Summary
我们提出了制备云母支持的脂质双层膜为高分辨率显微镜的方法。云母是在原子尺度透明且平坦，但很少采用，因为处理困难成像;我们的制剂导致的云母薄片甚至沉积，并且降低了在双分子层制备中使用的材料。
Abstract
支持的脂质双层（SLBs中）被广泛用作模型用于研究膜性能（相分离，聚类，动力学）及其与其它化合物，例如药物或肽的相互作用。然而SLB特性不同，取决于所使用的支持。
常用的技术为SLB成像和测量的单分子荧光显微镜，FCS和原子力显微镜（AFM）。因为大多数光学成像研究，进行了在玻璃支撑体，而AFM需要一个非常平坦的表面（通常是云母），从这些技术的结果不能直接相比，由于这些材料的电荷和平滑特性强烈影响扩散。遗憾的是，所需的切割和粘合薄片云母至载玻片手巧的高电平代表一个障碍，以常规使用的云母为SLB制剂。虽然这将是选择的方法，例如制备云母表面往往最终会被不均匀（波浪），不易形象，尤其是小的工作距离，高数值孔径透镜。在这里，我们提出了制备薄，平的云母表面的脂质囊泡沉积和SLB准备一个简单的和可重复的方法。此外，我们的定制室只需要非常小的体积小泡的SLB形成。整个过程结果的高效，简单和廉价的生产高品质的脂质双分子层表面可直接媲美AFM研究使用。
Introduction
本议定书的总体目标是展示了一种制备云母表面的云母支持的脂质双层（SLBs中）使用光学全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜，它也可以用原子力结合高分辨率成像显微镜（AFM）。
SLBs中是一种广泛使用的模型为脂质聚类，相分离，双层的元件或多肽，蛋白质或其他化合物1-5及其相互作用的动力学的大量研究。不同底物可能用于SLB形成（ 即玻璃，云母，二氧化硅，聚合物）取决于研究4,6-8的性质。典型的膜研究依赖于显微镜为基础的成像技术，如TIRFM和原子力显微镜。因此，对于TIRFM成像，在玻璃表面是一个典型的选择，因为玻璃是透明的。是玻璃的制备比较容易，其结果的质量，主要是通过彻底的清洗表面前脂质囊泡的沉积来确定。原子力显微镜由于其较高的轴向分辨率要求云母表面。云母是一种硅酸盐矿物，具有接近完美的底面解理。因此，新鲜剥离的云母是原子级平整，允许甚至在亚纳米尺度9观察膜的高度差。
使用方法如荧光相关光谱（FCS），单分子跟踪（SMT），和光漂白（FRAP）后荧光恢复扩散的研究表明然而，该脂质膜动力学很大程度上依赖于表面在其上它们被沉积的类型，由此玻璃和云母能给广泛变化的结果10,11。这些不同之处包括该膜的探针不仅扩散系数，也是粒子具有不同的速率扩散的分离群体的检测，以及可能不同的状态之间进行切换。
因此，使用TIRFM和AFM技术获得的结果的直接比较是经常有问题，除非在同一表面（本例中的云母）被使用。虽然有一些研究，其中TIRFM和AFM双层成像于同云母表面12,13进行，云母很少使用，主要是因为处理问题的光学显微镜。云母编制要求切割手工成薄传单，然后用光学胶12粘在盖玻片。然而，这种方法需要一些练习，以达到满意的效果。此外，所得到的表面常常是波浪形而厚，使得它们难以与低的工作距离，高数值孔径的透镜使用。
如在此协议中所述制备云母表面非常薄（〜220微米，其中包括170微米盖玻片厚度）和极其平坦，从而避免“起伏”，这对于成功的高分辨率成像是至关重要的。它们可以被用来为TIRFM或共聚焦设置。此外，同样的样品可以被转移到的原子力显微镜，甚至同时成像的TIRFM /共聚焦和原子力显微镜。结合这两种技术可以与双层膜结构14扩散行为直接相关。由于云母表面的新鲜原木，他们是干净的，不需要费时，重复性差，并且有潜在危险的清洗程序（玻璃清洗协议通常包括化学物质，如Piranha溶液，硫酸，氢氧化钠/氢氧化钾）。安装一个小室中，在协议中还描述的，可减少所需的有效双层形成为小于50μl的小泡的体积。最后，表面组装的全过程是不费时（准备时间不超过30分钟），并且不需要手工技能的高度一样，传统的云母解理和胶合。
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Protocol
1，云母和准备幻灯片
- 号广场1½（0.17毫米）到盖玻片染色架。
- 超声处理在60℃下在2％洗涤剂30分钟
- 用去离子水冲洗20次。
- 使用镊子去除幻灯片及吹干用压缩空气或氮气。
- 切云母片成10×10mm的正方形片用剪刀或刀片。
- 剪下每个云母片成用刀片2-3更薄传单。
注：此步骤需要使用锋利的刀片。
2，云母大会和会议厅安装
- 用乙醇清洁显微镜载玻片上。
- 云母胶切成单张步骤1.6到玻片上用光学胶。低粘度粘合剂应更好地传播下降和胶水的云母。
- 在紫外灯固化，10分钟。
注：粘合剂是由UV光具有最大吸收在350nm的范围内，以380nm的和推荐的能量固化的热曲IRED完全固化是4.5焦耳/厘米2。然而，不同的光源可用于本步骤（参见由粘合剂供应商提供的资料）。 - 通过消除与透明胶带最初几层露出干净的云母表面。
- 将光学胶小降（〜20微米）到云母表面。
注意：在这一步中，高粘度胶粘剂，低自发荧光水平建议。我们的经验表明，使用低（步骤2.2）和高粘度的粘合剂组合增加了显著成效云母分裂（步骤2.7）。 - 轻轻地放在刚清洗干净的盖玻片上的粘合剂的下降，避免产生气泡，让解决1分钟。
- 在紫外灯固化，10分钟。
注意：在此步骤之后，载玻片，云母和盖玻片的夹心可存放相当长的时间周期（长达数周）。继续下一个步骤只是实际SLB前的准备，以确保云母表面是新鲜的。
注：将粘合剂固化，UV光具有最大吸收在350的范围内，以380nm的和完全固化的推荐能量为4.5J/cm 2。然而，不同的光源可用于本步骤（参见由粘合剂供应商提供的资料）。 - 使用exacto刀，轻轻地从一边载玻片下马盖玻片所示的视频。在大多数情况下，薄且平坦层云母将保持附着在盖玻片。云母附着于载玻片可重复使用（从步骤2.4重复）。
- 检查表面质量用肉眼或在解剖显微镜下，以确保云母层仍粘在盖玻片和未分裂在步骤2.8中完全除去。做一个小的擦伤用钳子或解剖针将有助于其具有由云母可检测的不同浓度的粘合剂之间进行区分。
- 从1.5 ml的小瓶瓶盖取下橡胶密封和采用光学倒挂胶帽表面胶或指甲油，并用固化UV灯，或让空气干燥10分钟，分别。
注意：如果样品准备同步光（TIRFM或共焦）与原子力显微镜成像，1.5 ml的小瓶帽可能太小，无法安装原子力显微镜头显微镜舞台上。在这种情况下，帽可以由任何塑料O形环具有更大的直径，适于AFM头安装被取代。在实验时，需要不损伤云母表面上除去帽的情况下，可以用来代替胶或指甲油硅脂。
3，支持的脂质双分子层（SLB）的形成
- 将新鲜制备的脂质体溶液倒入腔与表面。需要SLB形成的最小体积为〜30微升。
注：有关脂质体和SLB形成更多详细信息，请参阅发布协议，如如袋等 ，2014 15。 - 请继续使用所需的协议负载均衡的形成。在孵化和成像，该腔室可以被放置在一个热块或加热的显微镜载物台上，以维持保持高于其熔融温度所用的脂质所需的温度。
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Representative Results
在SLBs中的荧光脂质探针的扩散行为是根据不同的衬底上。 TIRFM结合的SMT技术是可视化的粒子运动并提取它们的扩散系数的一种有价值的方法。一个鞘磷脂-ATTO647N探针扩散在DOPC（1,2 -二油酰-sn-甘油基-3 -磷酸胆碱）支承于玻璃和云母双层的单分子的信号显示在附加的动画人物。在云母表面被根据这里提出的方案制备。为了估计光学像差，半高（FWHM）全宽进行测量，并利用马赛克二维PSF尺寸ImageJ的插件16,17平均在20点扩散函数（PSF）。测得的半峰全宽为玻璃和云母为441nm和464nm分别（ 图1）。成像玻璃和云母之间的分辨率的22纳米差异并不显著。在这两种情况下，每一个单个荧光分子的PSF的质心可以被LOCAlized在连续的帧，并随着时间的推移马赛克粒子跟踪的ImageJ插件16,17链接到的粒子的轨迹。 图2给出了粒子穿过支持两个表面上的双层扩散的样本轨迹。荧光探针扩散在支撑在玻璃和云母DOPC膜的均方位移（MSDS）被绘制在图3中 ，由于多个种群2人口模型被用来提取快速和慢速扩散系数的共存，按照方法中所述由舒茨（ 图4，图5）18。的扩散系数和它们的级分，用TrackArt软件19提取并总结于表1中 。
从这个例子中，结果证明了两个单独的漫射探针的状态的存在：快速和慢速。快速人口的扩散系数是大约1.5倍云母比在玻璃上。然而，慢组分，是在玻璃上几乎不动的（<0.01 平方微米/秒），相比只有约1/10的人口迅速云母一个D。
图1。平均PSF尺寸。为20点玻璃（黑色实线）和云母（红色虚线）测定的平均PSF强度分布。在归一化强度对玻璃和云母的半最大值（FWHM）的整个宽度估计为441 nm和464 nm处，分别。的22nm的差异表明存在于这两个表面之间的成像分辨率无显著下降。用马赛克PSF 2D工具ImageJ的插件16,17 PSF强度分布进行了测量。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2示例轨迹。SM-ATTO647N样本轨迹扩散在支撑在玻璃（A）和云母（B）一种DOPC脂质双层。在玻璃支承双层，探针通常被固定在表面上，偶尔切换到快速扩散的状态。探针扩散在云母支撑双层，与此相反，也很少固定在表面上。相反，他们往往会快速和慢速扩散状态之间切换。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。均方位移。均方位移 SM-ATTO647N粒子扩散在目玻璃（■）和云母（●）支持DOPC双层。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。累积概率分布拟合。方位移的累积概率分布（CPD），适合用于SM-ATTO647N粒子扩散在玻璃（A）的双指数（双口）扩散模型和云母（B）的支持DOPC双层膜。分布和配合都只有第五延时（ΔT = 50毫秒）。计算和绘图使用TrackArt 19软件获得。平直“>请点击这里查看该图的放大版本。
图5。MSD和部分情节。MSD地块为快速（R 1 2）和慢速（R 2 2）扩散的人口和快速的人口（F 1）从CPD拟合计算出的分数。结果分别提出了SM-ATTO647N粒子扩散在玻璃（A）和云母（B）的支持DOPC双层。计算和绘图采用TrackArt 19软件获得。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 人口1（快） | 人口2（慢） | |||||||
| 日1（2微米/秒） | 分数（％） | D 2（μm的2 /秒） | 分数（％） | |||||
| 玻璃 | 1.840±0.031 | 65.19±0.56 | 0.006±0.001 | 34.81±0.56 | ||||
| 云母 | 53.88±0.26 | 0.176±0.002 | 46.12±0.26 | |||||
表1。扩散系数。摘要扩散的统计数据。扩散系数为慢速和快速的人口和他们的分数。计算是在TrackArt软件使用两群模型进行的。轨迹进行了确认，并采用马赛克粒子跟踪的ImageJ插件链接。
动画图 ：鞘磷脂-ATTO647N扩散在支撑在玻璃（左）和云母（右）的一个DOPC双层的单分子扩散间隔拍摄TIRFM电影。比例尺为5微米。
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Discussion
该协议描述了一种制备光滑而薄的云母表面的脂质双分子层沉积和高分辨率成像的方法。该技术只需要很少的手工技艺，大多限于仔细拆卸玻璃云母玻璃夹层（步骤2.8），这是获得高质量的云母表面至关重要的。总是需要新鲜剥离云母检查在这一点上，因为它有可能为云母，从光学粘合剂分离而没有解理，而使光学粘合剂的暴露区域。这可能导致在粘合剂而不是在云母上的双层的不必要的沉积。云母表面制备用描述的方法是除少数例外平行于盖玻片表面，我们所获得的均匀的高光学成像质量判定;因此，我们没有看到一个需要额外的验证。
在安装室的最后一步可定制。本视频教程显示了一个1.5毫升玻璃小瓶塑料盖被用来作为一个室中，然而，这可以具有类似形状的任何对象和所希望的尺寸被取代的， 例如 ，用于同步AFM-TIRFM/confocal成像，在这里有其持有者的样品具有装配到AFM头。安装一个自定义的腔室可以被跳过，如果成像是利用标准的，35毫米的金属电池腔室中进行。在这种情况下，然而，一个25毫米的圆形玻璃盖已被使用，并且将需要的SLB形成的脂质体溶液中的更大的体积。
这里给出的结果表明，单分子成像和跟踪，可以很容易地完成对极其平坦云母表面足够薄，以便能够进行TIRFM成像，根据本协议，用于描述表面处理。同一制剂可以应用于其他技术，包括高分辨率光学显微镜，如全内反射荧光相关光谱（TIR-FCS）。重要的是，SLBs的准备6246-02以同样的方式（甚至完全相同的样品）可以在两个实验装置用于，使用不同的方法， 例如原子力显微镜，SMT，FCS和FRAP获得的结果的直接比较的基本标准。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者没有确认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
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