Optogenetic Stimulering af hørenerven

Summary

Cochlear implants (CIS) gør det muligt at høre ved direkte elektrisk stimulation af hørenerven. , Dårlig hyppighed og intensitet opløsning begrænser imidlertid kvaliteten af ​​at høre med kreditinstitutter. Her beskriver vi optogenetic stimulering af hørenerven i mus som en alternativ strategi for auditiv forskning og udvikling af fremtidige kreditinstitutter.

Abstract

Direkte elektrisk stimulation af spiral ganglion neuroner (SGNs) ved cochlear implantater (CIS) giver mulighed for åben taleforståelse i de fleste implanterede døve fag ^{1- 6.} Ikke desto mindre, lyd kodning med aktuelle CIs har dårlig frekvens og intensitet opløsning på grund af en bred strøm spredes fra hver elektrode kontakt aktiverer et stort antal SGNs langs tonotopic akse cochlea ^{7- 9.} Foreslås Optisk stimulation som et alternativ til elektrisk stimulering, der lover rumligt mere begrænset aktivering af SGNs og dermed højere frekvens opløsning af kodning. I de senere år har direkte infrarød belysning af cochlea blevet anvendt til at fremkalde reaktioner i hørenerven ^10. Metoden kræver dog højere energier end elektrisk stimulation ^10,11 og usikkerhed om den underliggende mekanisme ^12. Her beskriver vi en metode baseret på optogenetics at stimulere SGNsmed lav intensitet blåt lys, ved hjælp af transgene mus med neuronal udtryk for channelrhodopsin 2 (CHR2) ¹³ eller virus-medieret ekspression af CHR2-varianten Catch ^14. Vi anvendte mikro-lysemitterende dioder (μLEDs) og fiber-koblede lasere til at stimulere CHR2-udtrykkende SGNs gennem en lille kunstig åbning (cochleostomy) eller runde vindue. Vi analyseret svarene ved hovedbunden optagelser af lys-fremkaldte potentialer (optogenetic auditive hjernestamme respons: oABR) eller ved mikroelektrode optagelser fra den auditive vej og sammenlignede dem med akustisk og elektrisk stimulation.

Introduction

Ifølge World Health Organization, 360 millioner mennesker verden over lider af høretab. I døve forsøgspersoner direkte elektrisk stimulation af SGNs af kreditinstitutter muliggøre åben taleforståelse i de fleste af dem ^1,2,4,5. Selvom kreditinstitutter er blevet implanteret i mere end 200.000 mennesker og derfor er den mest succesfulde neuroprosthesis, lyd kodning drevet af de nuværende cochlear implantater er begrænset. CIs er baseret på elektrisk stimulation af en række elektroder, hvor hver aktiverer en tonotopic region hørenerven således omgår den dysfunktionelle sanseorgan Corti i cochlea. Normal hørelse lyttere kan skelne mere end 2.000 frekvenser, men nutidens kreditinstitutter kun bruge op til 12-22 frekvenskanaler ^4. Dette skyldes udbredt strøm fra hver stimulerende elektrode ^7,9, aktivere et stort antal SGNs der repræsenterer mange forskellige lydfrekvenser ^8,15. Dettebegrænsning kan forbedres ved hjælp af multipolær stimulation, men på bekostning af højere strømforbrug ^16,17. Deres produktion dynamikområde for en sund intensitet er også begrænset, typisk under 6-20 dB ^4,18. Af disse grunde, forbedre hyppighed og intensitet opløsning er vigtige mål for at øge CI ydeevne til at lindre talegenkendelse i støjende omgivelser, prosodi forståelse og musik perception.

En anden mulighed for at stimulere hørenerven er optisk stimulering. Lys kan være praktisk fokuseret på at målrette en lille SGN befolkning, lover bedre fysisk indespærring, stigende frekvens opløsning og også udvide dynamikområde, hvilket resulterer i en bedre intensitet opløsning. Faktisk har cochlear stimulering med infrarødt lys vist glimrende frekvens opløsning i dyremodeller ^10,11,19. En ulempe ved denne form for stimulering er, at det kræver højere energi end elektrisk stimulering <sup> 10,11. Desuden har bekymringer om metodens evne til direkte at stimulere auditive neuroner blevet rejst ^12,20.

