25mm 라운드 커버 유리가 사용될 수 있으며 리포좀 용액의 훨씬 더 큰 체적은 SLB 형성을 위해 요구된다.
여기에 제시된 결과는 단일 분자 이미징 및 추적이 용이 한 표면의 준비를위한 프로토콜에 따라, TIRFM 영상 의무가있을 정도로 얇은 매우 평면 운모 표면에서 수행 할 수 있음을 보여준다. 동일한 제제는 내부 전반사 형광 상관 분광법 (TIR-FCS)와 같은 고해상도 광학 현미경을 포함하는 다른 기술에 적용될 수있다. 중요한 것은, SLB 수 준비ARED 같은 방법으로 (또는 동일한 샘플)에 다른 방법, 예를 들어, AFM, SMT, FCS, 및 FRAP를 사용하여 얻은 결과의 직접적인 비교를위한 필수 조건, 모두 실험 설정에서 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 아직 승인이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al.
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P.
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
