Summary
Vi presenterar en metod för framställning av glimmer stöds lipiddubbelskikt för högupplöst mikroskopi. Glimmer är öppen och platt på atomnivå, men sällan i avbildning på grund av hantering av svårigheter; våra förberedelser resulterar i jämn avsättning av glimmerblad, och minskar det material som används i dubbellager beredning.
Abstract
Stöds lipidbiskikt (SLBs) används ofta som modell för att studera membranegenskaperna (fas separation, klustring, dynamik) och dess interaktion med andra föreningar, såsom läkemedel eller peptider. Men SLB egenskaper varierar beroende på det stöd som används.
Vanligen använda tekniker för SLB avbildning och mätningar är enda molekyl fluorescensmikroskopi, FCS och atomkraftsmikroskop (AFM). Eftersom de flesta optiska imaging studier utförs på ett glasstöd, medan AFM kräver en extremt platt yta (vanligtvis glimmer), kan resultaten från dessa tekniker inte jämföras direkt, eftersom de laddnings-och jämnhet egenskaperna hos dessa material starkt påverka diffusion. Tyvärr, den höga nivån av manuell skicklighet som krävs för kapning och limning tunna skivor av glimmer till objektglaset presenterar ett hinder för rutinmässig användning av glimmer för SLB beredning. Även om detta skulle vara den metod som föredras, såsom beredda glimmerytor hamnar ofta vara ojämn (vågigt) och svår bild, speciellt med små arbetsavstånd, hög numerisk bländare. Här presenterar vi en enkel och reproducerbar metod för framställning av tunna, platta glimmer ytor för lipidvesikel nedfall och SLB förberedelser. Dessutom kräver vår skräddarsydd kammare endast mycket små volymer av blåsor för SLB formation. De övergripande förfarande resulterar i en effektiv, enkel och billig produktion av högkvalitativa lipiddubbelskikts ytor som är direkt jämförbara med de som används i AFM studier.
Introduction
Det övergripande målet för det nuvarande protokollet är att visa en metod för framställning av glimmerytor för högupplöst avbildning av glimmer som stöds lipidbiskikt (SLBs) med optisk total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) eller konfokalmikroskopi, vilket också skulle kunna kombineras med atomkrafts microscopy (AFM).
SLBs är en allmänt använd modell för många studier av lipid klustring, fasseparation, dynamik tvåskiktsmembran komponenter eller deras interaktioner med peptider, proteiner eller andra föreningar 1-5. Olika substrat kan användas för SLB bildning (dvs glas, glimmer, kiseldioxid, polymerer) beroende på naturen av studien 4,6-8. Typiska membran studier är beroende av mikroskopi baserade avbildningstekniker, såsom TIRFM och AFM. Således, för TIRFM avbildning, är en glasyta ett typiskt val eftersom glas är genomskinligt. Framställning av glas är relativt lätt, och kvaliteten av resultaten är i första handbestäms av noggrann ytrengöring före deposition av lipid blåsor. AFM på grund av dess höga axiella upplösning kräver glimmer ytor. Glimmer är ett silikatmineral, med nära perfekt basal klyvning. Således är det nyligen kluvna glimmer atomärt platt, vilket gör att observation av membranhöjdskillnader även vid sub-nanometerskala 9.
Diffusion studier med metoder som fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), enda molekyl spårning (SMT), och fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) visade dock att lipid membrandynamik är starkt beroende av vilken typ av yta på vilken de har deponerats, varvid glas och glimmer kan ge mycket varierande resultat 10,11. Dessa skillnader omfattar inte bara diffusionskoefficienter av membran sonder, men också att upptäcka olika populationer av partiklar diffunderar med olika priser, och eventuellt byta mellan olika stater.
Sålundaden direkt jämförelse av resultat som erhållits med hjälp av TIRFM och AFM tekniker är ofta problematiskt, om inte samma yta (i detta fall glimmer) används. Även om det finns några studier där TIRFM och AFM tvåskikts avbildning genomfördes på samma glimmer yta 12,13, är glimmer sällan används för optisk mikroskopi, främst på grund av hanteringsproblem. Mica förberedelse kräver skärning för hand i tunna broschyrer, som sedan limmas på täckglas med hjälp av optisk lim 12. Denna metod kräver dock lite övning för att uppnå tillfredsställande resultat. Dessutom är de ytor som erhålls är ofta vågiga och tjock, vilket gör dem svåra att använda med låg arbetsavstånd, hög numerisk apertur linser.
