גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Summary

שתלי שבלול (CIS) לאפשר שמיעה על ידי גירוי חשמלי ישיר של עצב השמיעה. עם זאת, תדירות עניה ורזולוציה עוצמה מגבילה את איכות שמיעה עם מדינות חבר העמים. כאן אנו מתארים גירוי optogenetic של עצב השמיעה בעכברים כאסטרטגיה חלופית למחקר שמיעתי ופיתוח CIS עתיד.

Abstract

גירוי חשמלי ישיר של תאי עצב הגנגליון ספירלה (SGNs) על ידי שתלי שבלול (CIS) מאפשר הבנת דיבור פתוחה ברוב המכריע של נושאים חירשים מושתלים ^{1 6.} יחד עם זאת, קידוד קול עם חבר העמים הנוכחיים יש תדר עני ורזולוציה עוצמה בשל התפשטות נוכחית רחבה מכל מגע אלקטרודה הפעלת מספר רב של SGNs לאורך ציר tonotopic של השבלול ^{7- 9.} גירוי אופטי מוצע כחלופה לגירוי חשמלי שמבטיחה מרחבית יותר מרותק הפעלה של SGNs ו, ומכאן, ברזולוציה תדר גבוהה יותר של קידוד. בשנים האחרונות, תאורת אינפרא אדום ישירה של השבלול נעשתה שימוש כדי לעורר תגובות בעצב השמיעה ^10. אף על פי כן היא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי ^10,11 ועדיין אי ודאות לגבי המנגנון הבסיסי ^12. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על optogenetics כדי לעורר SGNsעם אור כחול בעצימות נמוכות, תוך שימוש בעכברים מהונדסים עם ביטוי עצבי של channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ או ביטוי וירוס בתיווך של לתפוס ChR2-גרסת ^14. אנחנו השתמשנו מייקר דיודות פולטות אור (μLEDs) ולייזרים בשילוב סיבים כדי לעורר SGNs ChR2 להביע דרך פתח קטן מלאכותי (cochleostomy) או החלון העגול. אנו assayed התשובות על פי הקלטות קרקפת של פוטנציאלי אור עורר (תגובת optogenetic השמיעתית בגזע המוח: oABR) או על ידי הקלטות microelectrode מהמסלול השמיעתי והשוו אותם עם גירוי אקוסטי והחשמלי.

Introduction

על פי ארגון הבריאות העולמי, 360 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה. בנושאים חירשים, גירוי חשמלי ישיר של SGNs על ידי חבר העמים לאפשר הבנת דיבור פתוחה ברובם ^1,2,4,5. למרות שחבר עמים כבר מושתלים בלמעלה מ -200,000 בני אדם, ולכן להיות neuroprosthesis המוצלח ביותר, קידוד קול מונע על ידי שתלי השבלול הנוכחיים הוא מוגבל. חבר העמים מבוססים על גירוי חשמלי על ידי מספר מסוים של אלקטרודות שבו כל אחד מפעיל אזור tonotopic של עצב השמיעה ובכך עוקף את איבר החישה מתפקד של קורטי שבשבלול האוזן. מאזיני שמיעה נורמלים יכולים להפלות יותר מ 2,000 תדרים, אך חבר העמים של היום להשתמש רק עד 12-22 ערוצי תדר ^4. זאת בשל זרימה נוכחית נפוצה מכל אלקטרודה מגרה ^7,9, הפעלה מספר רב של SGNs המייצגים תדרי קול שונים ^8,15. זההגבלה ניתן לשפר באמצעות גירוי קוטבי אבל על חשבון צריכת חשמל גבוה יותר ^16,17. הטווח הדינמי התפוקה שלהם לעוצמת קול הוא גם מוגבל, בדרך כלל מתחת ל6-20 dB ^4,18. מסיבות אלה, תדירות שיפור ורזולוציה עוצמה הן מטרות חשובות להגדלת ביצועים של CI לשיפור זיהוי דיבור בסביבה רועשת, הבנת הפרוזודיה ותפיסת מוסיקה.

אפשרות אחרת כדי לעורר את עצב השמיעה היא גירוי אופטי. אור יכול להיות ממוקד במקום נוח למקד אוכלוסיית SGN קטנה, מבטיח כליאת מרחבית טובה יותר, להגדיל את הרזולוציה בתדר וגם הרחבת טווח דינמי, וכתוצאה מכך רזולוציה עוצמה טובה יותר. ואכן, גירוי שבלול עם אור אינפרא אדום הראה רזולוציה תדר מצוינת במודלים של בעלי חיים ^10,11,19. חסרון אחד של גירוי מסוג זה הוא שהיא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי <sup> 10,11. יתר על כן, חששות לגבי יכולתה של השיטה כדי לעורר ישירות נוירונים שמיעתיים הועלו ^12,20.

כחלופה לגירוי אינפרא אדום, אנחנו מעסיקים optogenetics כדי להבהיר SGNs רגיש לאור. Optogenetics היא גישה חדשנית המשלבת טכניקות גנטיות ואופטיות להלא פולשני ובמיוחד לשלוט תאים עם דיוק גבוה זמני (ביקורות ^{21- 23).} השיטה כיום הנפוצה ביותר בשימוש מעסיקה הביטוי של גן חיידקי channelrhodopsin 2 (ChR2) של Chlamydomonas reinhardtii וגרסותיהם, קידוד ערוץ קטיון מגודרת אור ^24. ChR2 הוא חלבון 7-הטרנסממברני סליל ש, כאשר transduced לתוך הנוירונים ומופעלים על ידי אור הכחול, פועל ערוץ קטיון כהלא סלקטיבי, ובכך depolarizing התאים ^{24- 27.} ChR2 התאפיין גם ^{ביום 31 ב24,28-} וריאנטים רבים פותחו כדי לשנות actioספקטרום n, תכונות gating וחדירות ^32,33. מטרת העבודה שלנו היא להקים optogenetics שבלול להפעלה של מסלול השמיעה. נציין כי גישת optogenetic כדי לעורר את עצב השמיעה דורשת מניפולציה גנטית של הגנגליון הספירלה לביטוי של channelrhodopsin. עבודה עם עכברים וחולדות מאפשרת שימוש בבעלי החיים מהונדסים זמינים ^13,34,35, המספקים ביטוי של channelrhodopsin עם שונות קטנות לאורך ציר tonotopic ועל פני בעלי חיים ^36. שילוב אללים מותנים ³⁷ עם Cre-קווים מתאימים מספק לביטוי תא ספציפי. העברת גנים לתוך הגנגליון הספירלה של בעלי חיים אחרים, דורשת שימוש בוירוס כגון וירוס adeno הקשורים שהיא גישה סטנדרטית בoptogenetics ³⁸ ושאנחנו הראו לעבוד גם בעכברים ^36. מניפולציה וביטוי של גנים מושתלים של קידוד חלבונים זרים סיכוני דוב לתופעות לוואי כגון אימונוגלובולינ גנטיתגובות ne ו / או הפצה, מצב התפשר ואפילו למוות של תאי מניפולציות גנטיים. לצורך הדגמה זו אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מבטא ChR2 בנוירונים הגנגליון ספירלה תחת promotor Thy-1 ¹³ כדי לעורר את המסלול השמיעתי אופטי. נציין, כי גרסאות channelrhodopsin אחרות יכולות לשמש לאותה המטרה כפי שהראינו באמצעות העברת וירוס בתיווך של לתפוס גרסת ¹⁴ לSGNs ^39.

בעוד optogenetics שבלול דורש מניפולציה גנטית, היא מציעה כוונון מולקולרי לגירוי SGN מותאם והבטחות השתפרו תדר ורזולוציה עוצמה בהשוואה לגירוי חשמלי. גירוי optogenetic של מסלול השמיעה הוא רלוונטי ביותר לדיון מחקר. לדוגמא, היא מבטיחה התקדמות במחקרים של עידון הפעילות תלויה של tonotopy במהלך פיתוח, בניתוח של הדרישה לשילוב של רוח רפאים בlocalizat קוליון ועל מידת האינטראקציה בין תחזיות מביא תדר ספציפי במערכת השמיעה המרכזית.

Protocol

כל הניסויים שהוצגו בעבודה זו נערכו עם הסטנדרטים האתיים שהוגדרו על ידי החוק הגרמני להגנה על חיות מעבדה. לוח אוניברסיטת גטינגן לרווחת בעלי החיים והמשרד לרווחת בעלי החיים של מדינת סקסוניה התחתונה אישרו את הניסויים. .1 הכנת μLED-ממריץ </…

Representative Results

Cochleostomy אופטימלי הוא קריטי ומגדיל את ההסתברות של ניסוי מוצלח. משמעות דבר היא החלון הוא רגיל, קטן, ואין שום פציעתם של מבני שבלול הפנימיים. לדוגמא, דימום מצביע על נזק של vascularis stria. דוגמא טובה מוצגת באיור 1 ב. באמצע?…

Discussion

הניסויים שתוארו להפגין גירוי optogenetic של SGNs, ויכולים, בעיקרון, לשמש גם כדי לעורר תאי שיער פנימיים ו / או חיצוניים, הניתנים הביטוי לopsins. ניסויים אלה דורשים סבלנות וטיפול הרבה. כפי שהוזכר קודם, השלבים הקריטיים ביותר הם cochleostomy / הכנסה טובה עגולה חלון, כמו גם מיקום מתאים וכיוו…

Materials

Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe