Summary
Vi presentiamo un metodo di preparazione mica supportato doppi strati lipidici per microscopia ad alta risoluzione. Mica è trasparente e piatto su scala atomica, ma raramente usata nell'imaging a causa della difficoltà di manipolazione; nostra preparazione comporta anche deposizione del foglio di mica, e riduce il materiale utilizzato nella preparazione bistrato.
Abstract
Doppi strati lipidici supportati (SLB) sono ampiamente usati come modello per lo studio delle proprietà di membrana (separazione di fase, di clustering, dinamica) e la sua interazione con altri composti, come i farmaci o peptidi. Tuttavia caratteristiche SLB variano a seconda del supporto utilizzato.
Tecniche utilizzate comunemente per SLB l'imaging e le misure sono single microscopia a fluorescenza molecola, FCS e microscopia a forza atomica (AFM). Poiché la maggior parte degli studi di imaging ottico sono effettuate su un supporto di vetro, mentre AFM richiede una superficie estremamente piatta (generalmente mica), i risultati di queste tecniche non sono direttamente confrontabili, in quanto le proprietà di carica e di funzionamento di questi materiali influenzano fortemente diffusione. Purtroppo, l'alto livello di destrezza manuale richiesto per il taglio e incollaggio fette sottili di mica al vetrino presenta un ostacolo di utilizzare sistematicamente mica per la preparazione SLB. Sebbene questo sarebbe il metodo di scelta, come mica preparatosuperfici spesso finiscono per essere irregolare (ondulato) e difficile da immagine, soprattutto con la piccola distanza di lavoro, alti lenti apertura numerica. Qui vi presentiamo un metodo semplice e riproducibile per la preparazione di sottili superfici piane mica per la deposizione lipidica delle vescicole e preparazione SLB. Inoltre, la nostra camera di misura richiede solo piccole quantità di vescicole per la formazione SLB. I risultati procedura generale nella produzione efficiente, semplice ed economico di superfici doppio strato lipidico alta qualità che sono direttamente paragonabili a quelli utilizzati negli studi AFM.
Introduction
L'obiettivo generale del presente protocollo è quello di mostrare un metodo per preparare le superfici mica per imaging ad alta risoluzione di mica sostenuta lipidi bistrati (SLB) utilizzando la microscopia ottica riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM) o la microscopia confocale, che potrebbe anche essere combinato con forza atomica Microscopy (AFM).
SLB sono un modello ampiamente utilizzato per numerosi studi di raggruppamento lipidi, separazione di fase, la dinamica di componenti a doppio strato o loro interazioni con peptidi, proteine o altri composti 1-5. Substrati differenti potrebbero essere utilizzati per la formazione SLB (cioè vetro, mica, biossido di silicio, polimeri) a seconda della natura dello studio 4,6-8. Gli studi di membrana tipiche si basano su tecniche di imaging basata microscopia-, come TIRFM e AFM. Così, per l'imaging TIRFM, una superficie di vetro è una tipica scelta perché il vetro è trasparente. Preparazione del vetro è relativamente facile, e la qualità dei risultati è principalmentedeterminato dalla accurata pulizia prima della deposizione delle vescicole lipidiche superficie. AFM grazie alla sua elevata risoluzione assiale richiede superfici di mica. Mica è un minerale silicato, con quasi perfetta scissione basale. Così, la mica appena spaccati è atomicamente piatta, che permette l'osservazione di membrana dislivelli anche a scala sub-nanometrica 9.
Studi di diffusione con metodi quali la spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS), singola molecola di inseguimento (SMT), e recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) hanno mostrato tuttavia che la dinamica della membrana lipidica dipende fortemente dal tipo di superficie su cui sono depositati, per cui vetro e mica può dare risultati ampiamente variabili 10,11. Queste differenze sono non solo i coefficienti di diffusione delle sonde di membrana, ma anche l'individuazione di popolazioni separate di particelle diffondenti con tassi differenti, e possibilmente la commutazione tra i diversi stati.
Così,il confronto diretto dei risultati ottenuti utilizzando tecniche TIRFM e AFM è spesso problematico, a meno che la stessa superficie (in questo caso mica) viene utilizzato. Anche se ci sono alcuni studi in cui TIRFM e imaging AFM doppio strato è stata condotta sulla stessa superficie mica 12,13, mica è usato raramente per la microscopia ottica, soprattutto a causa di problemi di gestione. Preparazione Mica richiede il taglio a mano in foglioline sottili, che sono incollati ad coprioggetto con adesivo ottico 12. Questo metodo richiede tuttavia una certa pratica per ottenere risultati soddisfacenti. Inoltre, le superfici ottenute sono spesso ondulati e di spessore, che li rende difficili da utilizzare con bassa distanza di lavoro, alti lenti apertura numerica.