Mica ytor framställda som beskrivs i detta protokoll är mycket tunna (~ 220 nm, inklusive täcktjocklek på 170 nm) och extremt platt, undvika "vågighet", vilket är avgörande för framgångsrik högupplösande avbildning. De kan användasför TIRFM eller konfokala inställningar. Dessutom kan samma prover överförs till AFM, och även avbildas samtidigt med TIRFM / konfokal och AFM. Att kombinera dessa två tekniker möjliggör direkt korrelation av diffusion beteende med tvåskiktsmembran struktur 14. Eftersom glimmer ytor är nyligen klyvs, de är rena och inte kräver tidskrävande, dåligt reproducerbar, och potentiellt farliga rengöringsrutiner (glasrengöringsprotokoll brukar innehålla kemikalier som Piranha-lösning, svavelsyra, natrium / kaliumhydroxid). Montering av en liten kammare, som också beskrivs i protokollet, minskar volymen av blåsor som krävs för en effektiv dubbellager bildas på mindre än 50 ^. Slutligen är inte tidskrävande (förberedelser tar mindre än 30 minuter), och inte kräver en hög grad av manuell skicklighet, liksom konventionell glimmer klyvning och limning hela processen för ytmontering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mica och diabilder Förberedelse
- Plats nr 1 ½ (0,17 mm) täckglas i färgningsställ.
- Sonikera under 30 min i 2% detergent vid 60 ° C.
- Tvätta 20 gånger med avjoniserat vatten.
- Ta bort diabilder med hjälp av pincett och blås torrt med tryckluft eller kväve.
- Skär glimmer plåt i 10 x 10 mm kvadratiska bitar med sax eller rakblad.
- Skär varje glimmer bit in 2-3 tunnare broschyrer med hjälp av rakblad.
OBS: Detta steg kräver användning av vass kniv.
2. Mica Montering och kammare Montering
- Rengör mikroskopisk glasskiva med etanol.
- Lim broschyr av glimmer skära i steg 1.6 till glasskiva med hjälp av optisk lim. Lim med låg viskositet rekommenderas att bättre sprida droppen och limma glimmer.
- Härda under UV-lampa, 10 min.
OBS: Adhesiv härdas genom UV-ljus med maximal absorption inom intervallet 350 till 380 nm och den rekommenderade energi requIRED för full härdning är 4,5 J / cm 2. Emellertid kan olika ljuskällor kan användas för detta steg (se material som tillhandahålls av limmet leverantör). - Exponera en ren glimmer yta genom att ta bort de första lager med tejp.
- Placera liten droppe (~ 20 | im) av optiskt bindemedel på glimmer ytan.
OBS: I detta steg, hög viskositet lim med låg autofluorescens nivå rekommenderas. Vår erfarenhet visar att med hjälp av en kombination av låga (steg 2,2) och hög viskositet lim ökar markant effektiviteten av glimmer uppdelning (steg 2,7). - Placera försiktigt nyligen rengjorda täckglas på droppe lim, undvika luftbubblor, låt nöja sig med 1 min.
- Härda under UV-lampa, 10 min.
OBS: Efter detta steg kan det smörgås av glasskiva, glimmer och täck lagras under en relativt lång tid (upp till några veckor). Gå vidare till nästa steg precis före själva SLB förberedelse, för att se till att glimmer ytan är färsk.
NOT: Adhesiv härdas genom UV-ljus med maximal absorption inom intervallet 350 till 380 nm och den rekommenderade energi som krävs för fullständig härdning är 4.5J/cm 2. Emellertid kan olika ljuskällor kan användas för detta steg (se material som tillhandahålls av limmet leverantör). - Använda en exacto kniv, försiktigt demontera täckglaset från sidoglas som visas i videon. I de flesta fall kommer en tunn och platt skikt av glimmer de sitter kvar på täckglas. Mica bifogas glasskiva kan återanvändas (upprepa från steg 2,4).
- Kontrollera ytkvalitet med blotta ögat eller under ett dissekera mikroskop, för att se till att glimmerskiktet fortfarande limmas på täckglas och fick inte bort helt under uppdelning i steg 2.8. Att göra en liten repa med en pincett eller dissekera nål kommer att bidra till att skilja mellan limmet som har ett påvisbart annan konsistens från glimmer.
