Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52069
Automatic Translation
1,2,5, 1,3, 3, 1, 1, 3, 1,2,4
1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Summary

שתלי שבלול (CIS) לאפשר שמיעה על ידי גירוי חשמלי ישיר של עצב השמיעה. עם זאת, תדירות עניה ורזולוציה עוצמה מגבילה את איכות שמיעה עם מדינות חבר העמים. כאן אנו מתארים גירוי optogenetic של עצב השמיעה בעכברים כאסטרטגיה חלופית למחקר שמיעתי ופיתוח CIS עתיד.

Abstract

גירוי חשמלי ישיר של תאי עצב הגנגליון ספירלה (SGNs) על ידי שתלי שבלול (CIS) מאפשר הבנת דיבור פתוחה ברוב המכריע של נושאים חירשים מושתלים 1 6. יחד עם זאת, קידוד קול עם חבר העמים הנוכחיים יש תדר עני ורזולוציה עוצמה בשל התפשטות נוכחית רחבה מכל מגע אלקטרודה הפעלת מספר רב של SGNs לאורך ציר tonotopic של השבלול 7- 9. גירוי אופטי מוצע כחלופה לגירוי חשמלי שמבטיחה מרחבית יותר מרותק הפעלה של SGNs ו, ומכאן, ברזולוציה תדר גבוהה יותר של קידוד. בשנים האחרונות, תאורת אינפרא אדום ישירה של השבלול נעשתה שימוש כדי לעורר תגובות בעצב השמיעה 10. אף על פי כן היא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי 10,11 ועדיין אי ודאות לגבי המנגנון הבסיסי 12. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על optogenetics כדי לעורר SGNsעם אור כחול בעצימות נמוכות, תוך שימוש בעכברים מהונדסים עם ביטוי עצבי של channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 או ביטוי וירוס בתיווך של לתפוס ChR2-גרסת 14. אנחנו השתמשנו מייקר דיודות פולטות אור (μLEDs) ולייזרים בשילוב סיבים כדי לעורר SGNs ChR2 להביע דרך פתח קטן מלאכותי (cochleostomy) או החלון העגול. אנו assayed התשובות על פי הקלטות קרקפת של פוטנציאלי אור עורר (תגובת optogenetic השמיעתית בגזע המוח: oABR) או על ידי הקלטות microelectrode מהמסלול השמיעתי והשוו אותם עם גירוי אקוסטי והחשמלי.

Introduction

על פי ארגון הבריאות העולמי, 360 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה. בנושאים חירשים, גירוי חשמלי ישיר של SGNs על ידי חבר העמים לאפשר הבנת דיבור פתוחה ברובם 1,2,4,5. למרות שחבר עמים כבר מושתלים בלמעלה מ -200,000 בני אדם, ולכן להיות neuroprosthesis המוצלח ביותר, קידוד קול מונע על ידי שתלי השבלול הנוכחיים הוא מוגבל. חבר העמים מבוססים על גירוי חשמלי על ידי מספר מסוים של אלקטרודות שבו כל אחד מפעיל אזור tonotopic של עצב השמיעה ובכך עוקף את איבר החישה מתפקד של קורטי שבשבלול האוזן. מאזיני שמיעה נורמלים יכולים להפלות יותר מ 2,000 תדרים, אך חבר העמים של היום להשתמש רק עד 12-22 ערוצי תדר 4. זאת בשל זרימה נוכחית נפוצה מכל אלקטרודה מגרה 7,9, הפעלה מספר רב של SGNs המייצגים תדרי קול שונים 8,15. זההגבלה ניתן לשפר באמצעות גירוי קוטבי אבל על חשבון צריכת חשמל גבוה יותר 16,17. הטווח הדינמי התפוקה שלהם לעוצמת קול הוא גם מוגבל, בדרך כלל מתחת ל6-20 dB 4,18. מסיבות אלה, תדירות שיפור ורזולוציה עוצמה הן מטרות חשובות להגדלת ביצועים של CI לשיפור זיהוי דיבור בסביבה רועשת, הבנת הפרוזודיה ותפיסת מוסיקה.