Som et alternativ til infrarød stimulering, vi ansætter optogenetics at gøre SGNs lysfølsomt. Optogenetics er en ny tilgang, der kombinerer genetiske og optiske teknikker til ikke-invasivt og specifikt eksportkontrol på celler med høj tidsmæssig præcision (anmeldelser ^{21- 23).} Den aktuelt mest anvendte modalitet beskæftiger ekspressionen af mikrobielle channelrhodopsin 2 (CHR2) genet af Chlamydomonas reinhardtii og varianter deraf, der koder for en let-gatede kationkanal ^24. CHR2 er en 7-transmembran-helix protein, som, når transduceres ind i neuroner og aktiveres af blåt lys, fungerer som ikke-selektive kationkanal, således depolariserende cellerne ^24-27. CHR2 er blevet godt karakteriseret ^{24,28- 31} og mange varianter er blevet udviklet til at ændre action spektret, gating og permeabilitet egenskaber ^32,33. Målet med vores arbejde er at etablere cochlear optogenetics til aktivering af det auditive vej. Vi bemærker, at optogenetic strategi for at stimulere hørenerven kræver genetisk manipulation af spiral ganglion til ekspressionen af ​​channelrhodopsin. Arbejde med mus og rotter tillader brugen af tilgængelige transgene dyr ^13,34,35, som giver udtryk for channelrhodopsin med lidt variation langs tonotopic akse og på tværs af dyr ^36. Kombination af betingede alleler ³⁷ med passende Cre-linjer giver mulighed for celle-specifikke ekspression. Genoverførsel til spiral ganglion af andre dyr kræver brug af virus, såsom adenoassocieret virus, der er en standard tilgang optogenetics ³⁸ og at vi viste sig at fungere godt i mus ^36. Genmanipulation og ekspressionen af ​​transgener, der koder for fremmede proteiner, bear risici for bivirkninger såsom IMMUne svar og / eller spredning, kompromitteret tilstand eller endda død af genetisk manipulerede celler. Med henblik på denne demonstration vi bruger transgene mus, der udtrykker CHR2 i spiral ganglion neuroner under Thy-1 promotoren ¹³ til optisk stimulere den auditive vej. Vi bemærker, at andre channelrhodopsin varianter kan anvendes til samme formål som vi påvist under anvendelse af virus-medieret overførsel af varianten griberen ¹⁴ i SGNs ^39.

Mens cochlear optogenetics kræver genetisk manipulation, det giver molekylær tuning til optimeret SGN stimulering og løfter forbedret frekvens og intensitet opløsning i forhold til elektrisk stimulation. Optogenetic stimulering af den auditive vej er yderst relevant for hørelse forskning. For eksempel, det lover fremskridt i undersøgelser af aktiviteten-afhængige forfinelse af tonotopy under udvikling, i analysen af ​​kravet om spektral integration i lyd localization og af omfanget af samspillet mellem frekvens-specifikke afferente fremskrivninger i det centrale auditive system.

Protocol

Alle eksperimenter præsenteres i dette arbejde blev udført med de etiske standarder, der er defineret af den tyske lov om beskyttelse af forsøgsdyr. The University of Göttingen bestyrelse for dyrevelfærd og dyrevelfærd kontor i staten Niedersachsen godkendt forsøgene. 1. Fremstilling af μLED-stimulator For μLEDs, først forberede μLED-stimulator. Brug blå lysdioder med 200 af 200 um aktive overflade (μLED se Materialer tabel). Solder ledningerne til μLED. De…

Representative Results

En optimal cochleostomy er kritisk og øger sandsynligheden for et vellykket eksperiment. Dette betyder, at vinduet er regelmæssige, små, og der er ingen skade af de interne cochlear strukturer. For eksempel blødning indikerer skade af stria vascularis. Et godt eksempel er vist i figur 1B. Brug CHR2-transgene mus, er CHR2 udtrykt i SGNs i cochlea (figur 1C). Blåt lys belysning, enten ved μLED eller laser, fremkalder store oABR, so…

Discussion

De beskrevne forsøg viser den optogenetic stimulering af SGNs, og kan i princippet også anvendes til at stimulere indre og / eller ydre hårceller, hvis ekspressionen af ​​opsiner. Disse eksperimenter kræver meget tålmodighed og omsorg. Som nævnt før, er de mest kritiske trin er en god cochleostomy / runde vindues indsættelse samt en passende position og orientering af lyskilden.

Der er begrænsninger med optogenetic stimulering ved brug CHR2. I vores tilfælde oABR amplitude stig…

Materials

Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe