Summary

Optogenetic Stimulering af hørenerven

Published: October 08, 2014
doi:

Summary

Cochlear implants (CIS) gør det muligt at høre ved direkte elektrisk stimulation af hørenerven. , Dårlig hyppighed og intensitet opløsning begrænser imidlertid kvaliteten af ​​at høre med kreditinstitutter. Her beskriver vi optogenetic stimulering af hørenerven i mus som en alternativ strategi for auditiv forskning og udvikling af fremtidige kreditinstitutter.

Abstract

Direkte elektrisk stimulation af spiral ganglion neuroner (SGNs) ved cochlear implantater (CIS) giver mulighed for åben taleforståelse i de fleste implanterede døve fag 1- 6. Ikke desto mindre, lyd kodning med aktuelle CIs har dårlig frekvens og intensitet opløsning på grund af en bred strøm spredes fra hver elektrode kontakt aktiverer et stort antal SGNs langs tonotopic akse cochlea 7- 9. Foreslås Optisk stimulation som et alternativ til elektrisk stimulering, der lover rumligt mere begrænset aktivering af SGNs og dermed højere frekvens opløsning af kodning. I de senere år har direkte infrarød belysning af cochlea blevet anvendt til at fremkalde reaktioner i hørenerven 10. Metoden kræver dog højere energier end elektrisk stimulation 10,11 og usikkerhed om den underliggende mekanisme 12. Her beskriver vi en metode baseret på optogenetics at stimulere SGNsmed lav intensitet blåt lys, ved hjælp af transgene mus med neuronal udtryk for channelrhodopsin 2 (CHR2) 13 eller virus-medieret ekspression af CHR2-varianten Catch 14. Vi anvendte mikro-lysemitterende dioder (μLEDs) og fiber-koblede lasere til at stimulere CHR2-udtrykkende SGNs gennem en lille kunstig åbning (cochleostomy) eller runde vindue. Vi analyseret svarene ved hovedbunden optagelser af lys-fremkaldte potentialer (optogenetic auditive hjernestamme respons: oABR) eller ved mikroelektrode optagelser fra den auditive vej og sammenlignede dem med akustisk og elektrisk stimulation.

Introduction

Ifølge World Health Organization, 360 millioner mennesker verden over lider af høretab. I døve forsøgspersoner direkte elektrisk stimulation af SGNs af kreditinstitutter muliggøre åben taleforståelse i de fleste af dem 1,2,4,5. Selvom kreditinstitutter er blevet implanteret i mere end 200.000 mennesker og derfor er den mest succesfulde neuroprosthesis, lyd kodning drevet af de nuværende cochlear implantater er begrænset. CIs er baseret på elektrisk stimulation af en række elektroder, hvor hver aktiverer en tonotopic region hørenerven således omgår den dysfunktionelle sanseorgan Corti i cochlea. Normal hørelse lyttere kan skelne mere end 2.000 frekvenser, men nutidens kreditinstitutter kun bruge op til 12-22 frekvenskanaler 4. Dette skyldes udbredt strøm fra hver stimulerende elektrode 7,9, aktivere et stort antal SGNs der repræsenterer mange forskellige lydfrekvenser 8,15. Dettebegrænsning kan forbedres ved hjælp af multipolær stimulation, men på bekostning af højere strømforbrug 16,17. Deres produktion dynamikområde for en sund intensitet er også begrænset, typisk under 6-20 dB 4,18. Af disse grunde, forbedre hyppighed og intensitet opløsning er vigtige mål for at øge CI ydeevne til at lindre talegenkendelse i støjende omgivelser, prosodi forståelse og musik perception.

En anden mulighed for at stimulere hørenerven er optisk stimulering. Lys kan være praktisk fokuseret på at målrette en lille SGN befolkning, lover bedre fysisk indespærring, stigende frekvens opløsning og også udvide dynamikområde, hvilket resulterer i en bedre intensitet opløsning. Faktisk har cochlear stimulering med infrarødt lys vist glimrende frekvens opløsning i dyremodeller 10,11,19. En ulempe ved denne form for stimulering er, at det kræver højere energi end elektrisk stimulering <sup> 10,11. Desuden har bekymringer om metodens evne til direkte at stimulere auditive neuroner blevet rejst 12,20.