אפשרות אחרת כדי לעורר את עצב השמיעה היא גירוי אופטי. אור יכול להיות ממוקד במקום נוח למקד אוכלוסיית SGN קטנה, מבטיח כליאת מרחבית טובה יותר, להגדיל את הרזולוציה בתדר וגם הרחבת טווח דינמי, וכתוצאה מכך רזולוציה עוצמה טובה יותר. ואכן, גירוי שבלול עם אור אינפרא אדום הראה רזולוציה תדר מצוינת במודלים של בעלי חיים 10,11,19. חסרון אחד של גירוי מסוג זה הוא שהיא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי 12,20.

כחלופה לגירוי אינפרא אדום, אנחנו מעסיקים optogenetics כדי להבהיר SGNs רגיש לאור. Optogenetics היא גישה חדשנית המשלבת טכניקות גנטיות ואופטיות להלא פולשני ובמיוחד לשלוט תאים עם דיוק גבוה זמני (ביקורות 21- 23). השיטה כיום הנפוצה ביותר בשימוש מעסיקה הביטוי של גן חיידקי channelrhodopsin 2 (ChR2) של Chlamydomonas reinhardtii וגרסותיהם, קידוד ערוץ קטיון מגודרת אור 24. ChR2 הוא חלבון 7-הטרנסממברני סליל ש, כאשר transduced לתוך הנוירונים ומופעלים על ידי אור הכחול, פועל ערוץ קטיון כהלא סלקטיבי, ובכך depolarizing התאים 24- 27. ChR2 התאפיין גם ביום 31 ב24,28- וריאנטים רבים פותחו כדי לשנות actioספקטרום n, תכונות gating וחדירות 32,33. מטרת העבודה שלנו היא להקים optogenetics שבלול להפעלה של מסלול השמיעה. נציין כי גישת optogenetic כדי לעורר את עצב השמיעה דורשת מניפולציה גנטית של הגנגליון הספירלה לביטוי של channelrhodopsin. עבודה עם עכברים וחולדות מאפשרת שימוש בבעלי החיים מהונדסים זמינים 13,34,35, המספקים ביטוי של channelrhodopsin עם שונות קטנות לאורך ציר tonotopic ועל פני בעלי חיים 36. שילוב אללים מותנים 37 עם Cre-קווים מתאימים מספק לביטוי תא ספציפי. העברת גנים לתוך הגנגליון הספירלה של בעלי חיים אחרים, דורשת שימוש בוירוס כגון וירוס adeno הקשורים שהיא גישה סטנדרטית בoptogenetics 38 ושאנחנו הראו לעבוד גם בעכברים 36. מניפולציה וביטוי של גנים מושתלים של קידוד חלבונים זרים סיכוני דוב לתופעות לוואי כגון אימונוגלובולינ גנטיתגובות ne ו / או הפצה, מצב התפשר ואפילו למוות של תאי מניפולציות גנטיים. לצורך הדגמה זו אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מבטא ChR2 בנוירונים הגנגליון ספירלה תחת promotor Thy-1 13 כדי לעורר את המסלול השמיעתי אופטי. נציין, כי גרסאות channelrhodopsin אחרות יכולות לשמש לאותה המטרה כפי שהראינו באמצעות העברת וירוס בתיווך של לתפוס גרסת 14 לSGNs 39.

בעוד optogenetics שבלול דורש מניפולציה גנטית, היא מציעה כוונון מולקולרי לגירוי SGN מותאם והבטחות השתפרו תדר ורזולוציה עוצמה בהשוואה לגירוי חשמלי. גירוי optogenetic של מסלול השמיעה הוא רלוונטי ביותר לדיון מחקר. לדוגמא, היא מבטיחה התקדמות במחקרים של עידון הפעילות תלויה של tonotopy במהלך פיתוח, בניתוח של הדרישה לשילוב של רוח רפאים בlocalizat קוליון ועל מידת האינטראקציה בין תחזיות מביא תדר ספציפי במערכת השמיעה המרכזית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שהוצגו בעבודה זו נערכו עם הסטנדרטים האתיים שהוגדרו על ידי החוק הגרמני להגנה על חיות מעבדה. לוח אוניברסיטת גטינגן לרווחת בעלי החיים והמשרד לרווחת בעלי החיים של מדינת סקסוניה התחתונה אישרו את הניסויים.

