Summary
Nous présentons une méthode de préparation de mica soutenu bicouches lipidiques pour microscopie à haute résolution. Mica est transparent et plat à l'échelle atomique, mais rarement utilisé dans l'imagerie en raison des difficultés de manipulation; notre préparation résulte en un dépôt régulier de la feuille de mica, et de réduire la matière utilisée dans la préparation de bicouche.
Abstract
Bicouches lipidiques supportées (BLP) sont largement utilisés comme un modèle pour l'étude des propriétés de la membrane (de séparation de phase, regroupement, dynamique) et son interaction avec d'autres composés, tels que des médicaments ou des peptides. Cependant caractéristiques SLB diffèrent selon le support utilisé.
Techniques couramment utilisées pour l'imagerie SLB seul et les mesures sont la microscopie de fluorescence de la molécule, FCS et microscopie à force atomique (AFM). Parce que la plupart des études d'imagerie optique sont réalisées sur un support en verre, tandis que l'AFM nécessite une surface extrêmement plate (généralement de mica), les résultats de ces techniques ne peuvent pas être comparés directement, étant donné que les propriétés de charge et la douceur de ces matériaux influencent fortement la diffusion. Malheureusement, le niveau élevé de la dextérité manuelle nécessaire pour le découpage et le collage de fines tranches de mica à la lame de verre présente un obstacle à l'utilisation systématique de mica pour la préparation SLB. Bien que ce serait la méthode de choix, par exemple le mica préparésurfaces finissent souvent par être inégale (ondulé) et difficile à l'image, en particulier avec la petite distance de travail, des lentilles de grande ouverture numérique. Nous présentons ici une méthode simple et reproductible pour la préparation minces, les surfaces de mica plats pour le dépôt de la vésicule lipidique et la préparation SLB. De plus, notre chambre sur mesure ne nécessite que de très petits volumes de vésicules de formation SLB. Les résultats de la procédure globale de la production efficace, simple et peu coûteux de surfaces de bicouche lipidique de haute qualité qui sont directement comparables à celles utilisées dans les études de l'AFM.
Introduction
L'objectif global du présent Protocole est de montrer une méthode pour la préparation des surfaces de mica pour l'imagerie haute résolution de mica soutenu bicouches lipidiques (BLP) à l'aide de la microscopie optique de fluorescence totale de réflexion interne (TIRFM) ou la microscopie confocale, qui pourrait également être combiné avec force atomique microscopie (AFM).
BLP sont un modèle largement utilisé pour de nombreuses études de groupement lipidique, séparation des phases, la dynamique des composants de bicouche ou de leurs interactions avec des peptides, des protéines ou d'autres composés 5.1. Différents substrats peuvent être utilisés pour la formation SLB (c.-à-verre, le mica, le dioxyde de silicium, des polymères) en fonction de la nature de l'étude 4,6-8. Des études de membranes typiques reposent sur des techniques d'imagerie à base de microscopie, tels que TIRFM et AFM. Ainsi, pour l'imagerie par TIRFM, une surface de verre est un choix typique parce que le verre est transparent. Préparation de verre est relativement facile, et la qualité des résultats est essentiellementdéterminé par la surface de nettoyage en profondeur avant le dépôt de vésicules lipidiques. AFM en raison de sa haute résolution axiale nécessite des surfaces de mica. Mica est un minéral de silicate, avec près de parfait clivage basal. Ainsi, le mica fraîchement clivé est atomiquement plat, permettant l'observation des différences de hauteur de la membrane même à l'échelle sub-nanométrique 9.
études sur la diffusion en utilisant des méthodes telles que la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), seul le suivi molécule (SMT), et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré cependant que la dynamique de la membrane lipidique dépendent fortement du type de surface sur laquelle ils sont déposés, lequel verre et le mica peut donner des résultats très différents 10,11. Ces différences comprennent non seulement les coefficients de diffusion des sondes membranaires, mais aussi la détection des populations distinctes de particules diffusantes avec des vitesses différentes, et éventuellement entre les différents états de commutation.
Ainsi,la comparaison directe des résultats obtenus en utilisant des techniques de TIRFM et AFM est souvent problématique, à moins que la même surface (dans ce cas, mica) est utilisé. Bien qu'il existe quelques études où TIRFM et AFM bicouche imagerie a été effectuée sur la même surface de mica 12,13, mica est rarement utilisé pour la microscopie optique, la plupart du temps en raison de problèmes de manutention. préparation de Mica nécessite la coupe à la main en folioles minces, qui sont ensuite collées sur la lamelle en utilisant un adhésif optique 12. Cette méthode nécessite cependant une certaine pratique pour obtenir des résultats satisfaisants. En outre, les surfaces obtenues sont souvent ondulés et épais, ce qui les rend difficiles à utiliser à faible distance de travail, des lentilles de grande ouverture numérique.
Surfaces de mica préparés comme décrit dans ce protocole sont très minces (~ 220 um, y compris l'épaisseur de la lamelle de 170 um) et extrêmement plat, en évitant "ondulation", ce qui est essentiel pour la réussite de l'imagerie de haute résolution. Ils peuvent être utiliséspour TIRFM ou confocale configurations. De plus, les mêmes échantillons peuvent être transférés à l'AFM, et même imagées simultanément avec TIRFM / confocale et AFM. La combinaison de ces deux techniques permet une corrélation directe du comportement de diffusion avec la structure de membrane à double couche 14. Parce que les surfaces de mica sont fraîchement coupés, ils sont propres et ne nécessitent pas beaucoup de temps, peu reproductible, et les procédures de nettoyage potentiellement dangereuses (protocoles de nettoyage de verre sont habituellement des produits chimiques tels que solution Piranha, l'acide sulfurique, hydroxyde de sodium / potassium). Montage d'une petite chambre, également décrit dans le protocole, de réduire le volume des vésicules nécessaires à la formation de la bicouche efficace à moins de 50 pi. Enfin, l'ensemble du processus de montage de surface n'est pas de temps (préparation prend moins de 30 minutes), et ne nécessite pas un degré élevé d'habileté manuelle, de même que le clivage du mica et de collage classique.
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Protocol
1. Mica et diapositives Préparation
- Lieu n ° 1 ½ (0,17 mm) des lamelles couvre en support de coloration.
- Ultrasons pendant 30 min à 2% de détergent à 60 ° C.
- Laver 20 fois avec de l'eau désionisée.
- Retirer les lames en utilisant des pinces et sécher à l'air comprimé ou de l'azote.
- Couper la feuille de mica en 10 x 10 mm morceaux carrés à l'aide de ciseaux ou d'une lame de rasoir.
- Couper chaque morceau de mica en 2-3 folioles minces en utilisant une lame de rasoir.
NOTE: Cette étape nécessite l'utilisation de lame tranchante.
2. Assemblée Mica et de la Chambre de montage
- Clean lame de verre microscopiques avec de l'éthanol.
- Colle notice de mica couper à l'étape 1.6 de lame de verre avec de la colle optique. Adhésif à faible viscosité est conseillé de mieux étaler la goutte et coller le mica.
- Durcir sous la lampe UV, 10 min.
NOTE: L'adhésif est durci par la lumière UV avec une absorption maximale dans la plage de 350 à 380 nm et l'énergie recommandé requIRED pour la guérison complète est de 4,5 J / cm 2. Cependant, les différentes sources de lumière peuvent être utilisés pour cette étape (voir documents fournis par le fournisseur de l'adhésif). - Exposer une surface de mica nettoyer en enlevant les quelques premières couches avec du scotch.
- Placer petite goutte (~ 20 um) d'adhésif optique sur la surface du mica.
NOTE: A ce stade, colle à haute viscosité avec le niveau d'autofluorescence faible est conseillé. Notre expérience a montré que l'utilisation de la combinaison de bas (étape 2.2) et les adhésifs haute viscosité augmente de manière significative l'efficacité de mica fractionnement (étape 2.7). - Placer doucement la lamelle fraîchement nettoyée sur la goutte de colle, en évitant les bulles d'air, laisser reposer pendant 1 min.
- Durcir sous la lampe UV, 10 min.
REMARQUE: après cette étape, le sandwich de lame de verre, le mica et la lamelle peut être stocké pendant une relativement longue période de temps (jusqu'à quelques semaines). Passez à l'étape suivante, juste avant la préparation SLB réelle, pour s'assurer que la surface du mica est frais.
REMARQUE: Adhésif est durci par la lumière UV avec une absorption maximale de l'ordre de 350 à 380 nm et l'énergie recommandé nécessaire pour la guérison complète est 4.5J/cm 2. Cependant, les différentes sources de lumière peuvent être utilisés pour cette étape (voir documents fournis par le fournisseur de l'adhésif). - L'aide d'un couteau exacto, démonter doucement la lamelle de lame de verre de côté comme le montre la vidéo. Dans la plupart des cas, une couche mince et plat de mica restera attaché à la lamelle. Mica attaché à lame de verre peut être réutilisé (répéter l'étape 2.4).
- Vérifier la qualité de surface à l'oeil nu ou sous un microscope à dissection, afin de s'assurer que la couche de mica est encore collée sur la lamelle couvre-objet et n'a pas été complètement enlevé au cours de fractionnement à l'étape 2.8. Faire une petite égratignure avec une pince à dissection ou aiguille aidera à distinguer entre l'adhésif qui a une consistance détectable différente de mica.
- Retirer le joint en caoutchouc du flacon d'un plafond de 1,5 ml et coller le bouchon à l'envers à la surface à l'aide optiqueadhésif ou vernis à ongles, et traitement avec la lampe UV, ou laissez sécher à l'air 10 min, respectivement.
NOTE: Si l'échantillon est préparé pour une utilisation simultanée optique (TIRFM ou confocale) avec l'imagerie AFM, un ml flacon plafond de 1,5 pourrait être trop petit pour monter la tête AFM sur la platine du microscope. Dans ce cas, le bouchon peut être substitué par un joint torique en plastique avec un diamètre plus grand, adapté pour le montage tête AFM. Dans le cas où l'expérience, il faut enlever le bouchon sans endommager la surface de mica, de la graisse de silicone peut être utilisé à la place de la colle ou le vernis à ongles.
3. Pris en charge bicouche lipidique (SLB) Formation
- Placez solution de liposomes fraîchement préparé dans la chambre avec la surface. Le volume minimum requis pour la formation SLB est ~ 30 pl.
NOTE: Pour plus de détails sur le liposome et formation SLB, se référer aux protocoles publiés, tels que tels que sac et al, 2014 15.. - Procéder à la formation SLB utilisant le protocole souhaité. Pendant l'incubation etl'imagerie, la chambre peut être placé dans un bloc thermique ou platine chauffante de microscope pour maintenir une température requise pour maintenir les lipides utilisés au-dessus de leur température de fusion.
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Representative Results
Le comportement de diffusion de sondes lipidiques fluorescents dans BLP est différente en fonction du substrat. TIRFM combinée avec la technique SMT est une méthode utile pour visualiser les mouvements de particules et d'extraire leurs coefficients de diffusion. Signaux de molécules simples d'une sonde Sphingomyelin-ATTO647N diffusant dans un DOPC (1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) bicouche supportée sur verre et le mica sont indiqués sur la figure ci-jointe animée. La surface de mica a été préparé selon le protocole présenté ici. Pour estimer les aberrations optiques, largeur à mi-hauteur (LMH) a été mesurée et calculée sur la fonction 20 d'étalement de point (PSF) en utilisant la mosaïque 2D PSF Taille du plugin ImageJ 16,17. Le FWHM mesurée pour le verre et le mica sont 441nm et 464nm, respectivement (Figure 1). La différence de résolution entre 22 nm dans l'imagerie sur le verre et le mica n'est pas significative. Dans les deux cas, le centre de gravité de la PSF de chaque molécule fluorescente unique peut être Localisée dans des trames successives, et lié dans les trajectoires des particules au cours du temps avec Mosaic particules Tracker ImageJ Plugin 16,17. figure 2 montre les trajectoires échantillons de particules diffusantes à travers la bicouche supportée sur les deux surfaces. Les déplacements quadratiques moyennes (TMS) de la sonde fluorescente diffusant dans la membrane DOPC supporté sur le verre et le mica a été tracées sur la Figure 3. En raison de la coexistence de populations multiples de deux modèle de population a été utilisé pour extraire les coefficients de diffusion lente et rapide, selon la méthode décrite par Schutz (Figure 4, Figure 5) 18. Les coefficients de diffusion et les fractions ont été extraits en utilisant un logiciel de TrackArt et 19 sont résumés dans le tableau 1.
Les résultats de cet exemple prouve l'existence de deux Etats séparés de la sonde de diffusion: rapide et lente. Le coefficient de diffusion rapide de la population est d'environ 10,5 fois plus élevé de mica que sur le verre. La composante lente est cependant presque immobile sur le verre (<0,01 pm 2 / s), par rapport à une dimension de seulement environ 1/10 de la population rapide sur du mica.
Figure 1. Taille de PSF moyenne. Profil moyen de l'intensité de la PSF pour 20 points mesurés sur verre (ligne noire) et le mica (ligne rouge pointillée). La largeur à mi-hauteur (FWHM) de l'intensité normalisée pour le verre et le mica a été estimée à 441 nm et 464 nm, respectivement. La différence de 22 nm indique qu'il n'y a pas de baisse significative de la résolution d'image entre ces deux surfaces. profil d'intensité de PSF a été mesurée à l'aide Mosaïque PSF 2D outil ImageJ Plugin 16,17. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Des trajectoires d'exemples. Des trajectoires d'exemples de SM-ATTO647N diffusantes dans une bicouche lipidique DOPC supporté sur le verre (A) et de mica (B). Sur le verre bicouche supportée, la sonde est souvent immobilisé sur la surface, à l'occasion de passer à l'état diffusant rapidement. Sondes de diffusion sur le mica bicouche supportée, en revanche, sont rarement immobilisés sur la surface. Au lieu de cela, ils ont tendance à basculer entre l'état de diffusion rapide et lente. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Moyenne des déplacements carrés. Déplacement carré moyen ments de particules SM-ATTO647N diffusant sur un verre (■) et de mica (●) soutenu DOPC bicouche. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Distribution de probabilité cumulative convient. Distribution de probabilité cumulative (DPC) des déplacements carrés et convient pour la bi-exponentielle (deux population) modèle de diffusion de particules SM-ATTO647N diffusant sur verre (A) et le mica (B) pris en charge bicouches DOPC. Les distributions et les crises ne sont présentés que pour la cinquième fois décalage (Δ t = 50 ms). Les calculs et les parcelles sont obtenus en utilisant un logiciel TrackArt 19.maigre "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Parcelles Figure 5. MSD et parcelles de fractions. TMS pour le jeûne (r 1 2) et lent (r 2 2) diffusant la population et de la fraction de la population rapide (F 1) calculé à partir des ajustements de DPC. Les résultats sont présentés séparément pour les particules SM-ATTO647N diffusant sur verre (A) et le mica (B) pris en charge bicouches DOPC. Les calculs et les dessins ont été obtenus en utilisant un logiciel TrackArt 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Population 1 (rapide) | Population 2 (lent) | |||||||
| D 1 (2 um / sec) | Fraction (%) | D 2 (2 um / sec) | Fraction (%) | |||||
| Verre | 1.840 ± 0.031 | 65,19 ± 0,56 | 0,006 ± 0,001 | 34,81 ± 0,56 | ||||
| Mica | 53,88 ± 0,26 | 0,176 ± 0,002 | 46,12 ± 0,26 | |||||
Tableau 1. Des coefficients de diffusion. Résumé des statistiques de diffusion. Les coefficients de diffusion pour les populations lents et rapides et leurs fractions. Les calculs ont été effectués en utilisant le logiciel TrackArt un modèle de population deux. Trajectoires ont été reconnus et liés à l'aide Mosaïque particules Tracker ImageJ plugin.
Figure animée :. molécules simples diffusion vidéo Timelapse TIRFM de Sphingomyelin-ATTO647N diffusant dans une bicouche de DOPC appuyé sur le verre (à gauche) et le mica (à droite). La barre d'échelle est de 5 um.
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Discussion
Ce protocole décrit un procédé pour la préparation de surfaces de mica lisses et minces pour le dépôt de la bicouche lipidique et l'imagerie haute résolution. La technique nécessite des compétences manuelles minimales, limitées essentiellement à la démontage attention du sandwich verre-verre-mica (étape 2.8), ce qui est essentiel pour obtenir une surface de mica de haute qualité. L'inspection du mica fraîchement clivé est toujours nécessaire, à ce stade, car il est possible que le mica se détacher de l'adhésif optique sans cliver, en laissant les zones exposées de la colle optique. Cela pourrait entraîner un dépôt indésirable de la bicouche sur adhésif plutôt que sur le mica. La surface de mica préparé selon la méthode décrite est à quelques exceptions près parallèles à la surface de la lamelle, à en juger par la qualité de l'imagerie optique uniformément élevé, nous avons obtenu; par conséquent, nous ne voyons pas la nécessité d'une vérification supplémentaire.
L'étape finale de montage de la chambre peut être personnalisée. Le tutoriel vidéo montre un1,5 ml flacon en verre bouchon en plastique utilisé comme une chambre, mais cela peut être remplacé par n'importe quel objet de forme similaire et les dimensions souhaitées, par exemple pour l'imagerie AFM-TIRFM/confocal simultanée, où l'échantillon avec son titulaire doit s'inscrire dans la tête AFM . Montage d'une chambre de produits peuvent être omis, si l'imagerie doit être effectuée en utilisant un étalon, la chambre de cellule de métal de 35 mm. Dans ce cas cependant, une lamelle couvre-objet rondes de 25 mm doit être utilisé, et un beaucoup plus grand volume de solution de liposome serait requise pour la formation SLB.
Les résultats présentés ici montrent que l'imagerie d'une seule molécule et le suivi peuvent se faire facilement sur des surfaces de mica extrêmement plat, assez minces pour être prête à l'imagerie TIRFM, selon le protocole de préparation de surface décrit. La même préparation peut être appliquée à d'autres techniques, notamment la microscopie optique à haute résolution, telles que la spectroscopie à corrélation de fluorescence réflexion interne totale (TIR-FCS). Surtout, BLP préparationared de la même manière (ou même les mêmes échantillons exactes) peuvent être utilisés dans les deux configurations expérimentales, un critère essentiel pour la comparaison directe des résultats obtenus en utilisant différentes méthodes, par exemple AFM, SMT, FCS, et PAF.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs n'ont aucun remerciements.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
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