Summary
Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa.
Abstract
Bicapas lipídicas soportadas (SLBS) son ampliamente utilizados como modelo para el estudio de propiedades de la membrana (separación de fases, la agrupación, la dinámica) y su interacción con otros compuestos, como los fármacos o péptidos. Sin embargo las características SLB difieren dependiendo del soporte utilizado.
Técnicas utilizadas comúnmente para SLB óptica y mediciones son microscopía de fluorescencia de una sola molécula, de FCS y microscopía de fuerza atómica (AFM). Debido a que la mayoría de los estudios de formación de imágenes ópticas se llevan a cabo en un soporte de vidrio, mientras que AFM requiere una superficie extremadamente plana (generalmente de mica), los resultados de estas técnicas no se pueden comparar directamente, ya que las propiedades de carga y la suavidad de estos materiales influyen fuertemente en la difusión. Desafortunadamente, el alto nivel de destreza manual necesaria para el corte y pegado de láminas finas de mica para el portaobjetos de vidrio presenta un obstáculo para el uso rutinario de la mica para la preparación SLB. Aunque esto sería el método de elección, tales mica preparadosuperficies con frecuencia terminan siendo desigual (ondulado) y difícil de la imagen, especialmente con la pequeña distancia de trabajo, lentes de alta apertura numérica. Aquí presentamos un método simple y reproducible para la preparación de superficies planas delgadas de mica para la deposición de vesículas de lípidos y preparación SLB. Además, nuestra cámara por encargo requiere sólo pequeñas cantidades de vesículas para la formación de SLB. Los resultados del procedimiento general en la producción eficiente, simple y barato de superficies bicapa de lípidos de alta calidad que son directamente comparables a los utilizados en los estudios de AFM.
Introduction
El objetivo general del presente protocolo es mostrar un método para la preparación de superficies de mica de alta resolución de imagen de mica apoyados bicapas lipídicas (SLBS) mediante microscopía óptica total de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) o microscopía confocal, que también se podría combinar con la fuerza atómica microscopía (AFM).
SLBS son un modelo ampliamente utilizado para numerosos estudios de la agrupación de lípidos, la separación de fases, la dinámica de componentes de la bicapa o sus interacciones con péptidos, proteínas u otros compuestos 1-5. Diferentes sustratos pueden ser utilizados para la formación de SLB (es decir, vidrio, mica, dióxido de silicio, polímeros) dependiendo de la naturaleza del estudio 4,6-8. Estudios de membrana típicos se basan en técnicas de formación de imágenes basada en microscopía, tales como TIRFM y AFM. Por lo tanto, para obtener imágenes TIRFM, una superficie de vidrio es una opción típica porque el vidrio es transparente. Preparación de vidrio es relativamente fácil, y la calidad de los resultados es principalmentedeterminado por la superficie de limpieza a fondo antes de la deposición de las vesículas de lípidos. AFM, debido a su elevada resolución axial requiere superficies de mica. La mica es un mineral de silicato, con cerca de clivaje basal perfecto. Así, el recién exfoliados mica es atómicamente plana, lo que permite la observación de las diferencias de altura de la membrana, incluso a escala sub-nanométrica 9.
Los estudios de difusión utilizando métodos tales como la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), sola molécula de seguimiento (SMT), y la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) mostraron sin embargo, que la dinámica de la membrana de lípidos dependen en gran medida del tipo de superficie sobre la que se depositan, en el que el vidrio y la mica puede dar resultados muy variables 10,11. Estas diferencias incluyen no sólo los coeficientes de difusión de las sondas de membrana, sino también la detección de poblaciones separadas de las partículas que se difunden con diferentes tasas, y posiblemente la conmutación entre diferentes estados.
Por lo tanto,la comparación directa de los resultados obtenidos utilizando técnicas TIRFM y AFM es a menudo problemática, a menos que la misma superficie (en este caso la mica) se utiliza. Aunque hay algunos estudios en los que se llevó a cabo TIRFM y AFM de imágenes bicapa en la misma superficie de mica 12,13, mica se utiliza muy poco para la microscopía óptica, sobre todo debido a problemas de manejo. Preparación Mica requiere de corte a mano en folletos delgadas, que luego se pegan a la cubreobjetos usando adhesivo óptico 12. Este método, sin embargo requiere un poco de práctica para lograr resultados satisfactorios. Además, las superficies obtenidas son a menudo ondulado y grueso, lo que dificulta su uso con distancia de trabajo bajo, lentes de alta apertura numérica.
Superficies de mica preparados como se describe en este protocolo son muy delgadas (~ 220 m, incluyendo el espesor cubreobjetos de 170 m) y extremadamente plana, evitando "ondulación", que es fundamental para la imagen de alta resolución con éxito. Se pueden utilizarpara TIRFM o confocal configuraciones. Por otra parte, las mismas muestras se pueden transferir a AFM, e incluso reflejados simultáneamente con TIRFM / confocal y AFM. La combinación de estas dos técnicas permite la correlación directa de comportamiento de la difusión con la estructura 14 de la membrana bicapa. Debido a que las superficies de mica están recién troceados, que estén limpias y no requieren mucho tiempo, poco reproducibles, y los procedimientos de limpieza potencialmente peligrosos (protocolos de limpieza de vidrio por lo general incluyen productos químicos como solución Piranha, ácido sulfúrico, hidróxido de sodio / potasio). Montaje de una pequeña cámara, también se describe en el protocolo, reduce el volumen de vesículas necesarios para la formación de bicapa eficaz a menos de 50 l. Finalmente, todo el proceso de montaje de superficie no es mucho tiempo (preparación tarda menos de 30 min), y no requiere un alto grado de habilidad manual, al igual que la escisión de mica convencional y encolado.
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Protocol
1. Mica y Preparación Diapositivas
- Lugar N º 1 ½ (0,17 mm) en cubreobjetos gradilla de tinción.
- Someter a ultrasonidos durante 30 min en 2% de detergente a 60 ° C.
- Lavar 20 veces con agua desionizada.
- Retirar los portaobjetos usando pinzas y secar con aire comprimido o nitrógeno.
- Cortar la hoja de mica en 10 x 10 mm piezas cuadradas con unas tijeras o cuchilla de afeitar.
- Corte cada pedazo de mica en 2-3 foliolos delgados utilizando una hoja de afeitar.
NOTA: Este paso requiere el uso de la hoja afilada.
2. Asamblea Mica y la Cámara de montaje
- Limpio portaobjetos de vidrio microscópico con etanol.
- Pegamento folleto de mica cortado en el paso de 1,6 a portaobjetos de vidrio utilizando adhesivo óptico. Se aconseja adhesivo de baja viscosidad, para difundir mejor la caída y la cola de la mica.
- Curar bajo la lámpara UV, 10 min.
NOTA: El adhesivo se curó con luz UV con un máximo de absorción en el intervalo de 350 a 380 nm y la energía recomendada required para el curado total es de 4,5 J / cm 2. Sin embargo, diferentes fuentes de luz se pueden utilizar para este paso (ver materiales proporcionados por proveedor del adhesivo). - Exponer una superficie de mica limpio mediante la eliminación de las primeras capas con cinta Scotch.
- Coloque una pequeña gota (~ 20 m) de adhesivo óptico sobre la superficie de mica.
NOTA: En este paso, se aconseja alto pegamento viscosidad con bajo nivel de autofluorescencia. Nuestra experiencia ha demostrado que el uso de combinación de baja (paso 2.2) y los adhesivos de alta viscosidad aumenta significativamente la eficacia de la escisión mica (paso 2.7). - Coloque suavemente el cubreobjetos recién limpiada en la gota de adhesivo, evitando las burbujas de aire, dejar reposar durante 1 minuto.
- Curar bajo la lámpara UV, 10 min.
NOTA: después de este paso, el sándwich de lámina de vidrio, mica y cubreobjetos se puede almacenar durante un período relativamente largo de tiempo (hasta varias semanas). Continúe con el siguiente paso justo antes de la preparación efectiva SLB, para asegurarse de que la superficie de la mica es fresco.
NOTA: Adhesivo se cura por la luz UV con la máxima absorción en el intervalo de 350 a 380 nm y la energía recomendada necesaria para el curado completo es 4.5J/cm 2. Sin embargo, diferentes fuentes de luz se pueden utilizar para este paso (ver materiales proporcionados por proveedor del adhesivo). - Usando un cuchillo exacto, desmontar suavemente el cubreobjetos de portaobjetos de vidrio lateral como se muestra en el video. En la mayoría de los casos, una capa delgada y plana de la mica permanecerá unido a la cubreobjetos. Mica adjunta a portaobjetos de vidrio pueden ser reutilizados (repita desde el paso 2.4).
- Compruebe la calidad de la superficie a simple vista o bajo un microscopio de disección, para asegurarse de que la capa de mica está todavía pegada a la cubreobjetos y no se ha eliminado completamente durante la división en el paso 2.8. Haciendo un pequeño rasguño con una pinza o aguja de disección ayudará a distinguir entre el adhesivo que tiene una consistencia de forma detectable diferente de mica.
- Retire el sello de goma de un ml frasco tapa 1,5 y pegar la tapa boca abajo a la superficie utilizando ópticaadhesivo o esmalte de uñas, y curar con lámpara UV, o dejar secar al aire 10 minutos, respectivamente.