.1 הכנת μLED-ממריץ

  1. לμLEDs, להכין μLED-ממריץ ראשון. השתמש בנוריות כחולות עם 200 ידי 200 מיקרומטר משטח פעיל (μLED, לראות לוח חומרים).
  2. חוטי הלחמה לμLED. לאחר מכן, לתמצת μLED וחיבורים באמצעות דבק אפוקסי. השאר את לילה המכשיר כדי לאפשר ריפוי אפוקסי.
  3. ליציבות מכאנית ובידוד חשמלי לנתב את החוטים דרך נימי זכוכית דקות, להשתמש נימי ורוסיליקט קוטר חיצוני 1 מ"מ ולאטום את הצומת עם אפוקסי (1D איור) באופן שהנימים יכולות להיות מותקנות על מניפולטור מכאני.
    הערה: Tכאן היא תחלופה של מה שהופך את הקפסולה עבה מספיק כדי לקבל בידוד חשמלי טוב (הימנעות חפצי גירוי), אבל דקה מספיק כדי לתת LED לנוע בחופשיות בתוך הבולה ולאתר אותו על cochleostomy. זה תרגול טוב כדי להכין LED יותר מפעם אחת.
  4. כדי לאשר את הבידוד חשמלי טוב, להכין ראשון צלחת פטרי עם 0.9% NaCl ו3 חוטי נחושת לטבול הסתיימו חשופים לתוך הנוזל. זה משמש כדי לדמות חיה עם אלקטרודות ABR. לחבר את החוטים לABR-המגבר ומשם לאוסצילוסקופ.
  5. ואז, לחבר את LED לממריץ ולטבול אותו לתוך התמיסה עד שהוא מכוסה לחלוטין. כונן LED עם קטניות (ראה שלב 3.1.1) בשעה הנוכחית המרבי המוותרות לזמן רב יותר מאשר 20 דקות ולבדוק חפצי גירוי. אם הם מופיעים, לבטל את LED ולנסות אחד חדש.

