Summary
我々は、高解像度の顕微鏡検査のために雲母支持された脂質二重層を調製する方法を提供する。マイカは、原子スケールで透明で平坦であるが、まれに、取り扱いの困難の撮影で使用されていません。我々の調製マイカシートの偶数堆積をもたらし、二層の調製に使用される材料を減少させる。
Abstract
サポートされている脂質二重層（のSLB）が広く膜特性（相分離、クラスタリング、ダイナミクス）およびこのような薬物またはペプチドなどの他の化合物との相互作用を研究するためのモデルとして使用される。しかしSLB特性は使用される支持によって異なります。
SLB画像化および測定のための一般的に使用される技術は、単一分子蛍光顕微鏡法、FCSおよび原子間力顕微鏡（AFM）である。 AFMは極めて平坦面（一般に雲母）を必要とするほとんどの光イメージング研究は、ガラス支持体上で実施されるため、これらの材料の電荷と平滑特性が強く拡散に影響を与えるので、これらの技術からの結果は、直接比較することはできない。残念ながら、スライドガラスに切断し、雲母の薄いスライスを接着するために必要な手先の器用さの高レベルは、SLBの準備のためのマイカの日常的な使用にハードルを提示します。これは選択の方法、そのような準備マイカになりますが表面は、多くの場合、特に小さなワーキングディスタンス、高開口数レンズを、凹凸（波線）と画像が困難になってしまう。ここでは、脂質小胞沈着およびSLBの準備のために、薄く平らな雲母表面を調製するためのシンプルかつ再現可能な方法を提示する。さらに、当社のカスタムメイドのチャンバーは、SLBの形成のための小胞の非常に小さなボリュームを必要とします。 AFM研究において使用されるものと直接比較され、高品質の脂質二重層表面の、効率的な簡単で安価な製造の全体的な手順をもたらす。
Introduction
本プロトコルの全体的な目標は、また原子間力と組み合わせることができる光全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）または共焦点顕微鏡を用いて雲母支持された脂質二重層（のSLB）の高分解能イメージングのために雲母表面を調製する方法を示すことである顕微鏡（AFM）。
のSLBは、脂質クラスタリング、相分離、ペプチド、タンパク質または他の化合物1-5との二重層成分またはそれらの相互作用の動力学の多くの研究のために広く使用されるモデルである。異なる基質は、研究4,6-8の性質に応じてSLB形成（ すなわち 、ガラス、雲母、二酸化ケイ素、ポリマー）のために使用され得る。典型的な膜の研究では、このようなTIRFMおよびAFMなどの顕微鏡ベースのイメージング技術に依存している。ガラスは透明であるので、従って、TIRFMイメージングのために、ガラス表面は、典型的な選択である。ガラスの製造は比較的容易であり、結果の質は、主に前脂質小胞の沈着に清掃の徹底面で決定。その高距離分解能によるAFMは、雲母表面を必要とします。マイカは完璧な基礎の切断に近いと、ケイ酸塩鉱物である。これにより、新たに切断された雲母が偶数サブナノメートルスケールで膜9の高さの差の観察を可能にする、原子的に平坦である。
（FRAP）の光退色後の、蛍光相関分光法（FCS）、（SMT）を追跡する単一分子、および蛍光回復などの方法を用いて拡散研究は、それによって、ガラス、脂質膜のダイナミクスは、それらが堆積される表面の種類に大きく依存することが示されたマイカは、広くさまざまな結果を10,11を与えることができます。これらの違いは、膜プローブの拡散係数でなく、異なる速度で拡散粒子の別個の集団の検出、およびおそらく異なる状態間の切り替えのみならず挙げられる。
このように、同じ表面（この場合マイカで）使用されない限り、TIRFMおよびAFM技術を用いて得られた結果の直接比較は、しばしば問題となる。 TIRFMおよびAFM二層イメージングは同じ雲母表面12,13上で実施されたいくつかの研究がありますが、マイカはほとんど主な原因の取り扱いの問題により、光学顕微鏡のために使用されていません。マイカの準備をして、光学接着剤12を使用してカバースリップに接着された薄いリーフレットの中に手で切断する必要があります。しかしながら、この方法は満足な結果を達成するために、いくつかの練習を必要とする。また、得られた表面は、それらが困難な低ワーキングディスタンス、高開口数レンズを使用すること、およびしばしば波状の厚さである。
このプロトコルに記載のように調製した雲母表面が成功した高分解能イメージングのため重要となる、「うねり」を避け、非常に薄い（〜220ミクロン、170ミクロンのカバーガラスの厚さを含む）と、非常に平坦である。それらを使用することができるTIRFMまたは共焦点セットアップ用。さらに、同じサンプルを、AFMに転送することができ、さらにはTIRFM /共焦点及びAFMと同時に画像化した。これら2つの手法を組み合わせることにより、二分子膜構造14との拡散挙動の直接的な相関関係が可能になります。雲母表面が新たに切断されるので、清潔で、（ガラス洗浄プロトコルは、通常、ピラニア溶液、硫酸ナトリウム/水酸化カリウムなどの化学物質を含む）時間がかかり、再現性に乏しい、潜在的に危険な清掃手順を必要としない。また、プロトコルに記載小室、の装着未満、50μlに効果的な二重層形成に必要な小胞の体積を減少させる。最後に、表面アセンブリの全体のプロセスは時間がかかるでない（調製物は、30分未満を要する）、および従来の、雲母切断および接着が行うように、操作の熟練度が高い必要としない。
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Protocol
1。マイカやスライドの準備
- 場所番号1.5（0.17ミリメートル）は、染色ラックにカバースリップ。
- 60℃で2％の洗剤中の30分間の超音波処理
- 脱イオン水で20回洗浄する。
- ピンセットを用いてスライドを削除して、圧縮空気や窒素を用いたドライ吹く。
- マイカシートをハサミやカミソリの刃を使用して10×10ミリメートル角に切る。
- カミソリの刃を使用して、2月3日より薄いリーフレットに各マイカピースをカット。
注：このステップでは、鋭い刃を使用する必要があります。
2。マイカ組み立てと装着室
- エタノールで、顕微鏡ガラススライドを清掃してください。
- 光学接着剤を用いてガラススライドに、ステップ1.6に切断した雲母の接着剤リーフレット。低粘度の接着剤は、より良いドロップを広げて、雲母を接着することをお勧めします。
- 、UVランプ下で10分間硬化させる。
NOTE：接着剤は、380nmから350の範囲の最大吸収とのrequ推奨されるエネルギーでUV光によって硬化される完全硬化のための赤外発光ダイオードは、4.5 J / cm 2である。しかしながら、異なる光源は、（接着剤供給業者によって提供される資料を参照）は、この工程のために使用することができる。 - スコッチテープで最初の数層を除去することにより、クリーンな雲母表面を露出。
- 雲母表面上に光学接着剤の小滴（〜20μm）を配置します。
注：このステップでは、低自家蛍光のレベルの高粘度の接着剤をお勧めします。我々の経験は、低（ステップ2.2）の組み合わせを用いて、高粘度の接着剤は著しくマイカ分割（ステップ2.7）の有効性を増加させることを示した。 - ゆっくりと1分間沈降させ、気泡を避けて、接着剤のドロップにしたばかりのきれいにカバースリップを配置。
- 、UVランプ下で10分間硬化させる。
注：このステップの後、スライドガラス、マイカ、カバースリップのサンドイッチは、（数週間まで）比較的長期間保存することができる。雲母表面が新鮮であることを確認するために、単に実際のSLBの準備の前に次のステップに進みます。
注：接着剤は、380nmから350の範囲の最大吸収をUV光で硬化させ、完全な硬化に必要なエネルギーが推奨さ4.5J/cm 2である。しかしながら、異なる光源は、（接着剤供給業者によって提供される資料を参照）は、この工程のために使用することができる。 - exactoナイフを使用して、ビデオのように優しく側のガラススライドからカバースリップをマウント解除。ほとんどの場合、マイカの薄くて平らな層がカバーガラスに付着したままになります。スライドガラスに付着雲母（ステップ2.4から繰り返す）再利用することができる。
- マイカ層がまだカバーグラスに接着され、ステップ2.8での分裂の際に、完全に除去されなかったことを確認するために、肉眼で、または解剖顕微鏡で表面品質を確認してください。ピンセットで細かい傷を作ったり、針を解剖すると、マイカとは検出異なる一貫性を持っている接着剤を区別するのに役立ちます。
- 1.5ミリリットルからゴム製のシールを取り外しバイアルキャップと光を用いて表面に逆さまにキャップを接着接着剤やマニキュア、UVランプで硬化、または空気が、それぞれ、10分を乾燥させます。
注：サンプルはAFMイメージングとの同時光学（TIRFMまたは共焦点）のために準備されている場合は、1.5ミリリットルバイアルキャップは、顕微鏡のステージ上でのAFMヘッドをマウントするには小さすぎる可能性があります。その場合、キャップは、AFMヘッドを取り付けるのに適した大きい直径を有する任意のプラスチック製のO-リングによって置換され得る。実験は、雲母表面を損傷することなく、キャップを除去する必要が場合には、シリコーングリースではなく、接着剤またはマニキュアを用いることもできる。
3。支持された脂質二重層（SLB）の形成
- 表面室に新たに調製したリポソーム溶液を配置します。 SLBの形成に必要な最小量は、約30μlのである。
注：リポソームおよびSLBの形成の詳細については、このようなバッグらなどのような公開されたプロトコルを参照してください、2014 15。 - 目的のプロトコルを使用して、SLBの形成を進める。インキュベーション中とイメージングは、チャンバは、熱ブロックまたはそれらの溶融温度以上使用されている脂質を維持するために必要な温度を維持するために加熱された顕微鏡ステージに配置することができる。
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Representative Results
のSLBにおける蛍光脂質プローブの拡散挙動は、基質に応じて異なる。 SMT技術と組み合わせたTIRFMは、粒子の動きを可視化し、それらの拡散係数を抽出するための有益な方法である。ガラスと雲母上に支持DOPC（1,2 -ジオレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン）二重層中に拡散するスフィンゴ-Atto647Nからプローブの単一分子信号が取り付けアニメーションの図に示されている。雲母表面は、ここに提示プロトコールに従って調製した。光学収差を推定するために、半値全幅（FWHM）を測定し、モザイク2D PSFサイズImageJのプラグ16,17を用いて20点広がり関数（PSF）にわたって平均した。ガラスと雲母のため、測定FWHMはそれぞれ441nmと464nm（ 図1）であった。ガラスと雲母上での結像の間の解像度の22nmノードの違いは重要ではありません。どちらの場合も、各単一蛍光分子のPSFの重心はLOCAすることができます連続したフレームにlized、モザイク粒子トラッカーImageJのプラグイン16,17と時間をかけて粒子軌道にリンク。 図2は、両面に支持二重層全体に拡散粒子のサンプル軌跡を示しています。ガラスと雲母上に支持DOPC膜中に拡散する蛍光プローブの平均二乗変位（MSDの）を図3にプロットした。により複数の集団の共存2つの集団モデルが記載されている方法に従って、高速および低速の拡散係数を抽出するために使用されたシュッツ（ 図4、図5）18による。拡散係数およびその画分をTrackArtソフトウェア19を使用して抽出し、表1にまとめる。
高速と低速：この例から得られた結果は、拡散プローブの2つの状態が存在することを証明する。速い人口の拡散係数はおよそ1であるガラスよりも雲母上0.5倍も高い。しかし遅い成分は、雲母上のみ〜1月10日、高速人口のDに比べて、（<0.01〜2 /秒）は、ガラスにはほとんど動かないです。
図1。平均PSFの大きさ。ガラス（黒実線）とマイカ（赤点線）で測定20スポットの平均PSFの強度プロファイル。ガラスと雲母のための規格化強度の半値全幅（FWHM）は、それぞれ、441 nmおよび464 nmと推定された。 22nmノード差は、これら2つの表面間の撮像分解能に有意の低下がないことを示している。 PSFの強度プロファイルは、モザイク、PSFの2DツールImageJのプラグイン16,17を用いて測定した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2の例軌跡。DOPCの脂質二重層ガラス上に支持さ（A）及びマイカ（B）中に拡散SM-Atto647Nからのサンプル軌跡。ガラス支持二重層上に、プローブは、しばしば、時折、高速散乱状態への切り替え、表面上に固定化される。マイカ支持二重層に拡散するプローブは、対照的に、まれに表面上に固定化されていません。その代わりに、高速および低速拡散状態を切り替える傾向にある。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。正方形の変位を意味している。正方形の変位平均 SM-Atto647Nからのガラス（■）上で拡散粒子と雲母（●）のメンツはDOPC二重層をサポートしていました。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。累積確率分布は正方形の変位の累積確率分布（CPD）をフィットし、ガラス（A）上で拡散するSM-Atto647Nから粒子の双指数関数（2集団）の拡散モデルに適合し、マイカ（B）がサポートDOPC二重層。ディストリビューションとフィットのみ五時間遅れ（ΔT = 50ミリ秒）のために表示されている。計算およびプロットはTrackArt 19ソフトウェアを使用して得られる。痩せ細っ ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
速い（R 1 2）と低速（R 2 2）拡散するための図5。MSDと端数プロット。MSDプロット人口とCPDのフィットから計算速い人口（F 1）の割合。ガラス（A）とマイカ（B）上で拡散するSM-Atto647Nから粒子がDOPC二重層をサポートするために結果が個別に表示されています。計算とプロットはTrackArt 19ソフトウェアを使用して得られた。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 人口1（高速） | 集団2（遅い） | |||||||
| D 1（以下2 /秒） | 分率（％） | D 2（以下2 /秒） | 分率（％） | |||||
| ガラス | 1.840±0.031 | 65.19±0.56 | 0.006±0.001 | 34.81±0.56 | ||||
| マイカ | 53.88±0.26 | 0.176±0.002 | 46.12±0.26 | |||||
表1。拡散係数 、 拡散統計情報の要約。低速と高速の集団及びその分別のための拡散係数。計算は、2つの集団モデルを用いTrackArtソフトウェアで行った。軌道はモザイク粒子トラッカーImageJのプラグインを使用して認識し、連結された。
アニメーション図 ：ガラス（左）とマイカ（右）でサポートされてDOPC二重層中に拡散するスフィンゴミエリンAtto647Nからの単一分子拡散タイムラプスTIRFM映画。スケールバーは5μmである。
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Discussion
このプロトコルは、脂質二重層の沈着及び高分解能イメージングのための滑らかで薄い雲母表面を調製するための方法が記載されている。技術は、主に高品質の雲母表面を得るために重要であるガラスマイカ - ガラスのサンドイッチ（ステップ2.8）、慎重に解体に限定最小限の手動スキルを必要とします。マイカは、切断せずに光学接着剤から剥離することが可能であるので、新たに切断された雲母の検査は、常に光学接着剤の露出領域を残して、この時点で必要とされる。つまり、接着剤ではなく、マイカに二重層の不要な堆積が発生する場合があります。雲母表面は、いくつかの例外を除き、我々が得一様に高い光学イメージング品質から判断すると、カバーグラスの表面に平行して説明した方法で使用して製造。したがって、我々は追加の検証の必要性を見ていない。
チャンバーの取り付けの最後のステップは、カスタマイズすることができます。ビデオチュートリアルを示し室として使用されている1.5ミリリットルガラスバイアルのプラスチックキャップが、しかしながら、これは任意の同様の形状の物体と所望の寸法で置換でき、そのホルダーを含むサンプルをAFMヘッドに適合しなければならない同時AFM-TIRFM/confocalイメージング用など 。撮像は、標準的な35mmの金属セルチャンバーを用いて実行する場合、カスタム·チャンバの装着をスキップすることができる。しかしながら、この場合、25mmの円形のカバーガラスを用いる必要があり、リポソーム溶液のはるかに大きな体積は、SLBの形成に必要とされるであろう。
ここに示す結果は、単一分子イメージング及び追跡を容易にした表面を調製するためのプロトコルに従って、TIRFM撮像に適しように十分に薄い極めて平坦なマイカ表面上に行うことができることを示している。同一の製剤は、全反射蛍光相関分光法（TIR-FCS）等の高分解能光学顕微鏡法を含む他の技術に適用することができる。重要なのは、のSLB準備同様に（又は更に正確に同じサンプル）でARED両方の実験装置で使用することができる、異なる方法を用いて得られた結果を直接比較するために不可欠な基準、 例えば、AFM、SMT、FCS、およびFRAP。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は全く確認応答がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al.
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P.
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
