Summary
We presenteren een werkwijze voor het bereiden mica ondersteunde lipide bilagen voor hoge resolutie microscopie. Mica is transparant en plat op atomaire schaal, maar zelden gebruikt in de beeldvorming als gevolg van de behandeling van problemen; onze voorbereiding leidt zelfs afzetting van het mica plaat, en vermindert de gebruikte bilaag bereiding materiaal.
Abstract
Ondersteunde lipidendubbellagen (SLBs) worden op grote schaal gebruikt als een model voor het bestuderen membraaneigenschappen (fasescheiding, clustering, dynamiek) en de interactie met andere verbindingen, zoals drugs of peptiden. Echter SLB kenmerken verschillen afhankelijk van de gebruikte drager.
Gewoonlijk gebruikte technieken voor SLB beeldvorming en metingen single molecule fluorescentie microscopie, FCS en atomic force microscopie (AFM). Omdat de meeste optische imaging studies worden uitgevoerd op een glazen drager, terwijl AFM vereist een uiterst vlakke ondergrond (meestal mica), de resultaten van deze technieken kan niet direct worden vergeleken, omdat de lading en gladheid eigenschappen van deze materialen sterk beïnvloeden diffusie. Helaas, de hoge mate van handvaardigheid vereist voor het snijden en verlijmen dunne plakjes van mica om het glaasje presenteert een hindernis om routinematig gebruik van mica voor SLB voorbereiding. Hoewel de voorkeursmethode, zoals bereid mica zouoppervlakken vaak uiteindelijk op een oneffen (golvend) en moeilijk om de afbeelding, met name met kleine werkafstand, hoge numerieke diafragma. Hier presenteren we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het bereiden van dunne, platte mica ondergrond voor lipide bolletjes depositie en SLB voorbereiding. Bovendien, onze op maat gemaakte kamer maakt slechts zeer kleine hoeveelheden van blaasjes voor SLB-vorming. De algemene procedure resulteert in een efficiënte, eenvoudige en goedkope productie van hoogwaardige lipide bilaag oppervlakken die rechtstreeks vergelijkbaar met die in AFM studies.
Introduction
Het algemene doel van dit protocol is om een methode te laten zien voor het bereiden van mica oppervlakken voor hoge resolutie beeldvorming van mica ondersteund lipidendubbellagen (SLBs) met behulp van optische totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) of confocale microscopie, die ook kan worden gecombineerd met een atomic force microscopie (AFM).
SLBs is een veel gebruikt model voor talrijke studies van lipide clustering, fasescheiding, dynamiek bilaag componenten of hun interacties met peptiden, eiwitten of andere verbindingen 1-5. Verschillende substraten kunnen worden voor SLB samenstelling (bijvoorbeeld glas, mica, siliciumdioxide, polymeren) afhankelijk van de aard van de studie 4,6-8. Typische studies membraan afhankelijk-microscopie beeldvormende technieken, zoals TIRFM en AFM. Zo TIRFM weergave, een glazen oppervlak is een typisch keuze, omdat glas transparant. Bereiding van glas is relatief eenvoudig, en de kwaliteit van de resultaten primairbepaald door grondig reinigen van oppervlakken vóór afzetting van lipide vesicles. AFM vanwege de hoge axiale resolutie vereist mica oppervlakken. Mica is een silicaat mineraal, met bijna perfecte basale decollete. Zo, de vers gekloofd mica is atomair vlak, waardoor observatie van membraan hoogteverschillen zelfs op de sub-nanometer schaal 9.
Diffusie studies behulp van methoden zoals fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS), enkel molecuul volgen (SMT) en fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) toonden echter dat lipide membraan dynamica sterk afhankelijk van het soort oppervlak waarop zij zijn aangebracht, waarbij glas en mica kunnen uiteenlopende resultaten geven 10,11. Deze verschillen niet alleen de diffusie coëfficiënten van het membraan probes, maar ook de detectie van afzonderlijke populaties van deeltjes verspreiden met verschillende tarieven en eventueel schakelen tussen verschillende toestanden.
Aldusde directe vergelijking van de resultaten verkregen met TIRFM en AFM technieken vaak problematisch, tenzij hetzelfde oppervlak (in dit geval mica) gebruikt. Hoewel er een aantal studies waarin TIRFM en AFM bilaag beeldvorming werd uitgevoerd op dezelfde mica oppervlak 12,13, wordt mica zelden gebruikt voor optische microscopie, vooral vanwege verwerkingsproblemen. Mica voorbereiding vergt snijden met de hand in dunne blaadjes, die vervolgens worden gelijmd aan het dekglaasje met optische kleefmiddel 12. Deze methode vereist wel enige oefening om bevredigende resultaten te bereiken. Bovendien zijn de verkregen oppervlakken vaak golvend en dik, waardoor ze moeilijk te gebruiken met lage werkafstand, hoge numerieke apertuur lenzen.
Mica oppervlakken bereid zoals beschreven in dit protocol zijn erg dun (~ 220 micrometer, waaronder het dekglaasje dikte van 170 micrometer) en extreem vlak, het vermijden van "golving", die van cruciaal belang voor een succesvolle hoge resolutie imaging. Ze kunnen gebruiktvoor TIRFM of confocale setups. Bovendien kan dezelfde monsters worden overgebracht naar AFM en zelfs gelijktijdig afgebeeld met TIRFM / confocale en AFM. De combinatie van deze twee technieken maakt een directe correlatie van diffusie gedrag met bilaagmembraan structuur 14. Omdat mica oppervlakken vers worden gesplitst, ze zijn schoon en geen tijdrovend, slecht reproduceerbaar, en potentieel gevaarlijke reinigen procedures vereisen (glas schoonmaak protocollen bevatten meestal chemicaliën zoals Piranha-oplossing, zwavelzuur, natrium / kalium-hydroxide). Montage van een kleine kamer, ook beschreven in het protocol, vermindert het volume van vesicles voor het effectieve dubbellaagsformatie tot minder dan 50 pl. Tenslotte, het hele proces van bekledingsconstructie is tijdrovend (bereiding duurt minder dan 30 minuten), en niet een hoge mate van handvaardigheid vereist, evenals conventionele mica splitsing en lijmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mica en Slides Voorbereiding
- Plaats nummer 1 ½ (0.17 mm) coverslips in kleuring rack.
- Sonificeer 30 min in 2% detergent bij 60 ° C.
- Was 20 keer met gedemineraliseerd water.
- Dia's te verwijderen met een tang en föhnen met behulp van perslucht of stikstof.
- Snijd mica vel in 10 x 10 mm vierkante stukjes met een schaar of scheermesje.
- Snijd elke mica stuk in 2-3 dunnere folders behulp scheermesje.
OPMERKING: Deze stap vereist het gebruik van scherp mes.
2. Mica Montage en Chamber Montage
- Clean microscopische glasplaatje met ethanol.
- Lijm folder van mica gesneden in stap 1,6 tot glasplaatje met behulp van optische lijm. Lage viscositeit lijm wordt geadviseerd om de drop beter te spreiden en lijm de mica.
- Hard uit onder UV-lamp, 10 min.
OPMERKING: Lijm wordt gehard door UV licht met een maximale absorptie in het traject van 350 tot 380 nm en de aanbevolen energie required voor volledige uitharding is 4,5 J / cm 2. Echter, verschillende lichtbronnen worden gebruikt voor deze stap (zie materialen die door lijm leverancier). - Expose een schone mica oppervlak door het verwijderen van de eerste paar lagen met Scotch tape.
- Breng kleine druppel (~ 20 urn) optische lijm op het mica oppervlak.
OPMERKING: Bij deze stap, hoge viscositeit lijm met lage autofluorescence niveau wordt geadviseerd. Onze ervaring is gebleken dat het gebruik van een combinatie van lage (stap 2.2) en hoge viscositeit lijm verhoogt significant de effectiviteit van mica splitsen (stap 2.7). - Plaats voorzichtig vers schoongemaakt dekglaasje op de druppel lijm, het vermijden van luchtbellen, laat regelen voor 1 min.
- Hard uit onder UV-lamp, 10 min.
LET OP: Na deze stap, kan de sandwich van glasplaatje, mica en dekglaasje worden opgeslagen voor een relatief lange periode van tijd (tot enkele weken). Ga door naar de volgende stap net voor de eigenlijke SLB voorbereiding, om ervoor te zorgen dat de mica oppervlak is fris.
NOTE: Lijm wordt gehard door UV licht met een maximale absorptie in het traject van 350 tot 380 nm en de aanbevolen energie voor volledige uitharding is 4.5J/cm 2. Echter, verschillende lichtbronnen worden gebruikt voor deze stap (zie materialen die door lijm leverancier). - Met behulp van een exactomes voorzichtig demonteer de dekglaasje heen glasplaatje zoals in de video. In de meeste gevallen zal een dunne vlakke laag mica blijft vastzitten aan het dekglaasje. Mica bevestigd aan glasplaatje kan worden hergebruikt (herhaal stap 2.4).
- Controleer de kwaliteit van het oppervlak met het blote oog of onder een dissectie microscoop, om ervoor te zorgen dat mica laag nog wordt vastgelijmd aan het dekglaasje en werd niet volledig verwijderd bij het kloven in stap 2.8. Het maken van een kleine kras met een pincet of ontleden van de naald zal helpen om onderscheid te maken tussen de lijm die een detecteerbaar verschillende consistentie van mica heeft.