2 נוהל כירורגי

  1. השתמש 4-10 עכברי בן שבוע מהונדסים מבטא ChR2 תחת אמרגן Thy1.2 (קו 9ובואנג et al. 13). כדי לתפעל את בעלי החיים ולבצע את הניתוח, תמיד להשתמש בכלים כירורגיים נקיים ומזוהים היטב.
  2. הרדימי חיות עם זריקת ip של תערובת של אורתן (1.32 מ"ג / קילוגרם), xylazine (5 מ"ג / קילוגרם), ו0.1 מיקרוגרם / g עצירות מדוללת ב0.9% פתרון NaCl סטרילי ולמקם את העכבר על גבי צלחת חימום לשמירה על גוף טמפרטורה על 37 C °. עם מינון זה, הרדמה בדרך כלל נמשך לכל פרוטוקול הניסוי.
    1. החל 10 דקות לאחר בדיקת אינדוקציה הרדמה ראשונית לסימנים של עוררות על ידי רפלקס נסיגת כפה. במקרה של תנועות, להחיל מנות אחזקה של אורתן (.66 מ"ג / קילוגרם) ועצירות (0.05 מיקרוגרם / g) בדילול מלא ב0.9% פתרון NaCl סטרילי (בלי Xylazine). שוב לבדוק את רפלקס נסיגת הכפה ולהמשיך רק אם רפלקס נעדר.
  3. לגלח בזהירות את אזור retroauricular בהכנה של החתך. השתמש retroauricularלהתקרב כדי להגיע לבולה (חלל אוזן התיכון המכיל אוויר).
    1. עם מלקחיים מיקרו לנתח בזהירות ו / או להסיר חלק משרירי הצוואר, למשל, platysma, sternocleidomastoid, וscalenes.
    2. מצא ולחשוף את הבולה (איור 1 א). זהה את הבולה כמבנה גרמי עם צורה כדורית אופיינית עם טבעת על פני השטח הבולה המציינת את הכניסה של עור התוף (איור 1 א). לעשות חור עם קצה מחט אינסולין ממש מתחת טבעת זו. להתחיל שם, להסיר את העצם שמכסה את הבולה עם Rongeur קנס (gnawer) או microforceps באופן כזה שpromontorium של השבלול נחשף (איור 1).
  4. לcochleostomy, בעדינות לגלח את הכמוסה הגרמית כדי לפתוח חלון קטן (cochleostomy: ~ 500-800 מיקרומטר), מקפיד להשאיר על כנה את המבוך הקרומי (איור 1). בצע cochleostomy על השבלול השנילהפוך כפי שהוא רחוק מספיק מעורק stapedial ומהשיא. פתיחת הקודקוד יכול לייצר קרע של השבלול כולל בר של modiolus.
  5. לכניסת חלון עגולה של סיבים אופטיים או μLED-שתל להלמותו סקאלה, להגדיל את חלון הנישה העגולה בקפידה על ידי מגרד את הנישה הגרמית עם הקצה של סכין מנתחים חדים (מספר להב 11 הוא אפשרות טובה). השתמש תמיד בלהב או אזמל חדש. להיות מאוד זהיר לגבי עורק stapedial פועל קרוב מאוד לחלון העגול (איור 1).

.3 אופטי גירוי באמצעות שתי גישות

  1. לגירוי transcochlear, μLEDs שימוש או סיב לייזר בשילוב.
    1. הר נימי ביצוע μLED על מניפולטור מכאני ובזהירות למקם את μLED על cochleostomy. השימוש oABR, שהושרו על ידי 3-10 גירוי ארוך אלפיות שני ממקור זרם (בדרך כלל 5-40 mA ב2.7 V) בשעה 1-5 הרץ, כאמצעי כדי לייעל את המיקום ואוientation של μLED.
    2. לגירוי לייזר, להשתמש בליזר 473 ננומטר רציף גל וסיבים אופטיים 250 מיקרומטר (ראה חומרים). זוג הסיבים האופטיים למקור לייזר כחול שבאופן אידיאלי מציע שליטה אנלוגית מהירה של כוח (אחר להשתמש מכשיר acousto אופטי או תריס מהיר להגדיר הגירוי האופטי). באמצעות micromanipulator, לאתר את קצה הסיב ישירות על גבי cochleostomy ולתקן אותה לשם בעזרת מלט (גירוי transcochlear) שיניים.
  2. לגירוי intracochlear, להכניס את הסיבים דרך החלון העגול לתוך הלמותו סקאלה. לאחר מכן, השתמש 3-10 פעימות לייזר אלפיות של 10-30 mW (כוחו של פלט סיבים) בשעה 1-5 הרץ לעורר oABR. משרעת הגדולה של oABR מאפשרת הנסיין להתבונן oABR עורר על ידי גירויים יחידים באוסצילוסקופ לייעול העמדה והכיוון של הפולט (μLED או סיבים) באמצעות משרעת oABR כקריאה החוצה.
  3. ברגע שoABR הטוב הושג, לתקן את הסיבים עם cyanoacrדבק ylate או מלט שיניים ולחכות עד שהדבק הוא מוצק.
    הערה: זה נורמלי לראות כמה נוזל שיוצא מהשבלול. עם זאת, כדי למנוע בעיות עם פילמור של המלט, מומלץ לייבש את האזור באמצעות פתילות כותנה משובחות.