Mica superfici preparate come descritto in questo protocollo sono molto sottili (~ 220 micron, compreso lo spessore vetrino di 170 micron) ed estremamente piatta, evitando di "ondulazione", che è fondamentale per il successo di imaging ad alta risoluzione. Possono essere utilizzatiper TIRFM o confocale configurazioni. Inoltre, gli stessi campioni possono essere trasferiti AFM, e anche ripreso contemporaneamente TIRFM / confocale e AFM. La combinazione di queste due tecniche consente di correlazione diretta del comportamento diffusione con struttura a membrana a doppio strato 14. Poiché le superfici mica sono appena spaccati, sono pulite e non richiedono molto tempo, scarsamente riproducibile, e le procedure di pulizia potenzialmente pericolosi (protocolli di pulizia di vetro di solito includono sostanze chimiche come soluzione Piranha, acido solforico, idrossido di sodio / potassio). Montaggio di una piccola camera, anche descritto nel protocollo, riduce il volume di vescicole necessari per la formazione bistrato efficace e meno di 50 microlitri. Infine, l'intero processo di assemblaggio superficie non è molto tempo (preparazione richiede meno di 30 minuti), e non richiede un elevato grado di abilità manuale, così come convenzionale scissione mica e incollaggio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mica e diapositive Preparazione
- Luogo No. 1 ½ (0,17 mm) coprioggetto in colorazione rack.
- Ultrasuoni per 30 min a 2% di detergente a 60 ° C.
- Lavare 20 volte con acqua deionizzata.
- Estrarre i vetrini con pinze e asciugare con aria compressa o azoto.
- Tagliare foglio di mica in 10 x 10 mm pezzi quadrati utilizzando forbici o lama di rasoio.
- Tagliare ogni pezzo mica in 2-3 foglioline sottili con lama di rasoio.
NOTA: Questa fase richiede l'uso di lama affilata.
2. Montaggio Mica e della Camera di montaggio
- Pulire vetrino microscopico con etanolo.
- Colla foglio di mica tagliati nel passaggio da 1,6 a vetrino con adesivo ottico. Adesivo a bassa viscosità si consiglia di diffondere meglio la goccia e incollare la mica.
- Cure sotto la lampada UV, 10 min.
NOTA: Adhesive è curata da luce UV con massimo di assorbimento nell'intervallo di 350 a 380 nm e l'energia raccomandato required per la piena guarigione è di 4,5 J / cm 2. Tuttavia, diverse fonti di luce possono essere utilizzati per questo passo (vedi materiali forniti dal fornitore adesivo). - Esporre una superficie di mica pulito rimuovendo i primi strati con nastro adesivo.
- Mettere piccola goccia (~ 20 micron) di adesivo ottico sulla superficie di mica.
NOTA: In questo passaggio, si consiglia l'adesivo ad alta viscosità con un basso livello di autofluorescenza. La nostra esperienza ha dimostrato che l'utilizzo di combinazione di basso (punto 2.2) e adesivi ad alta viscosità aumenta in modo significativo l'efficacia di mica splitting (fase 2.7). - Posizionare delicatamente coprioggetto appena pulita sulla goccia di colla, evitando bolle d'aria, lasciare riposare per 1 min.
- Cure sotto la lampada UV, 10 min.
NOTA: dopo questa fase, il sandwich di vetrino, mica e coprioggetto può essere conservato per un periodo relativamente lungo di tempo (fino a poche settimane). Procedere alla fase successiva appena prima l'attuale preparazione SLB, per assicurarsi che la superficie di mica è fresco.
NOTA: Adesivo è curata da luce UV con il massimo assorbimento nel range di 350 a 380nm e l'energia consigliata necessario per la piena guarigione è 4.5J/cm 2. Tuttavia, diverse fonti di luce possono essere utilizzati per questo passo (vedi materiali forniti dal fornitore adesivo). - Utilizzando un taglierino, smontare delicatamente il vetrino dal vetrino lato, come mostrato nel video. Nella maggior parte dei casi, uno strato sottile e piatto di mica rimarrà attaccato alla coprioggetto. Mica attaccato al vetrino può essere riutilizzato (ripetere dal punto 2.4).
- Controllare la qualità della superficie a occhio nudo o sotto un microscopio da dissezione, per assicurarsi che strato mica è ancora incollato al coprioggetto e non è stato rimosso completamente durante la divisione nel passaggio 2.8. Fare un piccolo graffio con una pinza o dissezione ago aiuterà a distinguere tra l'adesivo che ha una consistenza diversa da rivelabile mica.