- Ta bort gummitätningen från en 1,5 ml flaska lock och limma locket upp och ner till ytan med hjälp av optiskalim eller nagellack, och härdning med UV-lampa, eller låt lufttorka 10 minuter, respektive.
OBS: Om provet är förberedd för samtidig optisk (TIRFM eller konfokala) med AFM avbildning, kanske en 1,5 ml flaska lock vara för liten för att montera AFM huvudet på mikroskop scenen. I detta fall kan locket vara substituerad med någon plast O-ring med en större diameter, lämplig för AFM huvudet montage. I fallet när försöket kräver avlägsnande av locket utan att skada glimmerytan kan silikonfett användas i stället för lim eller nagellack.
3. Stöds lipiddubbelskikt (SLB) Bildning
- Placera nygjord liposomlösning in i kammare med yta. Den minimivolym som krävs för SLB bildning är ~ 30 pl.
OBS: För mer information om den liposomer och SLB formation, se publicerade protokoll, såsom till exempel Bag et al, 2014 15.. - Fortsätt med SLB formation med hjälp önskat protokoll. Under inkubation ochavbildning kan kammaren placeras i ett värmeblock eller uppvärmd mikroskop scenen för att bibehålla temperaturen som krävs för att hålla de lipider som används över deras smälttemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spridningen beteende fluorescerande lipid sonder i SLBs är olika beroende på underlaget. TIRFM kombination med SMT-tekniken är en värdefull metod för att visualisera partikelrörelser och utvinna sina diffusionskoefficienter. Enda molekyl signaler från en sfingomyelin-ATTO647N sond diffundera i en DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin) tvåskiktsmembran uppburen på glas och glimmer är visade på bifogade animerade figuren. Glimmer ytan framställdes i enlighet med det protokoll som presenteras här. För att uppskatta optiska aberrationer, var full bredd vid halva maximala (FWHM) mäts och medelvärde över 20 punktspridningsfunktion (PSF) med hjälp av Mosaic 2D PSF Storlek ImageJ plugin 16,17. Den uppmätta FWHM för glas och glimmer var 441nm och 464nm respektive (Figur 1). 22nm skillnaden i upplösning mellan avbildning på glas och glimmer är inte signifikant. I båda fallen kan PSF centroiden för varje enda fluorescerande molekyl vara locaserade i på varandra följande ramar, och länkas till partikelbanorna över tid med Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin 16,17. Figur 2 visar provbanor för partiklar diffunderar över dubbelskiktet stöds på båda ytorna. Medelkvadrat förskjutningar (MSD) av den fluorescerande proben som diffunderar i DOPC membran uppburet på glas och glimmer plottades på figur 3. På grund av samexistensen av multipla populationer två populationsmodell användes för att extrahera snabba och långsamma diffusionskoefficienter, enligt metoden som beskrivits genom Schutz (Figur 4, Figur 5) 18. De diffusionskoefficienter samt fraktioner extraherades med hjälp TrackArt programvara 19 och sammanfattas i tabell 1.
Resultaten från detta exempel visar att det finns två separata stater i diffuse sond: snabba och långsamma. Diffusionskoefficienten för den snabbt befolkningen är ungefär en0,5 gånger högre på glimmer än på glas. Den långsamma komponenten är dock nästan orörlig på glas (<0,01 ìm 2 / sek), jämfört med ett D på bara ~ 1/10 den fasta befolkningen på glimmer.