.4 הקלטות של oABR

  1. הכנס אלקטרודות מחט מתחת לפינה, על הקודקוד ועל הגב ליד הרגליים ולחבר אותם למגבר.
  2. להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הקודקוד ופטם מחטי subdermal. לדוגמא בשיעור של 50 kHz ומסנן (1-10,000 Hz). דמיין את פוטנציאל ההבדל באוסצילוסקופ באופן אידיאלי ליד הגדרת ההקלטה לייעול העמדה של ממריץ האופטי. השתמש במיצוע אות (50-1,000x) ולאחסן את הנתונים במחשב לניתוח במצב לא מקוון.

.5 הקלטות של פוטנציאלים אופטי עוררתי מקומי שדה

  1. מניחים את החיה לתוך מסגרת stereotactic. שימוש באחוזי מלקחייםהעצרת למשוך את העור שמעל הגולגולת ולבצע חתך חציון עם מספריים הארכה בערך מבין העיניים לנקודה שבה שרירי הצוואר לצרף לגולגולת.
    1. לשקף את העור רוחבי. חותך את קרום העצם לאורך לאורך תפר sagittal ולהסיר אותו צידה בעדינות על ידי שפשוף עצם הגולגולת החשוף עם מקלון צמר גפן.
  2. מקם לוחית מתכת מותאמת אישית על הגולגולת החשופה משאירה כ 1 מרחב מ"מ בין קצה הזנב של הצלחת ולמבדה. עם קוטר 0.7 מ"מ לקדוח בזהירות לקדוח חור לתוך העצם הקודקודית.
  3. בעדינות לדפוק בבורג בקוטר 0.85 מ"מ - לשמש כהתייחסות לפוטנציאלים שנרשמו מcolliculus הנחות (IC) - מחזיק את הבורג עם מלקחיים עוד הבורג לא מהודק. להבטיח קשר טוב בין הבורג ודורה בלי לחדור למוח. מדביק את הבורג ולוחית המתכת על גבי הגולגולת עם דבק cyanoacrylate.
  4. שחרר את nשרירי Eck בעדינות מהגולגולת. משוך את שרירי צוואר caudally למ"מ 1-2 בערך. זהה את הצומת של סינוס מעולה sagittal (SSS) וסינוס הרוחבי (TS). במידת צורך, להגביר את השקיפות של הגולגולת על ידי הרטבת העצם עם פתרון NaCl פיסיולוגי.
    1. זהה את IC בעכברים כשוכבים ישירות זנב לצומת SSS וTS. לאחר זיהוי של המיקום של IC לאט ובזהירות לבצע בערך בקידוח הארכה 0.5 מ"מ rostrally 1.5 מ"מ caudally לTS ובערך 3 מ"מ רוחבי.
    2. הימנע מכל פגיעה בSSS וTS כמו אלה ימנעו ניסוי מוצלח. כאן, לבדוק אם העצם החלול שהפך רפוי על ידי ברכות דוחפים אותו. שימוש במלקחיים לאט להרים את העצם.
  5. עם מתאם מתאים לצרף מערך רב ערוצי וheadstage על micromanipulator. כדי למנוע הרס מערך הקלטה רבת ערוצים בעת ההכנסה לתוך IC, בזהירות להסיר את הדורהעם קצה מכופף של מחט מזרק קטנה מתחיל קרוב לקצה עצם.
    1. הסר את החיה מהמסגרת stereotaxic. לתקן את לוחית המתכת על הבר להישאר קיבעון stereotaxic. מקם את הבדיקה ההקלטה על IC ולהכניס אותו תחת שליטה מיקרוסקופית כאלה שברוב הערוץ העליון הוא רק גלוי על פני השטח.
  6. להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הערוצים הבודדים של מערך ההקלטה ובורג ההתייחסות בעצמות הקודקודית, מדגם בשיעור של 32 kHz, מסנן נמוך לעבור (300 הרץ) וחנות במחשב לניתוח במצב לא מקוון.
  7. כל בעלי החיים צריכים להיות מורדמים באנושיות בסוף ההליך לפני התאוששות הרדמה בהתאם להנחיות המתת חסד רלוונטיות. שיטות מתאימות של המתת חסד עשויות לכלול נקע בצוואר הרחם או משאיפת CO 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cochleostomy אופטימלי הוא קריטי ומגדיל את ההסתברות של ניסוי מוצלח. משמעות דבר היא החלון הוא רגיל, קטן, ואין שום פציעתם של מבני שבלול הפנימיים. לדוגמא, דימום מצביע על נזק של vascularis stria. דוגמא טובה מוצגת באיור 1 ב.

