Summary
Vi præsenterer en fremgangsmåde til fremstilling af glimmer understøttet lipiddobbeltlag for høj opløsning mikroskopi. Mica er gennemsigtig og fladt på en atomar skala, men sjældent brugt i billedbehandling på grund af håndtering af problemer; vores forberedelse resulterer i mere aflejring af glimmer ark og reducerer materiale anvendt i dobbeltlaget præparat.
Abstract
Understøttede lipid dobbeltlag (SLBs) er almindeligt anvendt som en model til at studere membranproteiner egenskaber (fase separation, klyngedannelse, dynamik), og dens interaktion med andre forbindelser, såsom narkotika eller peptider. Men SLB egenskaber varierer afhængigt af den støtte, der anvendes.
Almindeligt anvendte teknikker til SLB billeddannelse og målinger er enkelt molekyle fluorescens mikroskopi, FCS og atomic force mikroskopi (AFM). Fordi de fleste optiske billeddiagnostiske undersøgelser foretages på et glas support, mens AFM kræver en ekstremt flad overflade (generelt glimmer), kan resultaterne fra disse teknikker ikke sammenlignes direkte, da op-og glathed egenskaber af disse materialer stærk indflydelse diffusion. Desværre højt håndelag nødvendige for skæring og limning tynde skiver af glimmer til objektglasset viser en forhindring for rutinemæssig brug af glimmer SLBs forberedelse. Selv om dette ville være den foretrukne metode, f.eks fremstillet glimmeroverflader ofte ender med at blive ujævn (bølget) og vanskelige at billedet, især med lille arbejdsgruppe afstand, høj numerisk blænde objektiver. Her præsenterer vi en enkel og reproducerbar metode til fremstilling af tynde, flade glimmer overflader til lipidvesikel aflejring og SLB forberedelse. Derudover vores specialfremstillede kammer kræver kun meget små mængder af vesikler til SLB dannelse. De overordnede procedure resulterer i en effektiv, enkel og billig produktion af høj kvalitet lipiddobbeltlaget overflader, der er direkte sammenlignelige med dem, der anvendes i AFM undersøgelser.
Introduction
Det overordnede mål med denne protokol er at vise en metode til fremstilling af glimmer overflader for høj opløsning billeddannelse af glimmer understøttede lipid dobbeltlag (SLBs) bruger optisk total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM) eller konfokal mikroskopi, som også kunne kombineres med atomic force mikroskopi (AFM).
SLBs er en udbredt model til utallige undersøgelser af lipid klyngedannelse, faseadskillelse, dynamik dobbeltlagsmembraner komponenter eller deres interaktion med peptider, proteiner eller andre forbindelser 1-5. Forskellige substrater kan anvendes til SLB dannelse (dvs. glas, glimmer, siliciumdioxid, polymerer), afhængigt af arten af undersøgelsen 4,6-8. Undersøgelser Typiske membran stole på mikroskopi-baserede imaging teknikker, såsom TIRFM og AFM. Således TIRFM billeddannelse, en glasoverflade er et typisk valg, fordi glas er gennemsigtigt. Fremstilling af glas er forholdsvis let, og kvaliteten af de resultater, primærtbestemmes ved grundig rengøring af overflader før aflejring af lipidvesikler. AFM grund af sin høje aksiale opløsning kræver glimmer overflader. Mica er et silikat mineral, med tæt på perfekt basal spaltning. Således frisk kløvet glimmer er atomically flad, så observation af membran højdeforskelle selv på sub-nanometer skala 9.
Diffusion undersøgelser ved hjælp af metoder som fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), enkelt molekyle sporing (SMT), og fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) viste dog, at lipid membran dynamik afhænger i høj grad af den type overflade, på hvilken de er deponeret, hvorved glas og glimmer kan give vidt forskellige resultater 10,11. Disse forskelle omfatter ikke kun diffusionskoefficienterne af membranen sonder, men også påvisning af separate populationer af partikler diffunderer med forskellige satser, og muligvis skifte mellem forskellige stater.
Såledesden direkte sammenligning af resultater opnået ved brug TIRFM og AFM teknikker er ofte problematisk, med mindre den samme overflade (i dette tilfælde glimmer) er anvendt. Selvom der er nogle undersøgelser, hvor TIRFM og AFM tolags imaging blev udført på samme glimmer overflade 12,13 er glimmer sjældent bruges til optisk mikroskopi, hovedsagelig på grund af problemer med papirhåndtering. Glimmer forberedelse kræver skæring med hånden i tynde foldere, som derefter limet til dækglasset bruger optisk lim 12. Denne metode kræver dog lidt øvelse at opnå tilfredsstillende resultater. Desuden overfladerne opnåede ofte bølget og tyk, hvilket gør dem svære at bruge med lav arbejdstid afstand, høj numerisk blænde objektiver.