NOTA: Si se prepara la muestra para su uso simultáneo óptica (TIRFM o confocal) con imágenes de AFM, un ml frasco tapa 1.5 puede ser demasiado pequeño para montar la cabeza AFM en la platina del microscopio. En ese caso, la tapa podría ser sustituida por cualquier junta tórica de plástico con un diámetro más grande, adecuada para el montaje de la cabeza de AFM. En caso de que el experimento requiere quitar la tapa sin dañar la superficie de la mica, grasa de silicona se puede utilizar en lugar de pegamento o esmalte de uñas.
3. Apoyado bicapa lipídica (SLB) Formación
- Coloque solución de liposomas recién preparada en la cámara con la superficie. El volumen mínimo requerido para la formación de SLB es ~ 30 l.
NOTA: Para más detalles sobre el liposoma y la formación de SLB, se refieren a los protocolos publicados, como por ejemplo, bolsa y otros, 2014 15.. - Proceda con la formación de SLB con el protocolo deseado. Durante la incubación yde formación de imágenes, la cámara se puede colocar en un bloque de calor o platina del microscopio calentado para mantener la temperatura necesaria para mantener los lípidos que se utilizan por encima de su temperatura de fusión.
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Representative Results
El comportamiento de la difusión de sondas fluorescentes de lípidos en SLBS es diferente dependiendo del sustrato. TIRFM combinado con la técnica SMT es un método valioso para la visualización de movimientos de partículas y la extracción de sus coeficientes de difusión. Señales de moléculas individuales de una sonda de esfingomielina-ATTO647N de difusión en un DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) bicapa apoyado sobre el vidrio y mica se muestran en la figura animada adjunto. La superficie de la mica se preparó de acuerdo con el protocolo que se presenta aquí. Para estimar las aberraciones ópticas, se midió el ancho a la mitad del máximo (FWHM) y un promedio de más de la función de dispersión del punto 20 (PSF) utilizando Mosaico 2D PSF Tamaño ImageJ Plugin 16,17. El FWHM medido para el vidrio y mica eran 441nm y 464 nm, respectivamente (Figura 1). La diferencia en la resolución de 22 nm entre la formación de imágenes sobre el vidrio y mica no es significativa. En ambos casos, el centroide fibras discontinuas de poliéster de cada molécula fluorescente solo se puede LOCAlizado en cuadros sucesivos, y vinculado en trayectorias de las partículas con el tiempo con el mosaico de partículas Rastreador ImageJ plugin de 16,17. La figura 2 muestra las trayectorias de la muestra de partículas que se difunden a través de la bicapa soportada sobre ambas superficies. Los desplazamientos cuadráticos medios (MSD) de la sonda fluorescente de difusión en la membrana de DOPC apoyado sobre el vidrio y mica se representan en la Figura 3. Debido a la coexistencia de múltiples poblaciones de dos modelo de población se utilizó para extraer los coeficientes de difusión rápidos y lentos, según el método descrito por Schutz (Figura 4, Figura 5) 18. Los coeficientes de difusión, y sus fracciones se extrajeron utilizando el software TrackArt 19 y se resumen en la Tabla 1.
Los resultados de este ejemplo demuestran la existencia de dos estados separados de la sonda de difusión: rápido y lento. El coeficiente de difusión de la población rápido es más o menos 10,5 veces más alta en la mica que en el vidrio. Sin embargo, el componente lento, es casi inmóvil sobre el vidrio (<0,01 m 2 / seg), en comparación con una D de sólo ~ 1/10 la población rápido sobre mica.