Figur 1. Genomsnittlig PSF storlek. Genomsnittlig PSF intensitetsprofilen för 20 fläckar mätta på glas (svart heldragen linje) och glimmer (röd streckad linje). Den full bredd vid halva maximala (FWHM) av den normaliserade intensiteten för glas och glimmer uppskattades till 441 nm och 464 nm, respektive. 22nm skillnaden indikerar att det inte finns någon betydande nedgång i bildbehandling upplösning mellan dessa två ytor. PSF intensitetsprofilen mättes med Mosaic PSF 2D Tool ImageJ plugin 16,17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel banor. Exempel banorna för SM-ATTO647N diffunderar i en DOPC lipiddubbelskikt uppburen på glas (A) och glimmer (B). På glas stöds biskikt är sonden ofta immobiliseras på ytan, ibland byta till den snabbt spridande tillstånd. Sonder diffunderar på glimmer stöd biskiktet däremot sällan immobiliserade på ytan. Istället tenderar de att växla mellan snabb och långsam spridningstillstånd. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Medelkvadrat förskjutningar. Mean square förskjutning kraven i SM-ATTO647N partiklar diffunderar på ett glas-(■) och glimmer-(●) stödde DOPC dubbelskiktet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kumulativ sannolikhetsfördelning passar. Kumulativ sannolikhetsfördelning (CPD) i kvadratiska förskjutningar och passar för bi-exponentiell (två-population) diffusion modell av SM-ATTO647N partiklar diffunderar på glas-(A) och glimmer-(B) stöds DOPC bilayers. Utdelning och passar presenteras endast för femte gången-lag (Δ t = 50 ms). Beräkningar och tomter erhålls med hjälp TrackArt 19 program.stripigt "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. MSD och fraktions tomter. MSD tomter för den snabba (r 1 2) och långsam (r 2 2) diffuse befolkning och del av den snabba befolknings (F 1) beräknas utifrån CPD passar. Resultaten redovisas separat för SM-ATTO647N partiklar diffunderar på glas-(A) och glimmer-(B) stöds DOPC dubbelskikt. Beräkningar och tomter erhölls med hjälp TrackArt 19 program. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Befolkning 1 (snabb) | Befolkning 2 (långsam) | |||||||
| D-1 (^ m 2 / s) | Fraktion (%) | D 2 (^ m 2 / s) | Fraktion (%) | |||||
| Glas | 1,840 ± 0,031 | 65,19 ± 0,56 | 0,006 ± 0,001 | 34,81 ± 0,56 | ||||
| Glimmer | 53,88 ± 0,26 | 0,176 ± 0,002 | 46,12 ± 0,26 | |||||
Tabell 1. Diffusionskoefficienter. Sammanfattning av diffusion statistik. Diffusionskoefficienter för långsamma och snabba befolkningsgrupper samt fraktioner. Beräkningar utfördes i TrackArt programvara med en två populationsmodell. Trajectories erkändes och kopplas med hjälp av Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin.
Animerad Bild :. Enstaka molekyler diffusion Timelapse TIRFM film av sfingomyelin-ATTO647N diffunderar i en DOPC dubbelskikt som stöds på glas (vänster) och glimmer (höger). Skala bar är 5 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för framställning av mjuka och tunna glimmerytor för lipiddubbelskikt nedfall och högupplösande avbildning. Tekniken kräver minimala manuella färdigheter, begränsad till största delen till den noggranna demontering av det glas glimmer-glass sandwich (steg 2,8), som är kritisk för att erhålla en hög kvalitet glimmer yta. Inspektion av den nyligen kluvna glimmer krävs alltid vid denna punkt, eftersom det är möjligt för glimmer att lossna från den optiskt bindemedel utan klyvning och lämnar exponerade områden av optiskt lim. Det kan leda till oönskad avsättning av dubbelskiktet på lim i stället för på glimmer. Den glimmer yta beredd att använda den metod som beskrivs är med få undantag parallellt med täckytan, att döma av enhetligt hög optisk bildkvalitet vi fått; vi därför inte ser ett behov av ytterligare kontroll.
Det sista steget i att montera kammaren kan anpassas. Video tutorial visar en1,5 ml glasampuU plastlocket som används som en kammare, men detta kan vara substituerad med något föremål av liknande form och önskade dimensioner, t ex för samtidig AFM-TIRFM/confocal avbildning, där provet med dess innehavare har att passa in i AFM huvudet . Montering av en anpassad kammare kan hoppas över, om avbildning är att utföras med användning av en standard, 35 mm metallcellkammare. I detta fall har emellertid en 25 mm runda täckglas som skall användas, och en mycket större volym av liposomlösningen skulle krävas för SLB bildning.
Resultaten som presenteras här visar att enda molekyl avbildning och spårning kan enkelt göras på extremt platta glimmer ytor tunna nog för att vara mottaglig för TIRFM bildbehandling, enligt protokollet för ytbehandling beskrivs. Samma preparat kan tillämpas på andra tekniker, inklusive hög upplösning optisk mikroskopi, såsom total inre reflektion fluorescens korrelationsspektroskopi (TIR-FCS). Huvudsakligen SLBs prepared på samma sätt (eller till och med exakt samma prov) kan användas i både experimentella uppställningar, ett viktigt kriterium för direkt jämförelse av resultat erhållna med olika metoder, t ex AFM, SMT, FCS, och FRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
