Cochleaimplantat (CI) mulig høre ved direkte elektrisk stimulering av hørselsnerven. Men dårlig frekvens og intensitet oppløsning begrenser kvaliteten på høring med CIS. Her beskriver vi optogenetic stimulering av hørselsnerven i mus som en alternativ strategi for auditiv forskning og utvikle fremtidige CIS.
Direkte elektrisk stimulering av spiral ganglion nevroner (SGNs) av cochleaimplantat (CIS) gjør det mulig åpen tale forståelse i de fleste implanterte døve fag 1- seks. Ikke desto mindre lyd koding med gjeldende CI'er har dårlig frekvens og intensitet oppløsning på grunn av bred strøm spredning fra hver elektrodekontakt aktivere et stort antall SGNs langs tonotopic aksen av cochlea 7- 9. Optisk stimulering er foreslått som et alternativ til elektrisk stimulering som løfter romlig mer begrenset aktivering av SGNs og dermed høyere frekvens oppløsning av koding. I de senere årene har direkte infrarød belysning av cochlea blitt brukt til å fremkalle reaksjoner i hørselsnerven 10. Likevel det krever høyere energier enn elektrisk stimulering 10,11 og det er fortsatt usikkerhet om den underliggende mekanismen 12. Her beskriver vi en metode basert på optogenetics å stimulere SGNsmed lav intensitet blått lys, ved hjelp av transgene mus med nevronale uttrykk for channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 eller virus-mediert uttrykk for ChR2-variant Catch 14. Vi brukte micro-light emitting diodes (μLEDs) og fiber kombinert lasere for å stimulere ChR2-uttrykke SGNs gjennom en liten kunstig åpning (cochleostomy) eller det runde vinduet. Vi analysert svarene ved hodebunnen opptak av lys-fremkalt respons (optogenetic auditive hjernestammen respons: oABR) eller ved microelectrode opptak fra hørselsbanen og sammenlignet dem med akustisk og elektrisk stimulering.
Ifølge Verdens helseorganisasjon, 360 millioner mennesker verden over lider av hørselstap. I døve fag, direkte elektrisk stimulering av SGNs fra IT aktivere åpen tale forståelse i de fleste av dem 1,2,4,5. Selv om CI'er har blitt implantert i mer enn 200.000 mennesker, derfor er det mest vellykkede neuroprosthesis, lyd koding drevet av dagens cochleaimplantat er begrenset. SUS er basert på elektrisk stimulering av et visst antall elektroder hvor hver enkelt aktiverer en tonotopic regionen i hørselsnerven og dermed omgå dysfunksjonell sensoriske organ Corti i sneglehuset. Normal hørsel lyttere kan diskriminere mer enn 2000 frekvenser, men dagens CI'er bruker bare opp til 12-22 frekvenskanaler fire. Dette er på grunn av utstrakt strømgjennomgang fra hver stimulerende elektrode 7,9, aktivere et stort antall SGNs som representerer mange forskjellige lydfrekvenser 8,15. DetteBegrensningen kan forbedres ved hjelp av multipolar stimulering, men på bekostning av høyere strømforbruk 16,17. Deres produksjon dynamisk område for lyd intensitet er også begrenset, vanligvis under 6-20 dB 4,18. For disse grunner, bedre frekvens og intensitet oppløsning er viktige mål for å øke CI ytelse for å bøte talegjenkjenning i støyende omgivelser, prosodi forståelse og musikk persepsjon.
Et annet alternativ for å stimulere hørselsnerven er optisk stimulering. Lys kan være beleilig fokusert for å målrette en liten SGN befolkning, lovende bedre romlig innesperring, økende frekvens oppløsning og også utvide dynamisk område, noe som resulterer i en bedre intensitet oppløsning. Faktisk har cochlea stimulering med infrarødt lys vist utmerket frekvensoppløsning i dyremodeller 10,11,19. En ulempe ved denne type stimulering er at den krever høyere energier enn elektrisk stimulering <sup> 10,11. Videre har bekymringer om muligheten av metoden stimulere direkte auditive nevroner blitt reist 12,20.