Glimmer overflader fremstillet som beskrevet i denne protokol er meget tynde (~ 220 um, herunder dækglasset tykkelse på 170 um) og ekstremt fladt, så man undgår "waviness", som er afgørende for en vellykket høj opløsning billeddannelse. De kan brugesfor TIRFM eller konfokal opsætninger. Desuden kan de samme prøver overføres til AFM, og selv afbildes samtidigt med TIRFM / konfokal og AFM. Ved at kombinere disse to teknikker giver mulighed for direkte korrelation mellem diffusion adfærd med dobbeltlaget membran struktur 14. Fordi glimmer overflader er frisk spaltes, de er rene og ikke kræver tidskrævende, dårligt reproducerbar, og potentielt farlige rengøringsprocedurer (glas rengøring protokoller normalt omfatte kemikalier såsom Piranha løsning, svovlsyre, natrium / kalium-hydroxid). Montering af et lille kammer, også beskrevet i protokollen, reducerer mængden af vesikler, der er nødvendige for en effektiv dobbeltlagsformation til mindre end 50 pl. Endelig er hele processen med overfladen samling er ikke tidskrævende (forberedelse tager mindre end 30 minutter), og kræver ikke en høj grad af manuel dygtighed, som gør konventionelle glimmer spaltning og limning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mica og Slides Forberedelse
- Sted nr. 1 ½ (0,17 mm) dækglas i farvning rack.
- Soniker i 30 minutter i 2% vaskemiddel ved 60 ° C.
- Vask 20 gange med deioniseret vand.
- Fjern slides med pincet og blæs tør med trykluft eller nitrogen.
- Skær glimmer ark i 10 x 10 mm kvadratiske stykker med saks eller barberblad.
- Skær hver glimmer stykke ind i 2-3 tyndere foldere hjælp barberblad.
BEMÆRK: Dette trin kræver brug af skarpe klinge.
2.. Mica Montering og Chamber Montering
- Ren mikroskopiske objektglas med ethanol.
- Lim folder af glimmer skåret i trin 1,6 til objektglas ved hjælp af optisk lim. Lav viskositet klæbestof rådes til bedre sprede drop og lime glimmer.
- Cure under UV-lampe, 10 min.
BEMÆRK: Lim hærdes med UV-lys med maksimal absorption i området 350 til 380 nm, og den anbefalede energi requIRED for fuld helbredelse er 4,5 J / cm 2. Dog kan bruges forskellige lyskilder til dette trin (se materialer fra limleverandøren). - Blotlægge en ren glimmer overflade ved fjernelse af de første par lag med Scotch tape.
- Placer lille dråbe (~ 20 um) af optisk klæbemiddel på glimmer overflade.
BEMÆRK: I dette trin er høj viskositet lim med lav autofluorescensværdi niveau anbefales. Vores erfaring har vist, at brug af en kombination af lav (trin 2.2) og høj viskositet klæbestoffer stiger betydeligt effektiviteten af glimmer opsplitning (trin 2.7). - Anbring forsigtigt frisk renset dækglas på dråbe lim, undgå luftbobler, lad nøjes med 1 min.
- Cure under UV-lampe, 10 min.
BEMÆRK: Efter dette trin, kan sandwich af glas dias, glimmer og dækglas opbevares i en forholdsvis lang periode (op til få uger). Fortsæt til næste trin lige før den egentlige SLB forberedelse, for at sikre, glimmer overfladen er frisk.
BEMÆRK: Lim hærdes med UV-lys med maksimal absorption i området 350 til 380 nm, og den anbefalede energi, der kræves for fuld hærdning er 4.5J/cm 2. Dog kan bruges forskellige lyskilder til dette trin (se materialer fra limleverandøren). - Ved hjælp af en exacto kniv, forsigtigt afmontere dækglasset fra side glasplade, som vist i videoen. I de fleste tilfælde vil en tynd og flad lag af glimmer forblive fastgjort til dækglasset. Mica er knyttet til objektglas kan genbruges (gentag fra trin 2.4).
- Kontroller overfladekvalitet ved blotte øje eller under et dissektionsmikroskop, for at sikre, at glimmer lag stadig er limet til dækglasset og blev ikke fjernet fuldstændigt under opdeling i trin 2.8. Realiseringen af et lille ridse med en pincet eller dissekere nål vil bidrage til at skelne mellem det klæbemiddel, der har et påviseligt forskellig konsistens fra glimmer.
- Fjern gummipakning fra en 1,5 ml hætteglas hætte og lim hætten på hovedet til overfladen ved hjælp af optiskelim eller neglelak, og hærde med UV-lampe, eller lad lufttørre 10 min hhv.
BEMÆRK: Hvis prøven er forberedt til samtidig optisk (TIRFM eller konfokal) med AFM billeddannelse, kan en 1,5 ml hætteglas cap være for lille til at montere AFM hovedet på mikroskopet scenen. I så fald kan hætten erstattes af nogen plast O-ring med en større diameter, velegnet til AFM hovedet montering. I tilfælde, hvor forsøget kræver fjernelse af hætten uden at beskadige glimmer overflade, kan siliconefedt anvendes i stedet for lim eller neglelak.
3.. Understøttet lipiddobbeltlag (SLB) Dannelse
- Placer frisklavet liposomopløsning i kammeret med overfladen. Den mindste volumen kræves til SLB dannelse er ~ 30 pi.
BEMÆRK: For flere oplysninger om liposomet og SLB formation henvises til offentliggjorte protokoller, såsom såsom Bag m.fl. 2014 15... - Fortsæt med SLB dannelse hjælp ønskede protokol. Under inkubation ogbilleddannelse, kan kammeret anbringes i et varme-blok eller opvarmet mikroskopobjektbord at opretholde temperatur, der kræves for at holde de lipider, der anvendes over deres smeltetemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spredningen opførsel af fluorescerende lipid sonder i SLBs er forskellig afhængig af underlaget. TIRFM kombineret med SMT teknik er en værdifuld metode til at visualisere partikel bevægelser og ekstrahere deres diffusionskoefficienter. Enkelt molekyle signaler af en sphingomyelin-ATTO647N probe diffunderer i DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) dobbeltlag understøttet på glas og glimmer er vist på vedlagte animerede figur. Glimmer overflade blev fremstillet ifølge protokollen præsenteret her. For at estimere optiske aberrationer var fuld bredde i halv maksimum (FWHM) målt og i gennemsnit over 20 punktspredningsfunktionen (PSF) ved hjælp af Mosaic 2D PSF Size ImageJ plugin 16,17. Den målte FWHM til glas og glimmer var 441Nm og 464nm (figur 1). 22nm forskellen i opløsning mellem billeddannelse på glas og glimmer er ikke signifikant. I begge tilfælde kan PSF geometriske tyngdepunkt af hver enkelt fluorescerende molekyle Loca2 viser eksempler partiklers baner diffunderer på tværs af dobbeltlaget understøttet på begge flader Egenproduktionen i successive rammer, og linket ind partikelbaner over tid med Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin 16,17. Figur. De gennemsnitlige kvadratiske forskydninger (MSDS) i den fluorescerende probe diffunderer i DOPC membran understøttet på glas og glimmer blev plottet på Figur 3.. Grundet sameksistens af flere populationer to befolkning model blev brugt til at udvinde hurtige og langsomme diffusionskoefficienter, ifølge beskrevne metode af Schutz (figur 4, figur 5) 18. De diffusionskoefficienter og fraktioner blev udvundet ved hjælp TrackArt software 19 og er opsummeret i tabel 1..
Resultaterne fra dette eksempel bevise eksistensen af to separate stater i spredende sonde: hurtig og langsom. Diffusionskoefficient hurtigt befolkning er omkring 1.5 Gange højere på glimmer end på glas. Den langsomme komponent er imidlertid næsten ubevægelige på glas (<0,01 mM 2 / sek) sammenlignet med en D kun ~ 1/10 den hurtige befolkning glimmer.
Figur 1.. Gennemsnitlig PSF størrelse. Gennemsnitlig PSF intensitet profil for 20 pladser målt på glas (sort optrukket linie) og glimmer (rød stiplet linie). Den fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM) af til glas og glimmer den normaliserede intensitet blev anslået til at være 441 nm og 464 nm. 22nm forskel betyder, at der ikke er nogen væsentlig nedgang i billedbehandling opløsning mellem disse to flader. PSF intensitet profil blev målt ved hjælp af Mosaic PSF 2D Tool ImageJ plugin 16,17. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sample baner. Sample baner af SM-ATTO647N spredende i DOPC lipiddobbeltlag understøttet på glas (A) og glimmer (B). På glasset understøttes dobbeltlag sonden ofte immobiliseret på overfladen, lejlighedsvis skifte til hurtigt spredende tilstand. Prober diffunderer på glimmer understøttet dobbeltlag derimod sjældent immobiliseret på overfladen. I stedet er de tilbøjelige til at skifte mellem hurtig og langsom spredende tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Mean square forskydninger. Mean firkantet fortrænge menter af SM-ATTO647N partikler diffunderer på et glas-(■) og glimmer-(●) støttede DOPC dobbeltlaget. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Kumulativ sandsynlighed fordeling passer. Kumulativ sandsynlighed distribution (CPD) af kvadratiske forskydninger og passer til den bi-eksponentiel (to-populationen) diffusion model SM-ATTO647N partikler diffunderer på glas-(A) og glimmer-(B), der støttes DOPC dobbeltlag. Fordelinger og passer kun præsenteres for femte gang-lag (Δ t = 50 ms). Beregninger og plots opnås ved hjælp TrackArt 19 software.lank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5.. MSD og fraktion plots. MSD grunde til den hurtige (R 1 2) og langsom (r 2 2) diffunderer befolkning og brøkdel af den hurtige befolkning (F 1), beregnet ud fra byggevaredirektivet passer. Resultaterne præsenteres separat for SM-ATTO647N partikler diffunderer på glas-(A) og glimmer-(B), der støttes DOPC dobbeltlag. Beregninger og grunde blev opnået ved hjælp af TrackArt 19 software. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Befolkningen 1. (hurtig) | Befolkning 2 (langsom) | |||||||
| D 1 (Mm 2 / sek) | Fraktion (%) | D 2 (mM 2 / sek) | Fraktion (%) | |||||
| Glas | 1.840 ± 0.031 | 65,19 ± 0,56 | 0,006 ± 0,001 | 34,81 ± 0,56 | ||||
| Mica | 53,88 ± 0,26 | 0,176 ± 0,002 | 46,12 ± 0,26 | |||||
Tabel 1. Diffusionskoefficienter. Resumé af diffusion statistik. Diffusionskoefficienter for langsomme og hurtige befolkninger og fraktioner. Beregninger blev udført i TrackArt software ved hjælp af en to befolkning model. Baner blev anerkendt og forbundet ved hjælp af Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin.
Animeret Figur :. enkelte molekyler diffusion Timelapse TIRFM filmen af Sphingomyelin-ATTO647N diffunderer i en DOPC tolags understøttet på glas (til venstre) og glimmer (højre). Målestokken er 5 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af glatte og tynde glimmer overflader til lipiddobbeltlag deposition og høj opløsning. Teknikken kræver minimal manuelle færdigheder, begrænset meste til omhyggelig adskillelse af glas glimmer sandwich (trin 2.8), som er afgørende for at opnå en høj kvalitet glimmer overflade. Inspektion af frisk spaltet glimmer altid påkrævet på dette tidspunkt, da det er muligt for glimmer at løsne sig fra den optiske lim uden spalte, der forlader udsatte områder af optisk klæbemiddel. Det kunne resultere i uønsket aflejring af dobbeltlaget om lim i stedet for på glimmer. Glimmer overflade fremstillet ved anvendelse af den beskrevne metode er med få undtagelser parallelt med dækglasset overflade, at dømme efter den ensartet høj optisk imaging kvalitet, vi opnåede; vi derfor ikke ser et behov for yderligere kontrol.
Det sidste trin i at montere kammeret kan tilpasses. Video tutorial viser en1,5 ml hætteglas plasthætte bliver brugt som et kammer, men dette kan erstattes med ethvert objekt af lignende form og ønskede dimensioner, f.eks samtidig AFM-TIRFM/confocal billeddannelse, hvor prøven med indehaveren har til at passe ind i AFM hovedet . Montering af en brugerdefineret kammer kan springes, hvis billeddannelsen skal udføres ved hjælp af en standard, 35 mm metal celle kammer. I dette tilfælde er imidlertid en 25 mm runde dækglas skal anvendes, og en meget større mængde af liposom løsning ville være påkrævet for SLB formation.
Resultaterne præsenteres her viser, at enkelt molekyle billeddannelse og sporing kan nemt gøres på ekstremt flade glimmer overflader tynde nok til at være modtagelig for TIRFM billedbehandling, i henhold til protokollen til overfladebehandling beskrevet. Det samme præparat kan anvendes til andre teknikker, herunder høj opløsning optisk mikroskopi, såsom total indre refleksion fluorescenskorrelationsspektroskopi (TIR-FCS). Vigtigere er det, SLBs prepARED på samme måde (eller endda præcis de samme prøver) kan bruges i begge forsøgsopstillinger, et afgørende kriterium for direkte sammenligning af resultater opnået ved hjælp af forskellige metoder, fx AFM, SMT, FCS, FRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekræftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al.
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P.
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