- Rimuovere la guarnizione di gomma da un ml flacone tappo 1.5 e incollare il tappo a testa in giù alla superficie con otticaadesivo o smalto, e la cura con la lampada UV, o lasciare asciugare 10 minuti, rispettivamente.
NOTA: Se il campione è pronto per simultanea ottico (TIRFM o confocale) con imaging AFM, un ml flacone tappo 1.5 potrebbe essere troppo piccolo per montare la testa AFM sul palco microscopio. In tal caso, il tappo può essere sostituito con qualsiasi plastica O-ring con un diametro più grande, adatto per il montaggio testa AFM. Nel caso in cui l'esperimento richiede la rimozione del tappo senza danneggiare la superficie di mica, grasso al silicone può essere usata al posto della colla o smalto.
3. Supportato doppio strato lipidico (SLB) Formazione
- Posizionare soluzione liposomi preparata nella camera con la superficie. Il volume minimo richiesto per la formazione SLB è ~ 30 ml.
NOTA: Per maggiori dettagli sulla liposomi e la formazione SLB, fare riferimento a protocolli pubblicati, come ad esempio il sacchetto et al, 2014 15.. - Procedere con la formazione SLB utilizzando il protocollo desiderato. Durante l'incubazione el'imaging, la camera può essere collocato in un calore-blocco o fase di microscopio riscaldata per mantenere la temperatura necessaria per mantenere i lipidi in uso sopra della loro temperatura di fusione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il comportamento diffusione di sonde fluorescenti lipidici in SLB è diverso a seconda del substrato. TIRFM combinata con la tecnica SMT è un metodo utile per la visualizzazione movimenti di particelle ed estraendo i loro coefficienti di diffusione. Segnali singola molecola di una sonda sfingomielina-ATTO647N diffusione in un DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina) doppio strato supportato su vetro e mica sono mostrate nella figura animata allegata. La superficie mica è stato preparato secondo il protocollo presentato qui. Per stimare aberrazioni ottiche, tutta la larghezza a metà altezza (FWHM) è stata misurata e media sulla funzione di 20 punti spread (PSF) usando Mosaico 2D PSF Dimensione ImageJ plug 16,17. La FWHM misurata per vetro e mica erano 441nm e 464nm, rispettivamente (Figura 1). La differenza di 22 nm di risoluzione tra le immagini su vetro e mica non è significativo. In entrambi i casi, la PSF centroide di ogni singola molecola fluorescente può essere LOCAlizzati in quadri successivi, e collegato in traiettorie delle particelle nel tempo con Mosaic Particle Tracker ImageJ plug 16,17. Figura 2 mostra traiettorie campione di particelle diffondenti attraverso il doppio strato supportato su entrambe le superfici. Gli spostamenti quadratici medi (DMS) della sonda fluorescente diffondente in membrana DOPC supportato su vetro e mica è stata tracciata sulla Figura 3. Causa coesistenza di due popolazioni multiple popolazione modello è stato usato per estrarre i coefficienti di diffusione veloce e lento, secondo il metodo descritto da Schutz (Figura 4, Figura 5) 18. I coefficienti di diffusione e loro frazioni sono stati estratti utilizzando software TrackArt 19 e sono riassunti nella Tabella 1.
I risultati di questo esempio provano l'esistenza di due stati separati della sonda diffondente: veloce e lenta. Il coefficiente di diffusione della popolazione veloce è approssimativamente 1.5 Volte superiore a mica che sul vetro. Il componente lenta tuttavia, è quasi immobile su vetro (<0,01 micron 2 / sec), rispetto ad un solo ~ D di 1/10 della popolazione veloce su mica.
Figura 1. Dimensione media PSF. Profilo medio di intensità FPF per 20 punti misurati su vetro (linea continua nera) e mica (linea rossa tratteggiata). La larghezza a metà altezza (FWHM) dell'intensità normalizzata per vetro e mica è stato stimato a 441 nm e 464 nm, rispettivamente. La differenza a 22 nm indica che non vi è alcun calo significativo risoluzione di immagini tra queste due superfici. Profilo di intensità PSF è stata misurata utilizzando Mosaico PSF 2D strumento ImageJ plug 16,17. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Traiettorie di esempio. Traiettorie Esempi di SM-ATTO647N diffondenti in un bistrato lipidico DOPC supportato su vetro (A) e mica (B). Sul doppio strato di vetro supportato, la sonda è spesso immobilizzato sulla superficie, occasionalmente il passaggio allo stato veloce diffondente. Sonde diffondenti sulla mica supportato doppio strato, al contrario, sono raramente immobilizzati sulla superficie. Al contrario, essi tendono a passare tra lo stato di diffusione veloce e lento. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Media spostamenti quadrati. Media cilindrata piazza menti di particelle SM-ATTO647N diffondenti su un vetro-(■) e mica (●) ha sostenuto DOPC doppio strato. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Distribuzione di probabilità cumulativa adatta. Distribuzione di probabilità cumulativa (CPD) di spostamenti quadrati e adatta per il modello di diffusione bi-esponenziale (due popolazione) di particelle SM-ATTO647N diffondenti su vetro-(A) e mica (B) supportato bistrati DOPC. Distribuzioni e accoppiamenti sono presentati solo per la quinta volta-lag (Δ t = 50 msec). Calcoli e grafici sono ottenuti utilizzando il software TrackArt 19.lank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Trame Figura 5. MSD e trame frazione. MSD per il digiuno (r 1, 2) e lento (r 2 2) la diffusione della popolazione e frazione della popolazione in rapida (F 1) calcolato dal adatta CPD. I risultati sono presentati separatamente per le particelle SM-ATTO647N diffondenti su vetro-(A) e mica-(B) supportati bistrati DOPC. Calcoli e grafici sono stati ottenuti utilizzando il software TrackArt 19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Popolazione 1 (veloce) | Popolazione 2 (lento) | |||||||
| D 1 (micron 2 / sec) | Frazione (%) | D 2 (micron 2 / sec) | Frazione (%) | |||||
| Vetro | 1.840 ± 0.031 | 65.19 ± 0.56 | 0.006 ± 0.001 | 34.81 ± 0.56 | ||||
| Mica | 53.88 ± 0.26 | 0.176 ± 0.002 | 46.12 ± 0.26 | |||||
Tabella 1. Coefficienti di diffusione. Sommario delle statistiche di diffusione. Coefficienti di diffusione per le popolazioni lente e veloci e le loro frazioni. I calcoli sono stati eseguiti in software TrackArt utilizzando un modello a due popolazione. Traiettorie sono stati riconosciuti e collegati usando Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin.
Figura Animata :. molecole singole diffusione di film Timelapse TIRFM di sfingomielina-ATTO647N diffusione in un doppio strato DOPC supportato su vetro (a sinistra) e mica (a destra). Barra della scala è di 5 micron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per preparare superfici mica lisce e sottili per deposizione bistrato lipidico e imaging ad alta risoluzione. La tecnica richiede abilità manuale minimo, limitato soprattutto alla attenta smontaggio del sandwich vetro-mica-vetro (passo 2.8), che è essenziale per ottenere una superficie di mica alta qualità. Controllo della mica appena spaccati è sempre necessaria, a questo punto, poiché è possibile per la mica staccare dall'adesivo ottica senza fende, lasciando aree esposte adesivo ottico. Ciò potrebbe provocare deposizione indesiderato del doppio strato adesivo sulla anziché sul mica. La superficie mica redatto applicando il metodo descritto è, con poche eccezioni parallele alla superficie vetrino, a giudicare dalla qualità uniformemente elevata imaging ottico abbiamo ottenuto; abbiamo quindi non vede la necessità di ulteriori verifiche.
La fase finale di montaggio della camera può essere personalizzato. Il tutorial video mostra un1,5 ml tappo di plastica fiala di vetro utilizzato come camera, ma questo può essere sostituito con qualsiasi oggetto di forma simile e dimensioni desiderate, per esempio per l'imaging simultaneo AFM-TIRFM/confocal, dove il campione con il porta deve rientrare in testa AFM . Montaggio di una camera personalizzato può essere saltati, se l'imaging deve essere eseguito utilizzando uno standard, 35 millimetri camera a cella metallica. In questo caso però, un bicchiere coperchio tondo 25 millimetri deve essere utilizzato, e un volume molto più grande di soluzione di liposomi sarebbe necessaria per la formazione SLB.
I risultati qui presentati indicano che l'imaging singola molecola e di inseguimento possono essere facilmente eseguite su superfici perfettamente piane mica abbastanza sottile da essere suscettibili di immagini TIRFM, secondo il protocollo descritto per la preparazione della superficie. La stessa preparazione può essere applicato ad altre tecniche, tra cui la microscopia ottica ad alta risoluzione, come la spettroscopia di fluorescenza a riflessione interna totale correlazione (TIR-FCS). Importante, SLB prepared nello stesso modo (o anche le stesse identiche campioni) può essere utilizzato in entrambe le configurazioni sperimentali, un criterio essenziale per confronto diretto dei risultati ottenuti con diversi metodi, ad esempio AFM, SMT, FCS, e FRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al.
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P.
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