Figura 1. Tamaño PSF media. Perfil Promedio intensidad PSF por 20 puntos medidos en el vidrio (línea continua negro) y mica (línea roja punteada). La anchura total a la mitad del máximo (FWHM) de la intensidad normalizada para el vidrio y mica se estimó en 441 nm y 464 nm, respectivamente. La diferencia de 22 nm indica que no hay ninguna caída significativa en la resolución de imagen entre estas dos superficies. Perfil de intensidad PSF se midió utilizando la herramienta Mosaico PSF 2D ImageJ plugin de 16,17. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Trayectorias de ejemplo. Trayectorias de ejemplo de SM-ATTO647N de difusión en una bicapa de lípidos DOPC apoyado sobre el vidrio (A) y de mica (B). En la bicapa de vidrio soportada, la sonda a menudo se inmoviliza sobre la superficie, de vez en cuando de conmutación al estado de difusión rápida. Sondas de difusión en la mica apoyado bicapa, en contraste, rara vez se inmovilizan en la superficie. En su lugar, tienden a cambiar de estado de difusión rápida y lenta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Media desplazamientos cuadrados. Desplazamiento cuadrático medio mentos de partículas SM-ATTO647N difunden en un vidrio (■) y mica (●) apoyó DOPC bicapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Distribución de probabilidad acumulativa se ajusta. Distribución de probabilidad acumulativa (CPD) de desplazamientos cuadrados y se ajusta para el modelo de difusión biexponencial (dos población) de las partículas SM-ATTO647N de difusión sobre el vidrio-(A) y la mica-(B) apoyó bicapas DOPC. Distribuciones y ajustes sólo se presentan por quinta vez-lag (Δ t = 50 ms). Los cálculos y las parcelas se obtienen utilizando el software TrackArt 19.lacio "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Parcelas Figura 5. MSD y parcelas de fracciones. MSD para el ayuno (r 1 2) y lento (r 2 2) la difusión de la población y la fracción de la población rápido (F 1), calculado a partir de los ataques de DPC. Los resultados se presentan por separado para partículas SM-ATTO647N de difusión sobre el vidrio-(A) y la mica-(B) apoyados bicapas DOPC. Los cálculos y las parcelas se obtuvieron utilizando software TrackArt 19. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Población 1 (rápido) | Población 2 (lento) | |||||||
| D 1 (2 m / seg) | Fracción (%) | D 2 (2 m / seg) | Fracción (%) | |||||
| Vidrio | 1,840 ± 0,031 | 65,19 ± 0,56 | 0,006 ± 0,001 | 34,81 ± 0,56 | ||||
| Mica | 53.88 ± 0.26 | 0,176 ± 0,002 | 46.12 ± 0.26 | |||||
Tabla 1. Los coeficientes de difusión. Resumen de las estadísticas de difusión. Los coeficientes de difusión para las poblaciones lentos y rápidos, y sus fracciones. Los cálculos se realizaron en el software TrackArt usando un modelo de dos población. Trayectorias fueron reconocidos y vinculados mediante mosaico de partículas Rastreador ImageJ plugin.
Figura Animado :. difusión moléculas individuales película Timelapse TIRFM de esfingomielina-ATTO647N difusión en una bicapa DOPC apoyado sobre vidrio (izquierda) y la mica (derecha). La barra de escala es de 5 micras.
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Discussion
Este protocolo describe un método para la preparación de superficies lisas y finas de mica para la deposición de bicapa de lípidos y formación de imágenes de alta resolución. La técnica requiere habilidades manuales mínimas, limitadas principalmente a la desmontaje cuidadoso de la sándwich de vidrio-mica y vidrio (paso 2.8), que es crítico para la obtención de una superficie de mica de alta calidad. Inspección de la mica recién escindido siempre se requiere en este punto, ya que es posible para la mica se desprenda del adhesivo óptico sin escindir, dejando las áreas expuestas de adhesivo óptico. Eso podría resultar en el depósito no deseado de la bicapa de adhesivo en lugar de en la mica. La superficie de mica preparada según el método descrito es, con pocas excepciones paralelas a la superficie cubreobjetos, a juzgar por la alta calidad y uniformidad de imagen óptica que obtuvimos; por lo tanto, no vemos la necesidad de una verificación adicional.
El último paso en el montaje de la cámara se puede personalizar. El tutorial de vídeo muestra una1,5 ml tapa de plástico vial de vidrio que se utiliza como una cámara, sin embargo esto puede ser sustituido con cualquier objeto de forma similar y dimensiones deseadas, por ejemplo, para formación de imágenes AFM-TIRFM/confocal simultánea, donde la muestra con su soporte tiene que encajar en la cabeza AFM . Montaje de una cámara de encargo se pueden saltar, si la imagen se va a realizar utilizando un estándar, 35 mm cámara de la celda de metal. En este caso, sin embargo, un 25 milímetros de vidrio cubierta redonda tiene que ser usado, y un volumen mucho más grande de solución de liposomas se requiere para la formación SLB.
Los resultados presentados aquí muestran que la única molécula de formación de imágenes y de seguimiento se puede hacer fácilmente en superficies de mica extremadamente planas lo suficientemente delgadas para ser susceptibles de formación de imágenes TIRFM, de acuerdo con el protocolo descrito para la preparación de la superficie. La misma preparación se puede aplicar a otras técnicas, incluyendo la microscopía óptica de alta resolución, tales como espectroscopia de correlación de fluorescencia de reflexión interna total (TIR-FCS). Es importante destacar que, SLBS Prepared de la misma manera (o incluso las mismas muestras exactas) puede ser utilizado en ambas configuraciones experimentales, un criterio esencial para la comparación directa de los resultados obtenidos usando diferentes métodos, por ejemplo, AFM, SMT, FCS, y FRAP.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
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