- Verwijder de rubberen afdichting van een 1,5 ml dop en lijm de dop ondersteboven aan de oppervlakte met behulp van optischelijm of nagellak, en te genezen met UV-lamp, of laat de lucht drogen 10 min, respectievelijk.
OPMERKING: Als het monster wordt voorbereid voor gelijktijdige optische (TIRFM of confocale) met AFM beeldvorming, misschien een 1,5 ml dop te klein zijn om de AFM hoofd monteren op de microscoop podium. In dat geval kan de dop worden vervangen door een plastic O-ring met een grotere diameter, geschikt voor AFM hoofdconstructie. In het geval wanneer het experiment moet de dop zonder de mica oppervlak kan siliconenvet worden gebruikt in plaats van lijm of nagellak.
3. Ondersteunde lipidebilaag (SLB) Vorming
- Plaats vers bereide liposoomoplossing in kamer met oppervlakte. Het minimale volume nodig voor SLB-vorming is ~ 30 pi.
OPMERKING: Voor meer informatie over het liposoom en SLB vorming, zie gepubliceerde protocollen, zoals bijvoorbeeld Bag et al., 2014 15.. - Ga verder met SLB vorming behulp gewenste protocol. Tijdens incubatie enbeeldvorming, kan de kamer in een warmte-blok of verwarmde microscoop podium om de temperatuur die nodig is om de lipiden boven hun smelttemperatuur wordt gebruikt blijven behouden worden geplaatst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het diffusiegedrag van fluorescerende probes in lipide SLBs verschilt afhankelijk van de ondergrond. TIRFM gecombineerd met SMT techniek is een waardevolle werkwijze voor het visualiseren deeltje bewegingen en extraheren van de diffusiecoëfficiënten. Enkel molecuul signalen van een Sfingomyeline-ATTO647N probe verspreiden in een DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) bilaag ondersteund op glas en mica worden op de bijgevoegde geanimeerde figuur. Het mica oppervlak werd bereid volgens het protocol hier gepresenteerd. Voor een schatting van optische aberraties, volle breedte op halve hoogte (FWHM) werd gemeten en gemiddeld over de 20 puntspreidingsfunctie (PSF) met behulp van Mosaic 2D PSV Grootte ImageJ plugin 16,17. De gemeten FWHM voor glas en mica waren 441nm en 464nm respectievelijk (figuur 1). De 22nm verschil in resolutie tussen beeldvorming op glas en mica is niet significant. In beide gevallen kan de PSF zwaartepunt van de betreffende fluorescente molecuul locaseerd in opeenvolgende frames, en gekoppeld aan deeltjestrajecten loop van de tijd met Mozaïek Particle Tracker ImageJ plugin 16,17. Figuur 2 toont monster banen van deeltjes diffunderen over de dubbellaag ondersteund op beide oppervlakken. De gemiddelde vierkante verplaatsingen (SSA) van de fluorescente probe diffunderen in DOPC membraan ondersteund op glas en mica werd uitgezet op de figuur 3. Vanwege naast elkaar bestaan van meerdere bevolkingsgroepen twee bevolking model werd gebruikt voor snelle en langzame diffusiecoëfficiënten halen, volgens methode beschreven door Schutz (Figuur 4, Figuur 5) 18. De diffusie coëfficiënten en de fracties werden geëxtraheerd met TrackArt software 19 en worden samengevat in Tabel 1.
De resultaten van dit voorbeeld bewijzen van het bestaan van twee afzonderlijke staten van de diffusie sonde: snel en langzaam. De diffusiecoëfficiënt van de snelle bevolkingsgroei is ongeveer 10,5 keer hoger dan mica, glas. De langzame component echter bijna onbeweeglijk op glas (<0,01 um 2 / sec), vergeleken met een D slechts ~ 1/10 de snelle bevolking mica.