Som et alternativ til infrarød stimulering, vi ansætter optogenetics at gøre SGNs lysfølsomt. Optogenetics er en ny tilgang, der kombinerer genetiske og optiske teknikker til ikke-invasivt og specifikt eksportkontrol på celler med høj tidsmæssig præcision (anmeldelser 21- 23). Den aktuelt mest anvendte modalitet beskæftiger ekspressionen af mikrobielle channelrhodopsin 2 (CHR2) genet af Chlamydomonas reinhardtii og varianter deraf, der koder for en let-gatede kationkanal 24. CHR2 er en 7-transmembran-helix protein, som, når transduceres ind i neuroner og aktiveres af blåt lys, fungerer som ikke-selektive kationkanal, således depolariserende cellerne 24-27. CHR2 er blevet godt karakteriseret 24,28- 31 og mange varianter er blevet udviklet til at ændre action spektret, gating og permeabilitet egenskaber 32,33. Målet med vores arbejde er at etablere cochlear optogenetics til aktivering af det auditive vej. Vi bemærker, at optogenetic strategi for at stimulere hørenerven kræver genetisk manipulation af spiral ganglion til ekspressionen af ​​channelrhodopsin. Arbejde med mus og rotter tillader brugen af tilgængelige transgene dyr 13,34,35, som giver udtryk for channelrhodopsin med lidt variation langs tonotopic akse og på tværs af dyr 36. Kombination af betingede alleler 37 med passende Cre-linjer giver mulighed for celle-specifikke ekspression. Genoverførsel til spiral ganglion af andre dyr kræver brug af virus, såsom adenoassocieret virus, der er en standard tilgang optogenetics 38 og at vi viste sig at fungere godt i mus 36. Genmanipulation og ekspressionen af ​​transgener, der koder for fremmede proteiner, bear risici for bivirkninger såsom IMMUne svar og / eller spredning, kompromitteret tilstand eller endda død af genetisk manipulerede celler. Med henblik på denne demonstration vi bruger transgene mus, der udtrykker CHR2 i spiral ganglion neuroner under Thy-1 promotoren 13 til optisk stimulere den auditive vej. Vi bemærker, at andre channelrhodopsin varianter kan anvendes til samme formål som vi påvist under anvendelse af virus-medieret overførsel af varianten griberen 14 i SGNs 39.

Mens cochlear optogenetics kræver genetisk manipulation, det giver molekylær tuning til optimeret SGN stimulering og løfter forbedret frekvens og intensitet opløsning i forhold til elektrisk stimulation. Optogenetic stimulering af den auditive vej er yderst relevant for hørelse forskning. For eksempel, det lover fremskridt i undersøgelser af aktiviteten-afhængige forfinelse af tonotopy under udvikling, i analysen af ​​kravet om spektral integration i lyd localization og af omfanget af samspillet mellem frekvens-specifikke afferente fremskrivninger i det centrale auditive system.

Protocol

Alle eksperimenter præsenteres i dette arbejde blev udført med de etiske standarder, der er defineret af den tyske lov om beskyttelse af forsøgsdyr. The University of Göttingen bestyrelse for dyrevelfærd og dyrevelfærd kontor i staten Niedersachsen godkendt forsøgene. 1. Fremstilling af μLED-stimulator For μLEDs, først forberede μLED-stimulator. Brug blå lysdioder med 200 af 200 um aktive overflade (μLED se Materialer tabel). Solder ledningerne til μLED. De…

Representative Results

En optimal cochleostomy er kritisk og øger sandsynligheden for et vellykket eksperiment. Dette betyder, at vinduet er regelmæssige, små, og der er ingen skade af de interne cochlear strukturer. For eksempel blødning indikerer skade af stria vascularis. Et godt eksempel er vist i figur 1B. Brug CHR2-transgene mus, er CHR2 udtrykt i SGNs i cochlea (figur 1C). Blåt lys belysning, enten ved μLED eller laser, fremkalder store oABR, so…

Discussion

De beskrevne forsøg viser den optogenetic stimulering af SGNs, og kan i princippet også anvendes til at stimulere indre og / eller ydre hårceller, hvis ekspressionen af ​​opsiner. Disse eksperimenter kræver meget tålmodighed og omsorg. Som nævnt før, er de mest kritiske trin er en god cochleostomy / runde vindues indsættelse samt en passende position og orientering af lyskilden.

Der er begrænsninger med optogenetic stimulering ved brug CHR2. I vores tilfælde oABR amplitude stig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af det tyske Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (Bernstein Fokus for Neurotechnology yde 01GQ0810, T. Moser, og MED-EL Tyskland); den tyske Research Foundation gennem Center for Nanoscale mikroskopi og Molekylær Fysiologi af hjernen (FZT 103 T. Moser) og gennem SFB889, til N. Strenzke og T. Moser).

Materials

Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

References

  1. Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
  2. Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
  3. Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
  4. Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
  5. Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
  6. Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
  7. Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
  8. Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
  9. Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
  10. Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
  11. Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
  12. Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
  13. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  14. Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  15. Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
  16. Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
  17. Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
  18. Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
  19. Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
  20. Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  22. Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
  23. Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  24. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  25. Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
  26. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
  29. Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
  30. Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
  31. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
  32. Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
  33. Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
  34. Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  35. Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
  36. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  37. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
  38. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  39. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  40. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
  41. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Play Video

Cite This Article
Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

View Video