Summary
Apresenta-se um método de preparação de mica suportado bicamadas lipídicas para microscopia de alta resolução. Mica é transparente e liso em uma escala atômica, mas raramente usado em imagiologia por causa de dificuldades de manuseio; a preparação resulta em deposição uniforme da folha de mica, e reduz o material usado na preparação de bicamada.
Abstract
Bicamadas lipídicas suportadas (EBSL) são amplamente utilizados como modelo para o estudo de propriedades da membrana (separação de fases, de agrupamento, dinâmica) e sua interação com outros compostos, tais como drogas ou peptídeos. No entanto características SLB diferente, dependendo do suporte utilizado.
Técnicas comumente usados para imagens e medições SLB são microscopia única molécula de fluorescência, FCS e microscopia de força atômica (AFM). Como a maioria dos estudos de imagiologia óptica são realizadas sobre um suporte de vidro, enquanto que a AFM requer uma superfície extremamente lisa (geralmente mica), os resultados destas técnicas não podem ser directamente comparados, uma vez que as propriedades de carga e de suavidade destes materiais influenciam fortemente a difusão. Infelizmente, o nível elevado de destreza manual necessária para o corte e colagem de fatias finas de mica para a lâmina de vidro apresenta um obstáculo para a utilização de rotina de mica para a preparação SLB. Embora este seja o método de escolha, tal mica preparadasuperfícies muitas vezes acabam por ser irregular (ondulado) e difícil de imagem, especialmente com distância de trabalho pequeno, lentes de alta abertura numérica. Aqui apresentamos um método simples e reprodutível para preparar superfícies planas finas de mica para a deposição de vesícula lipídica e preparação SLB. Além disso, a nossa câmara personalizado feito requer apenas pequenas quantidades de vesículas para a formação SLB. Os resultados do procedimento geral para a produção eficiente, simples e barata de alta qualidade superfícies da bicamada lipídica, que são directamente comparáveis com os utilizados em estudos de AFM.
Introduction
O objetivo geral do presente protocolo é mostrar um método para preparar superfícies de mica em alta resolução de imagem de mica suportada bicamadas lipídicas (EBSL) utilizando microscopia óptica de fluorescência total de reflexão interna (TIRFM) ou microscopia confocal, que também poderia ser combinada com a força atômica microscopia (AFM).
EBSL é um modelo amplamente usado para numerosos estudos de agrupamento lipídico, a separação de fases, a dinâmica de componentes de bicamada ou as suas interacções com peptídeos, proteínas ou outros compostos 1-5. Substratos diferentes podem ser usadas para a formação de SLB (isto é, vidro, mica, dióxido de silício, polímeros), dependendo da natureza do estudo 4,6-8. Estudos de membrana típicas contam com técnicas de imagem com base em microscopia, como TIRFM e AFM. Assim, para a imagiologia TIRFM, uma superfície de vidro é uma escolha típica porque o vidro é transparente. Preparação de vidro é relativamente fácil, e a qualidade dos resultados é primariamentedeterminada pela superfície limpeza completa antes da deposição de vesículas lipídicas. AFM, devido à sua alta resolução axial requer superfícies mica. Mica é um mineral de silicato, com cerca de clivagem basal perfeita. Assim, a mica recém clivada é atomicamente plana, permitindo a observação da membrana diferenças de altura, mesmo em escala sub-nanométrica 9.
Estudos de difusão, utilizando métodos como a espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), seguindo molécula única (SMT), e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) mostrou no entanto, que a dinâmica da membrana lipídica depender muito do tipo de superfície sobre a qual são depositados, em que vidro mica e pode dar resultados muito diferentes 10,11. Estas diferenças incluem não apenas os coeficientes de difusão das sondas de membrana, mas também a detecção de populações distintas de partículas que difundem a taxas diferentes, e, possivelmente, a comutação entre os diferentes estados.
Assim,a comparação directa dos resultados obtidos utilizando técnicas de TIRFM e AFM é muitas vezes problemática, a menos que a mesma superfície (neste caso, a mica) é usado. Embora existam alguns estudos onde TIRFM e AFM bicamada de imagem foi realizado na mesma superfície mica 12,13, mica é raramente usado para a microscopia óptica, principalmente por causa de problemas de manuseio. Preparação mica requer corte à mão em folhetos finos, que são então coladas à lamela utilizando adesiva óptica 12. Este método, porém, requer um pouco de prática para alcançar resultados satisfatórios. Além disso, as superfícies obtidas são muitas vezes ondulado e grosso, tornando-os difíceis de usar com baixa distância de trabalho, lentes de alta abertura numérica.
Mica superfícies preparadas como descrito no presente protocolo são muito finas (~ 220 mM, incluindo a espessura da lamela de 170 um) e extremamente lisa, evitando "ondulação", o qual é crítico para uma imagem com alta resolução. Eles podem ser utilizadospara TIRFM ou confocal setups. Além disso, as mesmas amostras podem ser transferidos para a AFM, e ainda visualizados simultaneamente com TIRFM / confocal e AFM. A combinação destas duas técnicas permite correlação direta do comportamento de difusão com a estrutura da membrana de bicamada 14. Como as superfícies de mica são recém-clivada, são limpos e não necessitam de demorado, pouco reprodutível, e procedimentos de limpeza potencialmente perigosas (protocolos de limpeza de vidro geralmente incluem produtos químicos como solução Piranha, ácido sulfúrico, hidróxido de sódio / potássio). Montagem de uma pequena câmara, também descrito no protocolo, reduz o volume de vesículas necessários para a formação de bicamada eficaz para menos de 50 ul. Finalmente, todo o processo de montagem de superfície não é demorado (preparação leva menos do que 30 min), e não requerem um elevado grau de habilidade manual, tal como a clivagem de mica convencional e colagem.
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Protocol
1. Mica e Slides Preparação
- Lugar No. 1 ½ (0,17 mm) em lamelas suporte de coloração.
- Sonicar durante 30 min em 2% de detergente a 60 ° C.
- Lave 20 vezes com água deionizada.
- Retirar as lâminas usando uma pinça e secar com ar comprimido ou nitrogênio.
- Corte folha mica em 10 x 10 mm pedaços quadrados usando uma tesoura ou lâmina de barbear.
- Corte cada pedaço mica em 2-3 folhetos finas utilizando lâmina de barbear.
NOTA: Esta etapa exige o uso de lâmina afiada.
2. Assembléia Mica e da Câmara de montagem
- Limpe lâmina de vidro microscópicas com etanol.
- Glue folheto de mica cortado no passo 1.6 a lâmina de vidro com adesivo óptico. Adesivo de baixa viscosidade é aconselhável para melhor difundir a queda e cole a mica.
- Cure sob a lâmpada UV, 10 min.
NOTA: O adesivo é curado por luz UV com uma absorção máxima na gama de 350 a 380nm e a energia recomendado required para cura total é de 4,5 J / cm 2. No entanto, as diferentes fontes de luz pode ser utilizado para este passo (ver materiais fornecidos pelo fornecedor de adesivo). - Expor uma superfície mica limpo, eliminando as primeiras camadas com fita adesiva.
- Coloque uma pequena gota (~ 20 mM) de adesivo óptico sobre a superfície da mica.
NOTA: Nesta etapa, adesivo de alta viscosidade, com baixo nível de autofluorescência é aconselhada. Nossa experiência mostrou que o uso de combinação de baixo (passo 2.2) e adesivos de alta viscosidade aumenta significativamente a eficácia da divisão mica (passo 2.7). - Delicadamente, coloque lamela limpo de fresco para a gota de cola, evitando bolhas de ar, vamos contentar com 1 min.
- Cure sob a lâmpada UV, 10 min.
NOTA: após esta etapa, a sanduíche da lâmina de vidro, mica e lamela pode ser armazenado por um período relativamente longo de tempo (até algumas semanas). Vá para a próxima etapa, pouco antes da preparação real SLB, para certificar-se da superfície da mica é fresco.
NOTA: O adesivo é curado por luz UV com uma absorção máxima na gama de 350 a 380nm e a energia necessária para recomendada a cura completa é 4.5J/cm 2. No entanto, as diferentes fontes de luz pode ser utilizado para este passo (ver materiais fornecidos pelo fornecedor de adesivo). - Usando um estilete, desmontar cuidadosamente a lamela de lâmina de vidro lateral, como mostrado no vídeo. Na maioria dos casos, uma camada fina e plana de mica permanecerá ligado à lamela. Mica ligado a lâmina de vidro podem ser reutilizados (repita a partir do passo 2.4).
- Verificar a qualidade da superfície ao olho nu ou sob um microscópio de dissecação, a certificar-se de que a camada de mica ainda está colada à lamela e não foi completamente removido durante a cisão no passo 2.8. Fazendo um pequeno arranhão com uma pinça ou agulha de dissecação ajudará a distinguir entre o adesivo que tem uma consistência diferente detectável a partir de mica.
- Remova a vedação de borracha a partir de um frasco de tampa de 1,5 ml e cola a tampa de cabeça para baixo para a superfície, usando ópticaadesiva ou unha polonês, e curar com lâmpada UV, ou deixar que o ar seco 10 min, respectivamente.
NOTA: Se a amostra é preparada para simultânea óptico (TIRFM ou confocal) com imagens de AFM, um ml frasco cap 1.5 pode ser muito pequeno para montar a cabeça AFM no palco microscópio. Nesse caso, o tampão pode ser substituído por qualquer plástico junta tórica com um diâmetro maior, adequado para a montagem de cabeça de AFM. No caso, quando o experimento requer remoção da tampa, sem danificar a superfície de mica, graxa de silicone pode ser usado em vez de cola ou unha polonês.
3. Formação Apoiado Lipid Bilayer (SLB)
- Coloque solução de lipossomas preparados na hora na câmara com a superfície. O volume mínimo necessário para a formação de SLB é ~ 30 ul.
NOTA: Para obter mais detalhes sobre o lipossoma e formação SLB, referem-se a protocolos publicados, tais como tais como Bolsa et al, 2014 15.. - Prossiga com formação SLB usando o protocolo desejado. Durante a incubação eimagiologia, a câmara pode ser colocada num bloco de calor ou fase de microscópio aquecida para manter a temperatura necessária para manter os lípidos sendo utilizadas acima da sua temperatura de fusão.
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Representative Results
O comportamento de difusão de sondas fluorescentes lipídicas em EBSL é diferente, dependendo do substrato. TIRFM combinada com a técnica SMT é um método valioso para a visualização de movimentos de partículas e extrair os seus coeficientes de difusão. Sinais de moléculas isoladas de uma sonda de esfingomielina-ATTO647N difusão numa DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) em bicamada suportada em vidro e de mica são mostrados na figura animada em anexo. A superfície de mica foi preparado de acordo com o protocolo aqui apresentado. Para estimar as aberrações ópticas, largura à meia altura (FWHM) foi medido e calculados sobre a função de 20 pontos spread (PSF) usando mosaico 2D PSF Tamanho ImageJ plugins 16,17. O FWHM medido para o vidro e mica foram 441nm e 464nm, respectivamente (Figura 1). A diferença entre 22nm na resolução de imagem em vidro e mica não é significativa. Em ambos os casos, o centróide PSF de cada molécula fluorescente única pode ser locazou em quadros sucessivos, e vinculado a trajetórias de partículas ao longo do tempo com a Mosaic Particle Rastreador ImageJ plugins 16,17. Figura 2 mostra as trajetórias de amostras de partículas de difusão através da bicamada suportado em ambas as superfícies. Os deslocamentos dos quadrados médios (LME) da sonda fluorescente difusão em DOPC membrana suportada em vidro e mica foi plotada no Figura 3. Devido à coexistência de várias populações dois modelos população foi usado para extrair coeficientes de difusão rápida e lenta, de acordo com método descrito por Schutz (Figura 4, Figura 5) 18. Os coeficientes de difusão e as suas fracções foram extraídos utilizando o software TrackArt 19 e encontram-se resumidos na Tabela 1.
Os resultados deste exemplo provar a existência de dois estados separados da sonda difusão: rápidas e lentas. O coeficiente de difusão da população rápido é de aproximadamente 10,5 vezes mais elevado do que em mica em vidro. O componente lento no entanto, é quase imóvel em vidro (<0,01 mM 2 / seg), em comparação com um D de apenas ~ 1/10 da população rápido em mica.
Figura 1. Tamanho médio PSF. Perfil Média intensidade PSF por 20 pontos medidos em vidro (linha sólida preta) e mica (linha tracejada vermelha). A largura total a meia altura (FWHM) de a intensidade normalizada para o vidro de mica e foi estimada em 441 nm e 464 nm, respectivamente. A diferença de 22 nm indica que não existe uma redução significativa na resolução de imagem entre estas duas superfícies. Perfil de intensidade PSF foi medida usando Mosaic PSF 2D ferramenta ImageJ plugin de 16,17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Trajectórias de exemplo. Trajectórias de exemplo de SM-ATTO647N difundem numa bicamada lipídica DOPC suportada em vidro (A) e de mica (B). Na bicamada de vidro suportada, a sonda está frequentemente imobilizado sobre a superfície, ocasionalmente, a mudança para o estado de rápida difusão. Sondas de difusão no mica suportado bicamada, em contraste, são raramente imobilizado sobre a superfície. Em vez disso, eles tendem a alternar entre estado de difusão rápida e lenta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Média deslocamentos quadrados. Deslocamento quadrático médio mentos de partículas SM-ATTO647N difusão em um vidro (■) e mica-(●), apoiado DOPC bicamada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Distribuição de probabilidade cumulativa encaixa. Distribuição de probabilidade cumulativa (CPD) de deslocamentos quadrados e se encaixa para o modelo de difusão bi-exponencial (dois população) de partículas de SM-ATTO647N difundem em vidro (A) e de mica-(B) suportado bicamadas DOPC. Distribuições e ajustes são apresentados apenas para o quinto intervalo de tempo (Δ t = 50 ms). Os cálculos e gráficos são obtidos utilizando TrackArt 19 software.escorrido "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Parcelas Figura 5. MSD e parcelas de fração. MSD para o jejum (r 1 2) e lento (r 2 2) difusão população e fração do rápido da população (F 1) calculados a partir dos ataques de CPD. Os resultados são apresentados separadamente para partículas SM-ATTO647N difundem em vidro (A) e de mica-(B) suportado bicamadas DOPC. Os cálculos e gráficos foram obtidos utilizando TrackArt 19 software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| População 1 (rápido) | População 2 (lento) | |||||||
| D 1 (mm 2 / seg) | Fração (%) | D 2 (mm 2 / seg) | Fração (%) | |||||
| Vidro | 1,840 ± 0,031 | 65,19 ± 0,56 | 0,006 ± 0,001 | 34,81 ± 0,56 | ||||
| Mica | 53,88 ± 0,26 | 0,176 ± 0,002 | 46,12 ± 0,26 | |||||
Tabela 1. Coeficientes de difusão. Resumo das estatísticas de difusão. Os coeficientes de difusão para as populações lentas e rápidas, e respectivas fracções. Os cálculos foram realizados em software TrackArt usando um modelo de dois população. Trajetórias foram reconhecidos e ligados utilizando Mosaic Particle Rastreador ImageJ plugin.
Figura animada :. moléculas individuais difusão Timelapse TIRFM filme de Esfingomielina-ATTO647N difundindo em uma bicamada DOPC suportado em vidro (esquerda) e mica (direita). Barra de escala é de 5 m.
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Discussion
Este protocolo descreve um método para a preparação de superfícies lisas e de mica fina para deposição de bicamada lipídica e de alta resolução de imagem. A técnica requer habilidades manuais mínimos, limitado principalmente para a desmontagem cuidadosa do sanduíche vidro-mica-vidro (passo 2.8), que é fundamental para a obtenção de uma superfície de mica de alta qualidade. A inspecção da mica clivada de fresco é sempre necessário, neste ponto, uma vez que é possível para a mica de separar da substância adesiva óptica, sem clivagem, deixando áreas expostas da substância adesiva óptica. Isso pode resultar na deposição indesejada da bicamada de adesivo, em vez de sobre a mica. A superfície de mica preparados usando o método descrito é, com poucas exceções paralelo à superfície da lamela, a julgar pelo uniforme de alta qualidade de imagem óptica obtivemos; que, portanto, não vê necessidade de uma verificação adicional.
A etapa final de montagem da câmara pode ser personalizado. O tutorial de vídeo mostra um1,5 ml de tampa de plástico frasco de vidro a ser usado como uma câmara, no entanto, este pode ser substituído com qualquer objecto de forma semelhante e as dimensões desejadas, por exemplo, para a imagiologia AFM-TIRFM/confocal simultâneo, em que a amostra com o seu titular tem a encaixar-se na cabeça de AFM . Montagem de uma câmara de costume pode ser ignorada, se imagem é para ser realizado usando um padrão, 35 milímetros câmara célula metal. Neste caso, no entanto, a 25 mm redondo de vidro de cobertura tem de ser usado, e de um volume muito maior de solução de lipossomas seria necessário para a formação de SLB.
Os resultados aqui apresentados mostram que a única molécula de imagiologia e de controlo pode ser feito facilmente em superfícies planas de mica extremamente finas o suficiente para ser passível de imagiologia TIRFM, de acordo com o protocolo descrito para a preparação da superfície. A mesma preparação pode ser aplicada a outras técnicas, incluindo a microscopia óptica de alta resolução, tais como espectroscopia de correlação de fluorescência de reflexão interna total (TIR-FCS). Importante, EBSL prepared da mesma forma (ou até mesmo as mesmas amostras exatas) pode ser usado em ambas as montagens experimentais, um critério essencial para a comparação direta dos resultados obtidos através de diferentes métodos, por exemplo, AFM, SMT, FCS, e FRAP.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores não têm confirmações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
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