Figuur 1. Gemiddelde grootte PSV. Gemiddeld profiel PSV intensiteit voor 20 plekken gemeten op glas (zwarte getrokken lijn) en mica (rode stippellijn). De breedte bij halve hoogte (FWHM) van de genormaliseerde intensiteit glas en mica werd geschat op 441 nm en 464 nm respectievelijk,. De 22nm verschil geeft aan dat er geen significante daling van de beeldvorming resolutie tussen deze twee vlakken. PSV intensiteitsprofiel werd gemeten met behulp van Mosaic PSF 2D Tool ImageJ plugin 16,17. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Voorbeeld trajecten. Voorbeeld trajecten van SM-ATTO647N verspreiden in een DOPC lipide bilaag ondersteund op glas (A) en mica (B). Op de glazen ondersteunde bilaag, wordt de sonde vaak geïmmobiliseerd op het oppervlak, soms schakelen naar de snelle verspreiding toestand. Probes diffunderen op het mica ondersteunde dubbellaag daarentegen zelden geïmmobiliseerd op het oppervlak. In plaats daarvan hebben ze de neiging om te schakelen tussen snel en langzaam verstrooiende staat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Gemiddelde vierkante verplaatsingen. Mean vierkante displace menten van SM-ATTO647N deeltjes diffunderen op een glas-(■) en mica-(●) ondersteund DOPC dubbellaag. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Cumulatieve kansverdeling past. Cumulatieve kansverdeling (CPD) van vierkante verplaatsingen en past voor de bi-exponentiële (twee-populatie) diffusie model van SM-ATTO647N deeltjes diffunderen op glas-(A) en mica-(B) ondersteund DOPC dubbellagen. Uitkeringen en past zijn alleen gepresenteerd voor de vijfde vertraging (Δ t = 50 msec). Berekeningen en percelen zijn verkregen met behulp van TrackArt 19 software.lank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. MSD en fractie plots. MSD percelen voor de snelle (r 1 2) en langzame (r 2 2) het verspreiden van de bevolking en de fractie van de snelle bevolkingsgroei (F 1) berekend op basis van het BPR past. De resultaten worden afzonderlijk gepresenteerd voor SM-ATTO647N deeltjes diffunderen op glas-(A) en mica-(B) ondersteund DOPC dubbellagen. Berekeningen en plots werden verkregen met behulp TrackArt 19 software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Bevolking 1 (snel) | Bevolking 2 (langzaam) | |||||||
| D 1 (um 2 / sec) | Fractie (%) | D 2 (um 2 / sec) | Fractie (%) | |||||
| Glas | 1.840 ± 0.031 | 65.19 ± 0.56 | 0.006 ± 0.001 | 34.81 ± 0.56 | ||||
| Mica | 53.88 ± 0.26 | 0.176 ± 0.002 | 46.12 ± 0.26 | |||||
Tabel 1. Diffusiecoëfficiënten. Samenvatting van diffusie statistiek. Diffusiecoëfficiënten voor langzame en snelle bevolking en hun fracties. De berekeningen werden uitgevoerd in TrackArt software met behulp van een twee-populatie model. Trajecten werden herkend en gekoppeld met behulp van Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin.
Animated Figuur :. Single moleculen diffusie Timelapse TIRFM film van Sfingomyeline-ATTO647N diffunderen in een DOPC dubbellaag ondersteund op glas (links) en mica (rechts). Schaal bar is 5 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden soepel en dun mica oppervlakken lipide bilaag depositie en hoge resolutie beeldvorming. De techniek vereist minimale handvaardigheid beperkt vooral de zorgvuldige demontage van de glas-mica-glas sandwich (stap 2.8), wat essentieel is voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit mica oppervlak. Inspectie van de vers gekloofd mica steeds vereist op dit punt, aangezien het mogelijk dat de mica los te maken van de optische lijm zonder splitsen, waardoor blootgestelde optische lijm. Die zouden kunnen resulteren in ongewenste afzetting van de dubbellaag op zelfklevende plaats van op de mica. De mica oppervlak bereid met behulp van de beschreven methode is op enkele uitzonderingen na parallel aan het dekglaasje oppervlak, te oordelen naar de uniforme hoge optische beeldvorming kwaliteit die wij verkregen; we hebben dan ook geen behoefte aan extra verificatie.
De laatste stap in de montage van de kamer kan worden aangepast. De video tutorial laat een1,5 ml glazen flesje kunststofkap gebruikt als een kamer, maar dit kan worden vervangen door het object van soortgelijke vorm en gewenste afmetingen, bijv. voor gelijktijdige AFM-TIRFM/confocal beeldvorming, waarbij het monster met de houder moet passen in de AFM hoofd . Montage van een aangepaste kamer worden overgeslagen, indien beeldvorming wordt uitgevoerd met een standaard, 35 mm metalen celkamer. In dit geval echter een 25 mm rond dekglas moet worden gebruikt, en een veel grotere hoeveelheid liposoom oplossing zou zijn voor SLB vorming.
De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat enkel molecuul beeldvorming en het bijhouden eenvoudig kan worden gedaan op extreem platte mica oppervlakken dun genoeg vatbaar voor TIRFM beeldvorming te zijn, volgens het protocol voor oppervlaktebehandeling beschreven. Hetzelfde preparaat kan worden toegepast op andere technieken, zoals hoge resolutie optische microscopie, zoals totale interne reflectie fluorescentie correlatie spectroscopie (TIR-FCS). Belangrijk, SLBs prepared dezelfde manier (of zelfs exact dezelfde monsters) kan worden gebruikt in zowel experimentele opstellingen, een essentieel criterium voor directe vergelijking van de resultaten verkregen onder toepassing van verschillende werkwijzen, bijvoorbeeld AFM, SMT, FCS en FRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al.
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P.
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