Som et alternativ til infrarød stimulering, ansetter vi optogenetics å gjengi SGNs lys sensitive. Optogenetics er en ny tilnærming som kombinerer genetiske og optiske teknikker til ikke-invasiv og spesielt kontrollere celler med høy tidsmessig presisjon (anmeldelser 21- 23). Den for tiden mest brukte modalitet anvender uttrykket av den mikrobielle channelrhodopsin 2 (ChR2) genet av Chlamydomonas reinhardtii og varianter derav, som koder for et lys-gated kation kanalen 24. ChR2 er en syv-transmembran-helix protein som, når det omformet til neuroner og aktiveres av blått lys, virker som ikke-selektivt kation-kanal, og dermed depolariserende cellene 24- 27. ChR2 har blitt godt karakterisert 24,28- 31 og mange varianter er blitt utviklet for å modifisere Action spekteret, gating og permeabilitet egenskaper 32,33. Målet med vårt arbeid er å etablere cochlea optogenetics for aktivering av hørselsbanen. Vi merker oss at den optogenetic tilnærming for å stimulere hørselsnerven krever genetisk manipulering av spiral ganglion for uttrykket av channelrhodopsin. Arbeide med mus og rotter tillater bruk av tilgjengelige transgene dyr 13,34,35, som gir uttrykk for channelrhodopsin med liten variasjon langs tonotopic akse og på tvers av 36 dyr. Kombinere betingede alleler 37 med passende Cre-linjer gir for celle-spesifikke uttrykk. Genoverføring inn i spiral ganglion av andre dyr krever bruk av virus som adenoassosiert virus som er en standard tilnærming i optogenetics 38 og at vi viste seg å fungere godt i mus 36. Genetisk manipulering og uttrykk av transgener som koder fremmede proteiner bjørn risiko for bivirkninger som immungne svar og / eller spredning, kompromittert tilstand eller død av genetisk manipulerte celler. For hensikten med denne demonstrasjonen bruker vi transgene mus som uttrykker ChR2 i spiral ganglion nevroner under Thy-en promotor 13 til optisk stimulere hørselsbanen. Vi merker oss at andre channelrhodopsin varianter kan brukes for samme formål som vi demonstrert ved hjelp av virus-mediert overføring av variant fange 14 inn SGNs 39.
Mens cochlea optogenetics krever genetisk manipulasjon, og tilbyr molekylær tuning for optimalisert SGN stimulering og løfter forbedret frekvens og intensitet oppløsning sammenlignet med elektrisk stimulering. Optogenetic stimulering av hørselsbanen er svært relevant for å høre forskning. For eksempel, lover den fremskritt i studier av aktiviteten-avhengige foredling av tonotopy under utvikling, i analysen av kravet for spektral integrering i lyd localization og av omfanget av samspillet mellom frekvensspesifikke afferente anslag i det sentrale auditive system.
De beskrevne eksperimenter demonstrerer optogenetic stimulering av SGNs, og kan i prinsippet også brukes til å stimulere indre og / eller ytre hårcellene, forutsatt at ekspresjon av opsins. Disse eksperimentene krever mye tålmodighet og omsorg. Som nevnt før, de mest kritiske trinn er en god cochleostomy / runde vindu innsetting så vel som en passende posisjon og orientering av lyskilden.
Det er begrensninger med optogenetic stimulering når du bruker ChR2. I vårt tilfelle oABR amplit…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den tyske føderale departementet for utdanning og forskning (Bernstein Fokus for Nevro gi 01GQ0810, til T. Moser, og MED-EL Tyskland); den tyske Research Foundation gjennom Senter for nanoskala Mikros og molekylær fysiologi av hjernen (FZT 103, T. Moser) og gjennom SFB889, til N. Strenzke og T. Moser).
Urethane | Sigma Aldrich | U2500-100G | Anesthetic |
Xylazine HCl | RXV | Sedative and analgesic | |
Buprenorphine | Reckitt Benckiser | Analgesic | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue |
Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Only to be used to hold soft tissue |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | To open the skin and help with the muscle dissection |
Lempert Rongeurs | Fine Science Tools | 16004-16 | They are very useful to easily remove the bone from the bulla |
473-nm laser | Changchun New Industries | MLL-III473 | 100 mW solid state 473 nm laser |
Laser driver | Changchun New Industries | DPSSL MLL 100 mW | TTL operated laser driver |
250 µm optical fiber | Any comercial ; e.g. Thorlabs | M42L05 | |
Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | PCAOM VIS | Control the amount of light coupled into the fiber from the laser |
Controller for Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | 160T1-8SAR-24-0.8 | Control the acousto-optic modulator |
Solo2 laser power & energy meter | Gentec-EO | Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser | |
Blue µLED | Cree | C470UT200 | It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough |
TDT System | Tucker-Davis Technologies | RZ6-A-P1 | It can be used any system for stimulus generation presentation and data acquisition |
Single-shank, 16-channel silicon probe | Neuronexus | a1x16-5mm-100-177-CM16LP | These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use |
Omnidrill | World Precision Instruments | 503598 | Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation |
Micro Drill Steel Burrs | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19007-07 | |
Self tapping bone screw | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19010-10 | Reference screw |
Micromanipulator | any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis | Positioning of recording probe |