באמצעות עכברי ChR2-מהונדסים, ChR2 בא לידי הביטוי בSGNs בתוך שבלול האוזן (איור 1 ג). תאורת אור כחולה, או על ידי μLED או לייזר, מעוררת oABR הגדול, שהן שונות מABR אקוסטי (aABR) במשרעת וצורת גל. oABR (איור 1F) יש לי אמפליטודות גדולות יותר מaABR (איור 1E) אבל הם דומים לABR החשמלי (eABR, איור 1G). זה יכול להתפרש כגיוס oABR וeABR משקף יותר SGNs ו / או הפעלה יותר מסונכרנת של SGNs מאשר לקול עורר aABR.

nt "> ללעורר eABR CI חשמל מכרסמים (MED-EL) הוכנס לתוך החלון העגול. השתמשנו פולסים biphasic הנוכחיים (80 μsec משך שלב, 20 μsec משך הביניים, 500 מייקרו-אמפר, שיעור גירוי הרץ 6) כדי לעורר וממוצע תגובות ל100 חזרות גירוי. גירוי עם 2 אלקטרודות מבודדת זכוכית טונגסטן (1 בתוך ומחוץ 1 של השבלול) היא גם אפשריות.

חשוב לציין כי oABR הם לא ניתן לגילוי בבעלי חיים מסוג בר, לאחר העיכוב של תעלות נתרן מתח מגודרת או לאחר הקרבת בעלי החיים 39. ניסויי בקרה אלה הופכים את החימום כמנגנון שבבסיס ABRs אופטי עורר לא סביר.

אנו מאמתים התפשטות של הפעילות דרך מסלול השמיעה על ידי הקלטות תאי במערכת השמיעה המרכזית. לדוגמא, גירוי optogenetic של השבלול שהושרו על פעילות גם עצבית במוח התיכון השמיעתי (colliculus הנחות, איור2).

איור 1
איור 1: הליך כירורגי, μLED הכנה, והקלטת oABR () ביתור שרירי הצוואר חושף את הבולה;. להתבונן על צורתו האופיינית הכדורית והטבעת שבו עור התוף מחדיר לתוך העצם, אשר יכול לשמש כנקודת ציון. סרגל קנה מידה של 1 מ"מ. פתיחה (ב) לבולה תחשוף promontorium. Cochleostomy בוצע על תור השבלול השני. אתרים נוספים מצוינים, ביניהם עורק stapedial. סרגל קנה מידה של 1 מ"מ. ביטוי (C) ChR2-YFP בSGNs. Immunolabeling לGFP (ירוק) וphalloidin-AF-568 (אדום). סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. (ד) μLED, קווי, אך עדיין לא תעלו לתוך הנימים. סרגל קנה מידה של 1 מ"מ. דוגמא מייצגת (E), (F), ו( G)ים של aABR (לחץ, 20 הרץ, 80 dB), oABR (2 אלפיות שני, 1 הרץ, 4 mW / 2 מ"מ) הנגרם על ידי גירוי LED וeABR (900 מייקרו-אמפר, 20 הרץ) באמצעות אלקטרודות טונגסטן בידוד זכוכית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. פוטנציאלי משפט יחיד מקומיים שדה שנרשמו מIC לאחר אקוסטי, optogenetic, וגירוי חשמלי שבלול ייצוג סכמטי של חללית הקלטה רבת ערוצים מצויר בצד השמאל של כל לוח. () מצגות יחידה של צלילים טהורים עם תדרים שונים (80 dB SPL) להוביל לשיפוע הבחנה של פעילות עם תדרים נמוכים שמוביל להפעלה שטחית יותר מאשר תדרים גבוהים יותר. תצפית זו משמשת לevaluatהחדרה מוצלחת דואר של מערך הקלטה רבת ערוצים לIC. (ב) גירוי אופטי (24 mW, 6 משך אלפיות שני) וגירוי (C) חשמל (biphasic, 80 משך μsec שלב, 20 μsec משך הביניים, 500 מייקרו-אמפר) הוביל גם לפוטנציאלים בתחום מקומיים בIC לעתים קרובות מציג אמפליטודות תגובה דומה. מנח כירורגי כוללים שני IC, ​​כמו גם חלק של המוח הקטן (ד). סרגל קנה מידה 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הניסויים שתוארו להפגין גירוי optogenetic של SGNs, ויכולים, בעיקרון, לשמש גם כדי לעורר תאי שיער פנימיים ו / או חיצוניים, הניתנים הביטוי לopsins. ניסויים אלה דורשים סבלנות וטיפול הרבה. כפי שהוזכר קודם, השלבים הקריטיים ביותר הם cochleostomy / הכנסה טובה עגולה חלון, כמו גם מיקום מתאים וכיוון של מקור האור.

יש מגבלות עם גירוי optogenetic בעת שימוש ChR2. במקרה העליות משרעת oABR שלנו עם עוצמת אור ומשך דופק אבל יורד כאשר קצב הגירוי מגביר 15. חביון התגובה תלוי גם עוצמת אור, יורד כאשר עוצמת עליות הגירוי. אנו מציעים כי התגובות הללו הן התוצאה של קינטיקה של ChR2 ומספר הערוצים הביעו בSGNs. בנוסף, ChR2 יכול לגרום לקוצים נוספים, כישלונות וסיכום פוטנציאל הממברנה בגבוה ספייקשיעורים 27,40. היו מאמצים מתמשכים על מנת להתגבר על המגבלות האלה 32,33. יש לנו לאחרונה דיווח על השימוש בביטוי וירוס בתיווך של לתפוס ChR2-גרסת 14 בSGNs, אשר הקטין את דרישת האור ואיפשר להתחדד לשיעורים גבוהים יותר של גירוי 39. לאחרונה המעבדה בוידן דיווחה על כרונוס, channelrhodopsin עם קינטיקה מהירה יותר ורגישות לאור גבוהה 41.

אנו מציעים כי גירוי optogenetic של מסלול השמיעה יכול לתרום למחקר שמיעתי ו, בעתיד, לתותבות שבלול. אנחנו לוקחים בחשבון שזה יכול לשפר את זיהוי דיבור ותפיסה של הפרוזודיה ומוסיקה. תרגום של גישה זו למרפאה דורש הרבה התפתחויות קריטיות כגון אופטימיזציה של channelrhodopsins, הפיתוח של טכנולוגיית גירוי אופטית רבת ערוצים לשתל שבלול אופטי, כמו גם ההפגנה של בטיחות ביולוגית לstimula האופטיtion ומניפולציה גנטית לטווח ארוך של SGNs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (ברנשטיין הפוקוס לNeurotechnology להעניק 01GQ0810, לט מוזר, וMED-EL גרמניה); קרן המחקר הגרמנית באמצעות המרכז עבור ננו מיקרוסקופית ופיזיולוגיה המולקולרית של המוח (FZT 103, ט מוזר) ובאמצעות SFB889, לנ 'Strenzke וט' מוזר).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
  2. Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
  3. Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
  4. Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
  5. Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
  6. Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
  7. Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
  8. Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
  9. Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
  10. Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
  11. Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
  12. Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
  13. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  14. Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  15. Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
  16. Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
  17. Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
  18. Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
  19. Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
  20. Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  22. Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
  23. Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  24. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  25. Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
  26. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
  29. Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
  30. Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
  31. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
  32. Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
  33. Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
  34. Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  35. Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
  36. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  37. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
  38. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  39. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  40. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
  41. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Tags

Neuroscience גיליון 92 שמיעה שתל שבלול optogenetics channelrhodopsin גירוי אופטי חירשות
גירוי optogenetic של עצב השמיעה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing,… More

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter